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中国医学科学院 中国协和医科大学 北京协和医院 鄢盛恺 - PowerPoint PPT Presentation


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卫生部 “ 十一五 ” 规划教材 全国高等医药教材建设研究会规划教材. 第五章 诊断酶学. 中国医学科学院 中国协和医科大学 北京协和医院 鄢盛恺. 退出. 主要内容. 一、酶的一般特征. 五、 酶的免疫化学测定. 二、血清酶. 六、 同工酶和亚型的测定. 三、酶促反应动力学. 七、工具酶及其临床应用. 八、临床常用血清酶及其同工酶. 四、酶活性浓度测定技术. 第一节 酶的一般特征. 一、基本概念. 二、酶的结构与催化作用. 三、酶的命名分类及编号. 返回章. 一、基本概念. 1. 酶、核酶。

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卫生部“十一五” 规划教材 全国高等医药教材建设研究会规划教材

第五章 诊断酶学

中国医学科学院中国协和医科大学 北京协和医院鄢盛恺

退出


主要内容

一、酶的一般特征

五、 酶的免疫化学测定

二、血清酶

六、 同工酶和亚型的测定

三、酶促反应动力学

七、工具酶及其临床应用

八、临床常用血清酶及其同工酶

四、酶活性浓度测定技术


第一节 酶的一般特征

一、基本概念

二、酶的结构与催化作用

三、酶的命名分类及编号

返回章


一、基本概念

1. 酶、核酶。

2. 酶的催化特性:极高的催化效率、高度的特异性、催化作用的可调节性。

3. 酶促反应:酶所催化的反应。

酶活性:酶催化反应的能力。

底物(S):酶所作用的物质。

产物(P):酶促反应的生成物。

酶的激活剂:加速酶促反应的物质。

酶的抑制剂: 减慢或终止酶促反应的物质。

返回节


二、酶的结构与催化作用

单纯酶和结合酶

单纯酶:只含多肽链,是单纯蛋白质。

结合酶:由酶蛋白和辅因子组成。

两者结合后形成的复合物称为全酶。

与酶蛋白结合疏松的称为辅酶。

与酶蛋白结合牢固的称为辅基。

酶的活性中心

  酶与底物结合并将底物转变成产物发生在酶表面的一个特定区域。

酶的催化作用机制

   诱导契合学说。

返回节



第二节 血清酶

一、血清酶的来源

二、血清酶的去路

三、血清酶的生理变异

四、血清酶变化的病理机制

返回章


一、血清酶的来源

血浆特异酶

  为血浆蛋白的固有成分,在血浆中发挥特定的

催化作用。多数由肝脏合成并以酶原形式分泌入,

在一定条件下被激活起作用。与凝血有关的酶或酶

原、ChE、Cp及LPL等。

非血浆特异酶

外分泌酶:由外分泌腺合成并分泌进入血浆的

酶,包括P-AMY、P-LPS、前列腺ACP等。

细胞内酶:存在于细胞内进行物质代谢的酶,

随着细胞的不断更新或破坏可少量释入血液。当其

大量出现于血清中时,提示酶的来源组织细胞受

损,最常用于临床诊断。

返回节


二、血清酶的去路

血清酶的半寿期 (T1/2)

定义: 酶失活至原来一半时所需时间。

半寿期代表酶从血中清除的快慢。半寿期长的酶,在血清中持续时间长。

血清酶的失活和排泄

酶的清除主要是在血管内失活或分解。

血清酶经蛋白酶水解产物(多肽或氨基酸)

可经小肠粘膜排至肠腔,再彻底分解成氨基酸后被重吸收,其中大部分可被组织利用,不能利用的氨基酸则随尿排出体外。

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三、血清酶的生理变异

1.性别 少数酶如CK、ALP及GGT等有性别差异,与血清酶的

来源组织有关。

2.年龄 血清酶的活性随年龄而变化,ALP和GGT到老年时可有

轻度升高。年龄差异也见于同工酶。

3.进食 过量饮酒可使血清GGT明显升高。

4.运动 多种血清酶活性升高,如CK、LD、AST、ALD和ALT

等,其升高的幅度与运动量、持续时间、运动频率及

骨骼肌所含的酶量有关。

5.妊娠 胎盘组织可分泌一些酶进入母体血液,如耐热ALP、

LD、LAP和ALT(少数)等,引起血清中这些酶活性升

高。

6.其他 一些酶活性与体重、身高的增长、体位改变、昼夜变

化及家庭因素有关。

返回节


四、血清酶变化的病理机制

酶合成异常

  • 合成减少

  • 合成增多

    酶释放增加:大多数血清酶增高的主要原因

  • 细胞内外酶浓度差异

  • 酶蛋白分子量的大小

  • 酶的组织分布

  • 酶在细胞内定位和存在形式

    酶的清除异常

      不同疾病和不同的酶从血中清除时间和机制不同。

    如AMY和ALP经肾脏或胆道排出异常而致血清酶升高。

返回节


 第三节 酶促反应动力学

一、米-曼氏方程

二、Km与Vmax

三、酶促反应进程曲线

四、影响酶促反应的因素

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一、米-曼氏方程

  • Michaelis 和Menten提出的酶作用的中间产物学说:

