Genes associados a estresses bi ticos e abi ticos em plantas cultivadas
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Genes Associados a Estresses Bióticos e Abióticos em Plantas Cultivadas. Drª Ana Maria Benko-Iseppon Universidade Federal de Pernambuco Depto. De Genética, Lab. de Genética e Biotecnologia Vegetal. Onde tudo começou. Pós-Doutorado

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Presentation Transcript


Genes associados a estresses bi ticos e abi ticos em plantas cultivadas

Genes Associados a Estresses Bióticos e Abióticos em Plantas Cultivadas

Drª Ana Maria Benko-IsepponUniversidade Federal de PernambucoDepto. De Genética, Lab. de Genética e Biotecnologia Vegetal


Genes associados a estresses bi ticos e abi ticos em plantas cultivadas

Onde tudo começou...

Pós-Doutorado

CAPESFrankfurt UniversityJohann Wolfgang Goethe UniversitätJan.-Dec. 1999


Genes associados a estresses bi ticos e abi ticos em plantas cultivadas

Resistência a Doenças

  • Plantas & Animais

  • Importância para o melhoramento

  • Tipos de Resistência

    • Sistêmica (genes PR)

      • Conservados

      • Herança quantitativa

  • Específica (genes R)

Benko-Iseppon AM

UFPE, Depto. de Genética

Genética e Biotecnologia Vegetal


Genes associados a estresses bi ticos e abi ticos em plantas cultivadas

Principais Objetos de Estudo:1. Cicer Arietinum (grão-de-bico)2. Vigna unguiculata (feijão verde)

  • Culturas vegetais importantes para áreas de semi-árido

  • Nível diplóide: 2n=16 e 2n=22

  • Auto-fecundação, gerações curtas, genoma relativamente pequeno (0,5 x 109)

  • Colheitas podem ser afetadas severamente (perdas de até 80%) pelo ataque de patógenos (fungos e vírus )


Genes associados a estresses bi ticos e abi ticos em plantas cultivadas

Genoma Expresso (Transcriptoma):

SUCEST Sugarcane EST Project

Cana:

Desafio

&

Oportunidade


Forest eucalyptus est genome project

Genoma Expresso (Transcriptoma):

FOREST Eucalyptus EST Genome Project

Ana

Objetivo:

Identificar 15.000 genes através do seqüenciamento de cerca de 100.000 ESTs (20 labs.) obtidas a partir de bibliotecas de diferentes tecidos, incluindo plântulas, folhas, raízes, caule e madeira.


A arquitetura da resist ncia

Sequências similares conferem resistência a diversos patógenos como vírus, bactérias, fungos and nematóides.

A maioria dos genes de resistência (genes R) pertence a famílias multigênicas.

Genes R são altamente polimórficos e apresentam diversas especificidades de reconhecimento.

Grupos vegetais diferentes apresentam genes R com domínios e padrões (motifs) com significativa conservação.

Clusters de genes R parecem evoluir mais rapidamente do que outras regiões do genoma.

A Arquitetura da Resistência


Modelo da intera o gene a gene

Modelo da Interação Gene-a-Gene

Patógeno

Interação

R & avr

Produto

avr

Elicitores

Gene R

HR

Morte Celular

SA

JA

Etileno

Genes PR

Calosis

Etileno

Genes PR

Fitoalexinas

SA


Genes associados a estresses bi ticos e abi ticos em plantas cultivadas

Interação Hospedeiro-Patógeno

Avr & R

Nematóide

Fungo

Bactéria

After Bonas & Lahaye Curr. Opn. Microbiol. 2002

Transferabilidade & Mudança de Função

Diversas localizações subcelulares


Genes associados a estresses bi ticos e abi ticos em plantas cultivadas

Estrutura de Genes R

A

Ser/Thre Kinase

B

LRR-Ser/Thre-Kinase

C

NBS-LRR

TIR NBS-LRR

D

E

LRR

Nucleot. Binding Site

Toll-Interleukin Dom.

Transmembrane Dom.

Leucine Rich Repeats

Ser.-Threon. Kinase

Domínios conservados de genes R


Genes associados a estresses bi ticos e abi ticos em plantas cultivadas

TIR (Toll Interleukin)-Like Resistance Gene

Toll-like signalling in

Drosophila

Mammals

Plants

Semelhanças entre plantas e animais

After Takken & Joosten Europ. J. Plant Pathol. 2000

LRR

NBS

TIR

Ankyrin repeats

Kinase

Immunoglobulin domain

Transcription Factor


Genes associados a estresses bi ticos e abi ticos em plantas cultivadas

Arabidopsis thaliana

  • Estima-se que contenha aproximadamente 220 genes que codificam proteínas com o domínios NBS (em 21 clusters genômicos e 14 loci)

  • Seqüências TIR – ainda mais abundantes

  • Cerca de 600 seqüências não-TIR


Genes associados a estresses bi ticos e abi ticos em plantas cultivadas

Estratégias de Amplificação Diferencial

(RGAs = Resistance Gene Analogs)Isolamento de genes da classe NBS

Kinase-1a and Transmembrane Region: 550 Bp

H2N

COOH

Kinase-1a and Kinase-3a: 340 Bp

Nucleotide-binding Site (NBS)

(Kinase-1a, Kinase-2, and Kinase-3a Domain)

PutativeTransmembrane Region

Leucine-rich Repeats


Genes associados a estresses bi ticos e abi ticos em plantas cultivadas

Obtenção e Identificação de RGAs

Amplificação por PCR

Clonagem dos Produtos de PCR

Mapeamento de Restrição

Seqüenciamento Automático

Análise de ORF (Open Reading Frame)

Anotação e Identificação do Gene


Genes associados a estresses bi ticos e abi ticos em plantas cultivadas

Isolamento de RGAs (Resistance Gene Analogs): Domínio Kinase (1a) & Região Transmembrana

Questões em Aberto sobre Genes R

Macroevolução

Evolução em plantas silvestres

Comportamento em lenhosas e grupos primitivos


Genes associados a estresses bi ticos e abi ticos em plantas cultivadas

Isolamento de RGAs (Resistance Gene Analogs): Domínio Kinase 1a & Kinase 3a


Genes associados a estresses bi ticos e abi ticos em plantas cultivadas

Técnica de AFLP e SSAP

Restriction of Genomic DNA

Ligation of Adaptors

Pre-Amplification with Adaptor Primer

AFLP

(Amplified Fragment Length Polymorphism)

SSAP

(Sequence-specific Amplified Polymorphism)

Selective Amplification

Eco+2

GRP1

32

32

Mse+3

Mse0

P

P

GRP2

Eco+2

32

32

Mse+3

Mse0

P

P


Genes associados a estresses bi ticos e abi ticos em plantas cultivadas

Mapeamento Genético

Cruzamento Interespecífico

Cicer arietinum X C. reticulatum

ICC4959 PI489777

(Resistant) (Susceptible)

F7 to F8 Recombinant Inbred Lines

131 Individuals

Fusarium oxysporum fsp. ciceri

Resistance LociLinkage Group 2


Genes associados a estresses bi ticos e abi ticos em plantas cultivadas

Marcadores Moleculares Usados

  • DAF - DNA Amplification Fingerprinting

  • RAPD - Random Amplified Polymorphic DNA

  • STMS - Sequence Tagged Microsatellite Markers

  • AFLP - Amplification Fragment Length Polymorphism

  • SCAR - Sequence Characterized Amplified Regions

  • ISSR - Inter Simple Sequence Repeats

  • RGA - Resistance Gene Analogs

  • SSAP - Sequence-Specific Amplified Polymorphism


Genes associados a estresses bi ticos e abi ticos em plantas cultivadas

Mapa Genético Gerado

8 grandes + 8 pequenos grupos de ligação

  • Características:

    • 412 marcadores em 8 grupos de ligação

    • Tamanho total 2.330 cM

    • Distância Média entre os marcadores: 6,7 cM

    • Relação Média Kb / cM = 322 (genoma = 750 Mb)