K1

K3

E+S

ES

E+P

K2

  • 1913年提出了著名的酶促反应速度与底物浓度关系的

    方程式,即米-曼氏方程(Michaelis-Menten equation):

返回节


Km vmax
二、Km与Vmax

Km值:等于酶促反应的初速率为最大速率Vmax一半

时的底物浓度,即V=½Vmax时,则Km=[S]。Km

在临床上的应用:

  反映酶与底物的亲合力,且与亲合力成反比。

用来计算不同底物浓度时酶促反应速度相当于最

    大反应速度的百分率。

  根据Km值选择酶的最适底物。

确定工具酶用量。

确定代谢酶系中的限速反应和作为鉴别酶的依 据。

Vmax:酶完全被底物饱和时的反应速度,代表了在一

定酶量下的最大反应速率。

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酶促反应时间进程曲线(S为底物,P为产物)


三、酶促反应进程曲线

底物耗尽期

线性反应期

——必须根据线性反应期的反应速率才能准确计算出酶活性浓度。

延滞期

如将酶反应过程中测得的产物[P]或底物[S]变化量对时间作图,可得酶促反应时间进程曲线。图中产物[P]或底物[S]变化曲线的斜率就代表酶促反应的速率。

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四、影响酶促反应的因素

底物浓度对酶促反应的影响

(1)当[S]<<Km时,反应速率与底物浓度[S]成正比,呈一级反应,

V=Vmax[S]/Km=K[S]

用工具酶来测定各种代谢物浓度的方法学基础。

(2)当 [S]>>Km时,反应速率与底物浓度[S]无关,

V=Vmax=K [E]

称为零级反应,反应速率与酶浓度[E]成正比。酶学测定时一般底物浓度可选择为Km的10~20倍。

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 第四节 酶活性浓度测定技术

酶活性浓度测定就是要使酶促反应的初速度(v)达到最大速度Vmax,即在过量底物存在下的零级反应期的速度,此时反应速度与酶浓度[E]之间存在线性关系。

一、酶活性浓度测定方法

二、酶偶联法

三、血清酶活性浓度测定条件的选择

四、酶活性浓度的单位

五、系数K值的计算与应用

六、临床酶学测定的标准化

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一、酶活性浓度测定方法

1.按反应时间分类:

定时法

连续监测法

2.按检测方法分类:

量气法、分光光度法、荧光法

其它方法( 放射性核素法、离子选择电极法,旋光法、极谱法、HPLC或生物发光法等)。

返回节


按检测方法分类——底物或产物浓度的检测

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定时法(固定时间法)

测定酶与底物作用反应一定时间后底物或产物变化的总量,计算酶促反应平均速度。

  • 优点:比较简单,最后测定时因酶促反应已被终止,故所用仪器无需恒温装置,显色剂的选择也可不考虑对酶活性的影响。

  • 缺点:无法知道在整个酶促反应进程中是否都处于线性期。

    利用该法测定酶活性浓度,必须保证酶和底物在所选定的温度下作用时间要非常精确,否则会引起较大误差。

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连续监测法

又称速率法或动力学法,指在酶促反应过程中用仪器监测某一反应产物或底物的浓度随时间

的变化量,求出酶反应初速度,间接计算酶活 性浓度的方法。

  • 优点:

    无须终止酶促反应,不需添加其它成色试剂,

    就反应物变化的多点测定结果连接成线,观察

    到整个反应过程,选择线性反应期来计算酶活

    性,结果准确可靠。

    要求检测仪器具有恒温装置及自动检测功能,自动生化分析仪都能达到这些要求。

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连续监测法的种类

直接法

是指待测酶酶促反应的底物或产物有特征性的理化性质,然后通过特殊的仪器直接检测。

  • 基于NADH或NADPH的反应原理 :LD、α-HBD等

  • 基于人工合成色素原底物 :ALP 、GGT、AMS等

  • 基于氧的消耗 :各种氧化酶

    间接法

    是指酶促反应底物和产物之间没有特征性的理化性质,需通过另一个化学反应或生化反应,将底物或产物转化为有明显特征理化性质的另一个化合物。用直接法来测定的酶类非常有限,很多情况下不得不使用间接法。

  • 化学法:如ChE的丁酰硫代胆碱测定法。

  • 酶偶联法

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二、酶偶联法

酶偶联反应

最简单的模式为:

Ex 为待测酶,A为底物,B为中间产物。A、B二物质的变化无法直接监测,此时可外加第二个酶Ei(为指示酶),其底物为B,反应产物为P可直接测定。

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辅助反应 如果一些酶促反应找不到合适的指示酶与其直接偶联,此时还可在始发反应和指示反应之间加入另一种酶,将二者连在一起,此反应称为辅助反应。模式为:

其中,B、C均为中间产物,Ea、Ei都为工具酶。最后一个酶称指示酶Ei,其他外加的酶都为辅助酶(Ea)。

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酶偶联反应原理

(1)当用酶偶联法测定时,在偶联反应中存在几个时期:

预孵育期、延滞期、恒态期、非恒态期。

(2)延滞期是酶偶联反应与一般酶反应的一个重要区别。从酶反应开始至稳态期间,指示酶反应较慢且不稳定,称为延滞期。在这期间指示酶反应速度不能代表测定酶量多少。

(3)设计和选择酶偶联测定方法时,延滞期越短越好,测定时间要避开此期。

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酶偶联法测定ALT的吸光度变化图

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对酶偶联反应的要求

指示酶反应必须是一级反应

酶反应速度与指示酶底物浓度相关。工具酶催化的最大反应速度必须远远大于测定酶,其所催化的反应必须在中间产物浓度很低的条件下进行,并且将此很快转变为最终产物,反应体系中不应有中间产物堆积,否则导致误差。

工具酶

作为试剂用于测定化合物浓度或酶活性的酶称为工具酶。

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指示酶、辅助酶的浓度计算方法一

 根据Vx/(Km)x:Vi/(Km)i的比值来选择指示酶的用量Vi,式中Vx为测定酶的测定上限。

比值为1:10、 1:100、 1:1000时,

误差28%、 4%、 0.7%。

实例:

 在肌酸激酶测定法中,CK的Km为2.4mmol/L,指示酶G-6-PD的Km为0.27mmol/L,如将CK测定上限定为450U/L(实际测定时标本稀释60倍,实际为7.5U/L),如希望上述比例为1:100。代入上式:

Vx/(Km)x:Vi/(Km)I=1:100

Vi=3.1×10-3×min-1×0.27mmol×100

=8.37×10-2×mmol×min-1 ×L -1

=83.7U/L

如反应体系为1ml,只需0.0837U的G-6-PD 即可。

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指示酶、辅助酶的浓度计算方法二

根据米氏方程式来计算,在酶偶联反应中,指示酶催化速度(Vi) 的

米氏方程式为:

  以天冬氨酸氨基转移酶(AST)为例希望中间产物P浓度很低,定为0.001mmol/L,指示酶苹果酸脱氢酶Km为0.0165mmol/L,如设定AST上限为300U/L(标本为1:12稀释,实测上限为25U/L)。代入上式:

Vi=0.0014mmol min-1=1.4U

得1.4U,如反应体系为3ml,则试剂中苹果酸脱氢酶用量为466U/L,目前试

剂中用量为600U/L。从以上计算来看,试剂中用量是足够的。

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三、血清酶活性浓度测定条件的选择

方法条件的选择 尽可能采用连续监测法;减少步骤,

化学试剂有一定纯度,双蒸水,使用双试剂。

测定参数的设置 方法类型、波长、样品量与试剂量、

稀释水量、试剂吸光度上下限、空白速率、反应孵育时

间、延迟,监测时间、底物耗尽限额、线性范围及计算

因子F值。

标本的采集、运输与保存

影响因素:溶血、抗凝剂、温度等。

干扰因素的控制 反应干扰。污染。底物自行发生反

应。

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不同贮存温度时体液酶的稳定性

*酶不耐融化;§与同工酶类型有关;※标本未酸化;#标本加枸橼酸或醋酸至pH 5


四、酶活性浓度的单位

酶活性单位

  • 惯用单位惯用单位是酶活性测定方法的建立者所规定的单位。由于单位定义不同,参考范围差别很大,难以进行比较。

  • 国际单位(IU) 在特定的条件下,每分钟转化1mol底物的酶量为一个国际单位。

    以IU表示,1IU=1mol.min-1。

  • Katal单位在规定条件下,每秒钟转化1mol底物的酶量为1kat, 1kat=1mol.s-1。常用单位为katal或 nkatal。

    Kat与IU的换算关系为:

    1IU=1mol·min-1=16.67nmol·s-1= 16.67nkatal

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酶活性浓度单位

临床上酶活性浓度采用每单位体积(升)所含的酶活性单位数表示。

酶活性浓度单位的计算

连续监测法根据摩尔消光系数进行酶活性浓度的计算。

公式如下:

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参考范围与正常上限升高倍数(ULN)

由于临床实验室进行酶学测定时所选仪器、试剂和方法不同,加之生物学变异等对酶活性影响,常常导致实验室之间所得参考范围差别甚远,应根据各自情况对各种酶建立自己的参考值。

所谓正常上限升高倍数(ULN)是指用测得的酶活性结果除以参考范围上限 。

便于比较来自不同方法的结果;如将ULN进一步适当分级,更制定出轻度、中度及极度增加的范围,一目了然。有些酶测定要考虑到不同性别、年龄时间时,用ULN换算更能正确表达,就不致发生误判。

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临床常用血清酶的测定方法与参考范围(37℃)

*国际临床化学联合会(IFCC)参考方法;#实际为拟胆碱酯酶(PChE)