    • “Ilhas” ou “clusters” com acúmulo de marcadores


Genes associados a estresses bi ticos e abi ticos em plantas cultivadas

Mapeamento Fino

Análise Segregante de Bulks

“Caçando um Gene Específico”

Respectivamente 12 Linhagens:

Bulk Resistente:

R14, R18, R22, R29, R53, R56, R72, R74, R87, R88, R94, R96

Bulk Suscetível:

S11, S25, S32, S37, S40, S49, S55, S61, S63, S64, S65, S77

Primeira Seleção de Primers:

432 Primers Testados em 2 Semanas

174 Primers Polimórficos

Análise nos parentais e em sete indivíduos R e S


Genes associados a estresses bi ticos e abi ticos em plantas cultivadas

Última Seleção de Marcadores

R1 – R7

S1 – S7

PR

PS

A

PR=

Parental Resistente

PS=

Parental suscetível

R=

indivíduo resistente

S=

indivíduo suscetível

32 Primers testados

24 Ligados (no LG 2)

18 seqüenciados

500 kb

B

500 kb


Genes associados a estresses bi ticos e abi ticos em plantas cultivadas

Mapeamento Fino do Gene Foc 4

Região de resistência

ao redor dos

genes

Foc 4 e Foc 5


Genes associados a estresses bi ticos e abi ticos em plantas cultivadas

Identidade de alguns Marcadores Seqüenciados

  • OP-P08-1 840 bp = N-Polyacetil-Benzoyltransferase (proteína reguladora da síntese de fitoalexinas).

  • OP-M20-1/3  1103 bp = Disease resistance N (Nicotiana)-like protein from Arabidopsis thaliana(E-value 0.0)

  • OP-P15-3/1 577 bp = Hypersensitivity response related gene 201 isolog from Arabidopsis thaliana(2e-28)

  • P-U17-1  1014 bp = Pathogenic related thaumatin-like protein precursor from Prunus avium(1e-10)

  • OP-M20-1/2  1045 bp = MUTS2 DNA mismatch repair protein from Arabidopsis thaliana(7e-09)

  • OP-P06-1 784 bp = Retrotransposon-like gag-protein sequence from Nicotiana tabacum putatively linked to black root rot resistance in tobacco(8e-04)


Genes associados a estresses bi ticos e abi ticos em plantas cultivadas

Sintenia e Colinearidade


Genes associados a estresses bi ticos e abi ticos em plantas cultivadas

Projeto Genoma da Cana

A Estratégia

Planejado:

100.000 ESTs (reads)

30.000 clusters

25 Bibliotecas

25 grupos de anotação

Realizado:

291.904 ESTs(reads)

43.141 clusters

26 Bibliotecas

49 grupos de anotação


Genes associados a estresses bi ticos e abi ticos em plantas cultivadas

Hierarquia de Seleção, Anotação e Análise de ESTs

Banco de Dados do SUCEST

BLASTx, tBLASTn, etc.

GenBank

Busca por homologia

e por palavras-chave

Seqüências Completas & Melhores Alinhamentos

e-20 ou menos

Tradução/CodonUsage

Conteúdo AT-GC

Clone Manager

Busca Domínios

CD-Search/RPS-BLAST

Análise de ORFs

ORF-Finder

Avaliação de Qualidade e Fenotipagem

Alinhamentos Múltiplos

Clustal W

Localização Subcelular

Programa TargetP

Análise de Expressão

“Clusterização Hierárquica”

Vias

Metabólicas

Análises Filogenéticas e Fenéticas


Genes associados a estresses bi ticos e abi ticos em plantas cultivadas

Genes R em Cana-de-Açúcar


Genes associados a estresses bi ticos e abi ticos em plantas cultivadas

Onde os Genes de Resistência são Expressos na Cana?

Meristema Apical (2)

AM 11.1%

Raiz (3 )

Raiz-Caule (3)

RT 7.1%

RZ 13.1%

Brotos foliares (8 )

LR 6.7%

AD 6.5 %

Gluconacetobacter

ST 6.1%

Flores (8 )

FL 27.1%

Internós (2 )

Sementes Germinantes (2 )

SD 5.5%

NR 0.2%

LB 5.3%

Gema Lateral (2)

SB 4.6%

HR 2.6%

LV 2.2%

CL 1.8%

Calo estresse temp/luz (1)

Colmo (1)

Herbaspirilum

Folhas adultas (1 )


Genes associados a estresses bi ticos e abi ticos em plantas cultivadas

Alinhamento Múltiplo com Clustal X

Gene CHS1

Seqüências de aminoácidos


Genes associados a estresses bi ticos e abi ticos em plantas cultivadas

Geração de Dendrogramas

Diferentes genes

Alguns com poucas seqüências completas nos bancos de dados

Seqüências

Filogenetica-mente

Informativas

Níveis macro e microevolutivo

Plantas

Leveduras

Fungos

Animais


Genes associados a estresses bi ticos e abi ticos em plantas cultivadas

Geração de Dendrogramas

Pressão de seleção do patógeno

Evolução de caráter adaptativo

Variações alélicas até análogos na própria cana


Genes associados a estresses bi ticos e abi ticos em plantas cultivadas

Leaf Roll

I

II

Root

Apical Meristem

III

IV

Root to shoot

V

Flowers


Genes associados a estresses bi ticos e abi ticos em plantas cultivadas

Genes R Expressos em Eucalipto

FOREST

210clusters

GMB, 2005 (Vol. Especial Genoma Eucalipto)


Genes associados a estresses bi ticos e abi ticos em plantas cultivadas

Salinidade & Seca

Solo Salino

Espaço

Intracelular

Pelo

radicular

Direção da Água

Direção da Água

Quais genes definem a resistência à salinidade em plantas?

Concentração

Relativa de Sais


Genes associados a estresses bi ticos e abi ticos em plantas cultivadas

Resistência à Salinidade

Herança  Multifatorial, Poligênica...

Evolução

Genes importantes diferem entre entidades taxonômicas próximas

Convergência baseada em caracteres adaptativos

super expressão do gene DREB1A(Dehydration Response Element-Binding protein 1A)

AtNHX1

Grupo Trocadores Na+/H+

Vacuolização

Tolerância definida por 1 gene?


Genes associados a estresses bi ticos e abi ticos em plantas cultivadas

Seca

Frio

53

277

7.000 genes analisados

Pico de ativação 2 a 2,5 h após adição do elicitor

Expressao aumentada 5x ou mais

8

128

21

22

2

119

51

Taji T, Seki M, Satou M, Sakurai T, Kobayashi M, Ishiyama K, Narusaka Y, Narusaka M, Zhu JK, Shinozaki K (2004) Comparative genomics in salt tolerance between Arabidopsis and Arabidopsis-related halophyte salt cress using Arabidopsis microarray. Plant Physiol 135: 1697–1709.

Seki, M. et al. (2002). Monitoring the expression profiles of 7000 Arabidopsis genes under drought, cold and high salinity stresses using a full length cDNA microarray. The Plant Journal. 31: 279-292

Salinidade

194


Genes associados a estresses bi ticos e abi ticos em plantas cultivadas

Salinidade e Seca – Principais Genes


Genes associados a estresses bi ticos e abi ticos em plantas cultivadas

Trocador H+/Ca2+

Plantas Superiores

Fungos


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MIP (Proteínas Intrínsecas de Membrana) em Eucalyptus

Atuam como facilitadoras do transporte passivo de pequenos solutos através dos sistemas de membranas.

Proteínas intrínsecas de membrana plasmática, do tonoplasto, tipo nodulina-26 e pequenas proteínas básicas de membrana

Motivos NPA e domínios transmembrana variáveis

(4 a 8 repetições).