返回节


五、系数K值的计算与应用

用自动生化分析仪测定同一酶,条件固定时,从理论上来讲V、v和L均为固定值,为常数,则将公式

简化为

如LD活性浓度,已知NADH的为6.22103·cm-1.mol-1,血清量为50l,底物液为1ml,比色杯光径为1cm,则

F=1.05106/6.22 1030.051=3376

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连续监测法中常数K值的设置

测定酶的判断值或参考范围上限,保证测定的可靠,所

以转氨酶的常数K一般在3000左右,不少人宁愿在1500

左右。

应考虑到测定时间,测定时间短到0.5分,此时0.001嗓

音对每分钟△A误差将是0.002,反之,测定时间延长

到2分钟,误差也小一半。即测定时间长,则K值可以

设置大一些,如测定时间只有0.5分钟,K值一般不超

过4000。

改变K值最方便的途径就是改变标本稀释度,稀释倍数

愈大,K值愈大。

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连续监测法中常数K值的检验

  • 摩尔吸光系数(ε)对一定物质而言常是一个定值,但在一些外界条件影响下也会有所变化。

    对硝基酚:当pH>10时,405nm处其ε为18500。

    NAD(P)H:当波长大于334nm时,随温度升高,同一波长的ε值会轻度下降。

  • ε值在近似单色光的光源条件下才能成立。

  • 实际K值的测定。

    一些性质稳定的物质如对硝基酚.用高纯试剂配成标准品或直接购买,计算出实际K值。

    NAD(P)H反应有关酶测定的K值。葡萄糖终点法测定,产生与葡萄糖相等摩尔数的NAD(P)H。

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六、临床酶学测定的标准化

  • 使用推荐方法和参考方法

  • 使用公认的酶校准物或酶参考物

标准化途径

酶活性浓度测定的参考系统

  • 建立原级参考方法

  • 制备原级参考物

  • 建立参考实验室网络

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第五节 酶的免疫化学测定

酶的免疫化学测定方法

 放射免疫测定(RIA)、免疫抑制法、化学发光免疫测定(CLIA)、酶免疫测定(EIA)、荧光酶免疫测定(FEIA)。

免疫化学法的结果报告方式

(1)用酶活性浓度单位,结果以U/L表示。

(2)用质量浓度单位,结果直接用ng/ml或g/L表示。

血清酶活性与酶质量的变化的关系

注意两者之间的差异,如CK-MB活性与质量不平行。

返回章


酶的免疫化学测定的优缺点

优点:

  • 灵敏度高,能测定样品中少量或痕量酶。

  • 特异性高,不受体液中其他物质的影响。

  • 能测定一些不表现酶活性的酶蛋白;

  • 特别适用于测定同工酶。

    局限性:

  • 制备足够量的提纯酶和抗血清非常困难且工作量大。

  • 测定步骤多,操作繁琐。

  • 测定成本高。

返回节


第六节 同工酶及亚型的测定

一、同工酶的概念及分类

二、同工酶的分析方法

返回章


一、同工酶的概念及分类

概念:

同工酶是催化相同的化学反应,而酶蛋白的分子结构、

理化性质不同的一组酶。

亚型指基因在编码过程中由于翻译后修饰的差异形成的

多种形式的一类酶。往往在基因编码产物从细胞内释入

血浆时因肽酶作用降解而形成。

分类:

简单分类——原级同工酶和次级同工酶。

基因分类——单基因决定的同工酶、复等位基因同工

酶、多基因决定的同工酶和修饰的同工酶等四类。

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电泳法

电泳材料:醋酸纤维素薄膜、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、等电聚焦及毛细管电泳等。

区带显色:各同工酶区带进行酶促反应显色后,扫描定量,而颜色的深浅与同工酶活性成正比。

巨分子酶产生的原因:

酶与免疫球蛋白形成复合物,如CK-BB-IgG 。

酶与其他蛋白质形成复合物,如LD-β-脂蛋白 。

酶亚基或分子之间形成聚合物,如CK-Mt聚合物、LD亚基自身聚合等。

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层析法

层析法:利用同工酶分子量大小、所带电荷多少的不

同,以及受某些离子交换剂吸附的强弱程度不同来进

行分离鉴定的方法。

柱层析,如离子交换层析和亲和层析等。因操作方法

费时繁琐,一般不用于临床同工酶常规检测,而主要

用于同工酶的分离、制备、纯化。

返回节


免疫分析法

免疫抑制法 根据同工酶的某一种亚基与相应的抗体

结合后,酶活性受到抑制,可算出该型同工酶的活性。

如CK-MB活性测定。

免疫沉淀法 该法利用同工酶抗体形成抗原抗体复合

物沉淀的原理,减去法可算出同工酶的活性。

其他免疫学方法测定酶蛋白 利用酶是蛋白类抗原但

含量极微的特点,可应用免疫电泳、RIA、EIA和

CLIA等方法。这类方法的最大特点就是与酶活性无关,

测定酶的质量。

返回节


动力学分析法

底物特异性分析法 利用不同的同工酶对底物的亲和力

的差异即可进行分析。

抑制剂分析法 利用同工酶之间结构的不同而对同一种

抑制剂有不同的亲和性和反应性来进行分析。

pH分析法 利用不同的同工酶可有不同的最适pH进行分

析。

热失活分析法 利用不同同工酶的耐热性不同来进行分

析与鉴定。

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第七节 工具酶及其临床应用

一、工具酶

二、代谢物的酶法测定

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一、工具酶

概念

作为试剂用于测定化合物浓度或酶活性

的酶称为工具酶。

工具酶参与的指示反应

偶联H2O2工具酶及指示反应:如常用的

Trinder反应。

NAD(P)+或NAD(P)H偶联的脱氢酶及其指

示反应:利用氧化-还原酶反应使其连接到

NAD(P)-NAD(P)H的正/逆反应后,直接测定

NAD(P)H的变化量。

返回节



工具酶的其他应用

  • 酶循环法

  • 固相酶

酶循环法测定胆汁酸

返回节



二、代谢物的酶法测定

终点法

概念:

在代谢物酶促反应中,随着时间的延续,待测物浓度逐渐

减少而产物逐渐增多,一定时间后待测物全部转化为产物,反

应趋于平衡,测定反应完全后待测物或产物变化的总量,即终

点法(又称平衡法)。

测定的基本条件:

待测物浓度[S]应远小于其米氏常数Km,此时任何时刻的

反应速度 v=V[S] / Km,呈一级反应。

反应配方中所用酶量(V)应足够大,而Km应小,以保证

有较快的反应速度完成测定。

返回节


代谢物的酶法测定—终点法的类型

直接法

待测物与产物在理化性质上有可直接进行检测的差

异,这种是最简单的代谢物浓度测定方法。

如尿酸在尿酸氧化酶作用下生成的尿囊素在293nm有

特异的吸收峰,胆红素在胆红素氧化酶作用下生成胆绿

素造成450nm处的吸光度下降等。体内还有很多代谢物可

以直接测定,关键是需要相对应的酶。

返回节


代谢物的酶法测定—终点法的类型

酶偶联法

与酶活性测定一样,直接法测定的项目是有限

的。每种代谢物可以使用不同的酶而建立多种检测

方法。

如甘油三酯、肌酐都有多种酶试剂法。指示反

应主要分两大类:NAD(P)H和过氧化物酶(POD)系

统。

返回节


动力学法

概念:

根据米氏方程,当[S]<<Km,一般[S]/Km<0.2,最好

<0.05,[S]+Km≈Km,此时呈一级反应,反应初速

度v=k[S]。如果能准确测定反应的初速度(v),采用标

准浓度对照法即可求得待测物的浓度。

实际操作中,测定两个固定时间的吸光度差值,只

要此期间待测物消耗<5%,就可以采用标准浓度对照法计

算样本浓度,所以动力学法有时又称为定时法。

返回节


终点法与动力学法的主要区别

与终点法相比,动态法测定中待测物无需完全转化,故工具酶

的用量较少,为了保证有足够的测定线性,所用酶的Km应足够

大。

两者对于测定仪器的要求不同。终点法测定对于仪器的电噪声

和温控要求不严,而动态法要求仪器的电噪声小,吸光度应读

准到0.0001,温度变化<0.1%。

产物的堆积和样品色原对动态法影响较小,而对终点测定法

影响较大。如碰到乳糜或溶血,在做终点法测定时,有时需

设样本空白。

返回节


第八节 临床常用血清酶及其同工酶

一、转氨酶及其同工酶

二、-谷氨酰转移酶及其同工酶

三、肌酸激酶及其同工酶

四、乳酸脱氢酶及其同工酶

五、碱性磷酸酶及其同工酶

六、酸性磷酸酶及其同工酶

七、淀粉酶及其同工酶

八、脂肪酶

九、胆碱酯酶

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一、转氨酶及其同工酶

生化特性

ALT 、 AST

以磷酸吡哆醛(维生素B6)作为辅基,

单纯的酶蛋白无催化活性。

组织分布

ALTs、ALTm,AST 、 ASTm

正常血清主要为ASTs,当细胞受到轻度损

伤时ASTs 显著升高。若血清中出现大量的

ASTm,则表示细胞严重受损。

返回节


转氨酶的测定方法

目前,国内外实验室多采用连续监测法进行测定。

ALT速率法测定中酶偶联反应式为:

AST速率法测定中酶偶联反应式为:

返回节


转氨酶测定的临床意义

急性肝损害

ALT的升高常与病情轻重相平行,可作为判断急性肝炎

是否恢复的指标。常是肝坏死的前兆。

心脏、骨骼肌等组织受损、肝胆疾病时

血清ALT水平也可出现不同程度的升高。

在AMI患者胸前区疼痛发作后6~8h,血清AST可明显升

高,发病后48~60h达峰值,4~5天可降至正常。

转氨酶

轻度增加(1~3ULN) :胰腺炎、酒精性脂肪肝、肝硬

化、肉芽肿、肿瘤等。

中度增加(3~10ULN)的疾病:传染性淋巴增多症、慢性

活动性肝炎、肝外胆道梗塞、心肌梗死等。

重度增加(>20ULN)的疾病:病毒性肝炎、中毒性肝炎。

返回节


二、-谷氨酰转移酶及其同工酶

生化特性

-GT或GGT 是一种含巯基的线粒体酶。

组织分布

分布于肾、胰、肺、肝、肠和前列腺等多种组织

中,其中以肾脏含量最多。

GGT在细胞中有膜结合型(疏水型)和可溶型(亲

水型)两种。

血清中GGT主要来源于肝胆系统。

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GGT的测定方法

以往国内多以L--谷氨酰--萘胺或L--谷氨酰-对硝基苯胺等人工合成底物进行比色法测定(即重氮试剂法)。由于底物水溶性差,缓冲液和 pH 对结果影响较大,现已较少应用。目前国内外多采用连续监测法测定血清-GT活性。