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MIPDifferential Display

Padrão de expressão das 36 seqüências analisadas: Alta expressão de EUC-04 em ST-2 e EUC-07 em RT-06.Clusters EUC-28, EUC-33 e EUC-35 se expressam respectiva e exclusivamente nas bibliotecas RT6, LV2 e SL5 (tecidos são raízes resistente a geada, folhas deficientes em fósforo e boro e plântulas estioladas).


Genes associados a estresses bi ticos e abi ticos em plantas cultivadas

Proteínas encontradas nas membranas celulares desde procariotos até eucariotos, aumentando a permeabilidade para água e/ou glicerol.

Aquaporinas em Cana-de-Açúcar

PIP

Análise do padrão de expressão de aquaporinas: 47 clusters e 887 reads) de cana-de-açúcar. Abreviações: RT= Raiz; FL= Flor.

TIP

NIP

Peso molecular e ponto isoelétrico para os representantes das diferentes subfamílias de aquaporinas em A. thaliana, Z. mays, O. sativa e S. officinarum.

Subfamília SIP = área delimitada. Programa JvirGel.

SIP


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Publicações

  • SILVA, A. B., NOGUEIRA, A.C.B., SILVA, R.R.M., SILVA, L.C.B., SOARES-CAVALCANTI, N.M., BENKO-ISEPPON, A.M. (2005). In silico survey of resistance (R) genes in Eucalyptus transcriptome. Genetics and Molecular Biology 28: 562-574.

  • RAKSHIT, S., WINTER, P., BENKO-ISEPPON, A.M.; MUEHLBAUER, F.J., KAHL, G. (2003). DAF marker tightly linked to a major locus for Aschochyta blight resistance in chickpea (Cicer arietinum L.). Euphytica 132: 23-30.

  • BENKO-ISEPPON, A. M.; WINTER, P., HÜTTEL, B., MUEHLBAUER, F. J., KAHL, G. (2003). Molecular markers closely linked to fusarium resistance genes in chickpea show significant alignments to pathogenesis-related genes located on Arabidopsis chromosomes 5 and 1. Theoretical and Applied Genetics 107: 379-386.

  • WINTER, P., BENKO-ISEPPON, A. M.; HÜTTEL, B., PFAFF, T., KAHL, G., MUEHLBAUER, F. J. (2000). A linkage map of the chickpea (Cicer arietinum L.) genome based on recombinant inbred lines from a C. arietinum x C. reticulatum cross: localization of resistance genes for Fusarium wilt races 4 and 5. Theoretical and Applied Genetics 101: 1155-1163.

  • WINTER, P., STAGGINUS, C., HÜTTEL, B., PFAFF, T., BENKO-ISEPPON, A. M.; RAKSHIT, S., KAHL, G. (2004). Architecture and Maps of the Chickpea Genome: A Basis for Understanding Plant-Rhizobium Interaction. In:Symbiotic Nitrogen Fixation: Prospects for Enhanced Application in Tropical Agriculture.1st Ed., New Hamshire : Science Publishers USA, 1: 286-293.

  • BENKO-ISEPPON, A.M.; SOARES-CAVALCANTI, N.M., NOGUEIRA, A.C.W., SILVA, L.C.B., SILVA, R.R.M., ALMEIDA, P.M.L., BRUNELLI, K.R., KIDO, L.M.H., KIDO, E.A. (2005). Genes associados a estresses bióticos e abióticos em feijão-caupi [Vigna unguiculata (L.) Walp.] e outras angiospermas. In: Estresses Ambientais: danos e/ou benefícios para as plantas. 1ª Ed. Recife: Sociedade Brasileira de Fisiologia Vegetal, v.1: 350-359.


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  • Agradecimentos

  • CAPES/MEC

  • FACEPE

  • CNPq

  • FAPESP & SUCEST & FOREST

  • Johann Wolfgang Goethe Universität Frankfurt, Germany (Günter Kahl / Peter Winter)

  • Volkswagen Foundation

  • RENORBIO/BNB

  • Universidade Federal de Pernambuco, Recife, PE.


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Obrigada!


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