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IFCC参考方法

采用L--谷氨酰-3-羧基-对硝基苯胺(GCNA)作为底物,以甘氨酰甘氨酸(双甘肽)作为-谷氨酰基的受体。在pH7.7的条件下,-GT催化底物生成-谷氨酰双甘肽和黄色的2-硝基-5-氨基苯甲酸,在410nm波长处直接连续监测,吸光度的增高速率与-GT活性成正比关系。

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GGT测定的临床意义

(1)胆道疾病

胆石症、胆道炎症、肝外梗阻等升高明显。

(2)肝实质疾病

肝炎、脂肪肝、肝硬化时中度升高。

慢性肝炎活动期GGT多增高,非活动期则多正常。

原发性或转移性肝癌时不同程度的增高。

(3)诱导作用

对乙醇性中毒的判断有一定的价值。

长期接受巴比妥类药物、含雌激素的避孕药者升高。

(4) 同工酶

用醋酸纤维薄膜电泳可将GGT同工酶分为GGT1、GGT2、GGT3和

GGT4四种,正常人只有GGT2和GGT3。

重症肝胆疾病和肝癌时有GGT1出现;乙醇性肝坏死、胆总管结

石及胰腺炎时GGT2增加;GGT4与胆红素增高相关。

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三、肌酸激酶及其同工酶

生化特性

肌酸激酶为巯基酶,易受金属离子Ca2+、Cu2+、Zn2+、

Mn2+等的抑制,Mg2+是CK的必需激活剂。由两种不同亚基(M

和B亚基)组成的二聚体。

按电泳速率的快慢分为:CK-BB(CK1)、CK-MB(CK2)、

CK-MM(CK3)和CK–Mt(CK4)四种同工酶。

组织分布

广泛分布于全身,骨骼肌含量最高,其次是心肌和脑组

织。

CK-BB在脑和脊髓内含量最高称为脑型同工酶。分为氧化

型、中间型和还原型3种亚型。

CK-MB主要存在于心肌细胞内称为心型同工酶。分为

CK-MB1\CK-MB2亚型。

骨骼肌中几乎全部为CK-MM,称为肌型同工酶。分为

CK-MM1\CK-MM2\CK-MM3亚型。

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CK的测定方法

有比色法、紫外分光光度法和荧光法等。由于以磷酸肌酸为底物的逆向反应速度快,约为正向反应速度的6倍,所以采用逆向反应进行测定较为普及。如肌酸显色法和酶偶联法,其中以后者最常用,有两种工具酶及指示酶参与反应。

IFCC测定CK的参考方法为酶偶联法。

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CK同工酶和亚型的测定方法

  临床常规测定CK同工酶多用电泳和免疫抑制法,但二法均会受溶血和巨CK的干扰,免疫抑制法还会受到CK-BB的干扰。

现推荐用免疫化学方法直接测定CK-MBmass,可不受溶血和巨CK的干扰。

CK同工酶亚型(CK-MM亚型和CK-MB亚型)多用琼脂糖凝胶高压电泳和等电聚焦电泳等。

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正常和病理状况时琼脂糖凝胶电泳分析血清CK同工酶可能出现的酶带

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CK及其同工酶测定的临床意义

主要用于早期诊断AMI

(1) 血清CK总活力

AMI后2~4h开始升高,10~24h达峰值,3~4天恢复正

常。

(2)CK同工酶及亚型

AMI胸痛发作后,血清CK-MB的上升先于其CK总活性,

CK- MB/CK>0.03可诊断为AMI。

CK-MM亚型的测定:以CK-MM3/CK-MM1>1.0作为诊断AMI的

标准。

CK-MB2亚型:在AMI早期诊断和判断有无再灌注上同样有很

高的灵敏度和特异性。一般以CK-MB2>1.9U/L或CK-MB2/CK-MB1>1.5作为AMI的诊断标准。

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四、乳酸脱氢酶及其同工酶

生化特性

乳酸脱氢酶是糖酵解途径中的一种重要酶。LD除催

化L-乳酸外还可催化α-羟丁酸、γ-酮丁酸进行脱氢反

应。

组织分布

LD位于细胞质中,是一种含锌的糖酵解酶。LD是

由H(心型)和M型(肌型)两种不同亚基组成的四聚体。

5种同工酶。

若用-羟基丁酸作为底物,可测定H亚基的活性。

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LD的测定方法

目前多用连续监测法。

  • LD-P法:以丙酮酸为底物(反应方向PL)的逆向反应(称LD-P法)。

  • LD-L法:以乳酸为底物(反应方向LP)的顺向反应(称LD-L法)。为IFCC参考方法(pH为9.4)。通过在340nm波长处监测NAD+还原成NADH吸光度的增加速率而计算LD活性。

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LD同工酶的测定方法

常用电泳法、免疫沉淀法和免疫抑制法等。目前以琼脂糖凝胶电泳法更多用。一般成年人存在如下规律:LD2>LD1>LD3>LD4>LD5,部分正常儿童血中可见LD1>LD2。

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LD及其同工酶测定的临床意义

心肌梗死LD心肌酶中升高最晚,持续时间长。

急性肝炎、慢性活动性肝炎和肝癌(尤其转移性肝癌)时,LD明显

升高。

LD同工酶主要用于AMI和肝病的诊断

  • AMI LD1升高最为显著,LD1/LD2>1,视为诊断AMI的一个特异指标。

  • 肝胆疾病 LD5升高常表示有肝细胞坏死。肝细胞性黄疸时LD5>LD4,阻塞性黄疽时LD4>LD5。

  • 肿瘤 肝癌(尤其转移癌)时可伴有LD4和LD5明显增高;白血病、胶原病时以LD3、LD4增高为主。

  • 恶性贫血 LD活性极度升高(原始巨幼红细胞可产生并释放LD),伴有LD1明显升高,LD1>LD2。

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AMI时心肌酶时相变化

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五、碱性磷酸酶及其同工酶

生化特性

碱性磷酸酶是一组底物特异性较低,在碱性条件下(最适

pH为10左右)能水解很多磷酸单酯化合物的酶。

组织分布

ALP广泛分布定位于细胞膜表面,其含量依次为肝、肾、

胎盘、小肠、骨骼等。

血清中的ALP主要来自肝脏和骨骼,是胆汁淤滞的酶学指

标。

根据ALP的来源不同可以3大类,即胎盘ALP、肠ALP和

肝/骨/肾ALP同工酶。在病理时还可能出现肝ALP和胆汁ALP

等“高分子ALP”,以及一些和肿瘤有关的变异ALP,如

Regan、Nagao ALP等。

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ALP的测定方法

(1)磷酸苯二钠比色法:测定ALP水解底物产生的酚。

(2)连续监测法:我国及IFCC的推荐方法。

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ALP测定的临床意义

肝胆疾病 各种肝内、外胆管阻塞引起的胆汁淤积性疾

病,ALP明显升高,且ALP升高与胆红素平行

甲亢、恶性骨损伤、佝偻病、Pagets病、骨折、指端肥大

症所致骨损伤等,均可引起ALP活性升高,尤其是骨ALP同

工酶的增高

妊娠后期及儿童生长期ALP增高

血清ALP活性降低:主要见于呆小病、维生素C缺乏症、甲

状腺功能低下、恶性贫血等。

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六、酸性磷酸酶及其同工酶

生化特性

酸性磷酸酶是一组对底物专一性不强、在酸性条件下水

解各种正磷酸单酯的酶。

组织分布

ACP主要存在于体内所有细胞的溶酶体中。

血清中ACP主要来源于前列腺,称为前列腺ACP(PAP),它

可被酒石酸抑制;其活性约为其他组织中酶活性的100倍。非前

列腺ACP,不被酒石酸抑制。

正常男性血清中的ACP约有1/3~1/2来自前列腺,其余则与

女性血中的ACP一样可能来自血小板或破骨细胞。

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ACP的测定方法

ACP的测定底物、原理和方法与ALP 相似,只是反应pH为

酸性。如利用磷酸苯二钠法和磷酸对硝基酚法等在酸性条件下

测定ACP。国外多推荐使用磷酸麝香草酚为底物的比色法。

可通过用L-酒石酸这类抑制剂鉴别和估量PAP活性。由于

ACP不稳定,酶活性测定困难,目前已发展一些免疫学方法

特异而灵敏地测定ACP(特别是PAP)。

血标本采取后必须尽快分离血清并立即测定。不同方法

参考范围也不同。

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ACP测定的临床意义

前列腺疾病 血清PAP测定是诊断前列腺癌最重要的指标之一。在

前列腺肥大、前列腺炎、急性尿潴留时亦可升高。酒石酸抑制试

验可区别PAP与非PAP。

骨病 恶性骨肿瘤、变形性骨炎、多发性骨髓瘤、骨质疏松、代谢

性骨病等轻度增高。

肝病 肝癌、肝硬化肝炎时ACP增高。

血液病 溶血性疾病、白血肉、血小板疾病等,ACP均有不同程度

的升高。

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七、淀粉酶及其同工酶

生化特性

α-amylase(AMY或AMS)是一种不均一性的钙依赖

金属蛋白酶。AMY作用的最适pH在6.5~7.5,卤素和其

他阴离子有激活作用(Cl>Br>NO3>I)。

分子量40000~50 000,易从肾脏排出。半寿期很

短,约为2h。

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组织分布

α-AMY分为两种同工酶:S-AMY和P-AMY。

利用醋酸纤维薄膜电泳或琼脂糖电泳可将S-AMY

分为S1、S2、S3和S4四个亚型;P-AMY分为P1、P2、

P3三个亚型。

P-AMY和S-AMY可单独或联合与抗淀粉酶自身抗体

以非共价形式结合,形成高分子循环复合物,称为

巨淀粉酶(M-AMY)。M-AMY的分子量较大,不易从

肾小球滤过,因此容易造成高淀粉酶血症。

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AMY的测定方法

AMY总活性测定:化学法、酶偶联法。

根据底物不同分为两类。一类是以天然淀粉为底

物的测定方法。如碘淀粉比色法等。另一类底物是人

工合成的麦芽多糖为底物的测定方法,这类方法是国

内外目前应用最多的方法。如2-氯-对硝基苯麦芽三

糖苷(CNP-G3)和亚乙基封闭的对硝基苯麦芽庚糖苷

(4NP-G7)法(亦称EPS 法),以后者最常用。

EPS法测定AMY

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AMY测定的临床意义

AMY活性增高

  • 急性胰腺炎 发病后3~6h 开始升高,12~24h达峰值,2~5天下降恢复至正常。超过500U有意义。

  • 慢性胰腺炎急性发作、胰腺癌等AMY升高。

  • 急腹症如急性阑尾炎、肠梗阻、溃疡现穿孔等,血清 AMY可升高。这些病变可波及胰腺,较急性胰腺炎为低。

    AMY活性降低 主要见于肝炎、肝硬化等。

    AMY同工酶增高

  • 急性胰腺炎和慢性胰腺炎急性发作P型增高。

  • 腮腺炎、肺癌、卵巢癌等S型增高。

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八、脂肪酶

生化特性

脂肪酶(lipase,LPS)又称甘油三酯酶,其专一

性不高,是一种单链糖蛋白。可被巯基化合物、胆汁

酸、Ca2+及辅脂肪酶等激活剂激活,而被重金属、丝氨

酸所抑制。

组织分布

血清中LPS主要来源于胰腺的腺泡细胞。

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LPS的测定方法

  • 比浊法(以橄榄油悬液为底物),以连续监测法为常用。

  • 分光光度法:

    • 酶偶联显色比色法(多用1,2-甘油二酯为底物)

    • 采用人工合成底物1,2-二月桂基-rac-丙三氧基-3-戊二酸试灵酯设计的连续监测法。此法为一步速率法,具有简便、快速、灵敏、稳定和抗干扰能力强等特点。

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LPS测定的临床意义

主要用于诊断胰腺疾病,血清LPS在急性胰腺炎时活性升高的时间早,上升幅度大,持续时间长,故其诊断价值优于AMY。

  • 在急性胰腺炎发作后2~12h,血清LPS可显著升高,24h至峰值,48~72h可能恢复正常,但随后又可持续升高8~15天。

  • 在酗酒、乙醇性胰腺炎、慢性胰腺炎、胰腺癌、肝胆疾患等血清LPS也可有不同程度的升高。

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九、胆碱酯酶

生化特性

胆碱酯酶(ChE)是一类催化酰基胆碱水解的酶类。又称酰基胆碱水解酶。人体主要有两种,即乙酰胆碱酯酶(AChE)又称真性胆碱酯酶或胆碱酯酶Ⅰ、丁酰胆碱酯酶(BuChE)又称假性胆碱酯酶或称拟乙酰胆碱酯酶(PChE)或胆碱酯酶Ⅱ。临床常规检查的胆碱酯酶(SChE)即指后者,通常简称为ChE。

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组织分布

AChE主要分布于神经组织、肌肉、红细胞、肺等处,其生理功能是催化水解乙酰胆碱,能使神经细胞反复去极化。ChE/BuChE主要在肝脏合成,也分布于胰脏、心脏、小肠黏膜、大脑灰质、血浆及淋巴液等处。

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ChE的测定方法

测定方法有两类:

  • 一类以乙酰胆碱为底物,测定水解反应生成的酸。常用指示剂(如间-硝基酚或溴百里酚蓝)测pH 法。特别是纸片法简便快速,适用于急诊有机磷中毒的快速筛查。但此类方法准确度较差。

  • 另一类是以人工合成的底物测定胆碱衍生物的生成。丁酰硫代胆碱法是目前测定血清ChE最常用的方法。

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ChE测定的临床意义

用于肝脏损伤和有机磷中毒的诊断。

有机磷中毒

两种ChE活性均减低,因为有机磷与ChE活性中心结

合,使其丧失催化能力。ChE活性在50%~70%为轻度中

毒;30%~50%为中度中毒;30%以下为重度中毒。亚急

性及慢性中毒,AcbE可降至O。

肝实质损害

肝脏具有合成胆碱酯酶的功能。肝实质性损伤时,

ChE合成降低;当肝功能恢复后,ChE合成亦随之逐渐转为

正常。

增高

肾脏疾病(排泄障碍或合成亢进);脂肪肝、甲亢、糖

尿病等可出现ChE的增高。

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