Techniques d tude des interactions prot ine prot ines grande chelle
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Techniques d’étude des interactions protéine-protéines à grande échelle PowerPoint PPT Presentation


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Techniques d’étude des interactions protéine-protéines à grande échelle. Hervé PHILIPPE BIN1001 – hiver 2006. Pourquoi étudier les interactions protéine-protéine ?. beaucoup de matériel à disposition focus sur l’étude des fonctions cellulaires capacité des protéines à former des complexes

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Techniques d’étude des interactions protéine-protéines à grande échelle

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Presentation Transcript


Techniques d tude des interactions prot ine prot ines grande chelle

Techniques d’étude des interactions protéine-protéines à grande échelle

Hervé PHILIPPE

BIN1001 – hiver 2006


Pourquoi tudier les interactions prot ine prot ine

Pourquoi étudier les interactions protéine-protéine ?

  • beaucoup de matériel à disposition

  • focus sur l’étude des fonctions cellulaires

  • capacité des protéines à former des complexes

    • ≈5 partenaires pour chaque protéine

  • importance des complexes protéiques dans l’aspect fonctionnel

 interactome


De nombreuses techniques d tude

De nombreuses techniques d’étude

Piehler J. Curr.Op.Struct.Biol. 2005; 15:4-14

  • in vivo

  • maintien du contexte cellulaire

  • in vitro

  • caractérisation détaillée des interactions

    • (cinétique, stochiométrie …)

  • validation des résultats in vivo


Co immunopr cipitation

Co-immunoprécipitation

http://www.piercenet.com/Proteomics/browse.cfm?fldID=9C471132-0F72-4F39-8DF0-455FB515718F


Double hybride

Double hybride

Principe :

  • utilisation de facteurs de transcription modulaires chez la levure

    • domaine d’activation

    • domaine de liaison à l’ADN

  • fusion des protéines à tester chacune avec un module du facteur de transcription

  • expression du produit de transcription si les protéines testées interagissent


Double hybride1

DA

prot 3

prot 2

prot 1

DL

DL

mARN

Double hybride

Système rapporteur

DA : domaine d’activation

DL : domaine de liaison à l’ADN

DA

TF

DL

colonies de levures

pas d’expression

expression du gène

mARN

Fusion protéines et modules du facteur de transcription

Expression du système


Double hybride2

Double hybride

Fields S. & Song O. Nature. 1989; 340:245-246.

Avantages :

  • expérience facile à mettre en place

Inconvénients :

  • analyse qualitative

  • faux positifs si les interactions préexistent chez la levure

  • faux négatifs : problème d’expression des protéines cibles chez la levure

  • non applicable aux protéines membranaires (30% du protéome)

Application :

  • identification des interactions

  • criblage de banque de protéines


Interactome chez c elegans

Interactome chez C. elegans

Li S. et al.; Science 2004; 303:540–543


Pca protein fragment complementation assay

PCA : protein fragment complementation assay

Johnsson N & Varshavsky A. PNAS. 1994; 91:10340-10344

Michnick SW. Curr Opin Biotechnol. 2003;14(6):610-7

Principe :

  • rapporteur (enzyme ou protéine fluorescente)

  • fractionnement du rapporteur + fusion aux protéines à tester

  • mesure de la reconstitution du rapporteur si les protéines testées interagissent


Pca protein fragment complementation assay1

PCA : protein fragment complementation assay

Avantages :

  • applicable pour les protéines membranaires

  • réponse très rapide

Inconvénients :

  • décalage temporel de la réponse au signal d’expression

  • nombreux faux positifs : accumulation du substrat et du produit de la réaction enzymatique

Application :

  • identification des interactions

  • étude des réseaux d’interaction


Fret fluorescence resonance energy transfer

R0

10-70 Å

excitation

émission

accepteur

525 nm

475 nm

nm

475

FRET (fluorescence resonance energy transfer)

L. Stryer; Annu Rev Biochem 1978; 47: 819–846

donneur

525

Principe :

  • excitation d’un fluorophore donneur par un photon

  • émission fluorescence par le donneur

  • excitation du fluorophore accepteur s’il est suffisamment proche

  • mesure du rapport de fluorescence


Fret fluorescence resonance energy transfer1

FRET (fluorescence resonance energy transfer)

Avantages :

  • étude dynamique en temps réel

  • applicable in vivo dans le système cellulaire originel

  • peut être couplé à un signal biologique

  • applicable dans tous les compartiments cellulaires

Inconvénients :

  • création de protéines chimériques qui peuvent modifier les interactions

  • nécessite la surexpression des protéines testées

Application :

  • signification biologique des interactions

  • localisation cellulaire par couplage avec des techniques de microscopie


Tap tag tandem affinity purification

TAP-Tag : Tandem Affinity Purification

tag

Principe :

1.

peptide de fixation à la calmoduline

domaines de fixation de la ProtA aux IgG

site de clivage à la TEV protéase

2.

  • constitution du complexe protéique in vivo puis lyse des cellules

  • fixation du complexe via la ProtA sur la colonne d’affinité et élution douce des contaminants

  • clivage du tag par la protéase

  • fixation du complexe via le peptide de fixation à la calmoduline et élution douce des contaminants résiduels et de la protéase

  • élution du complexe et analyses subséquentes

3.

4.

5.

Puig O. et al.; Methods 2001; 24:218–229


Spectrom trie de masse

Spectrométrie de masse

Gingras et al. (2005) J Physiol 563:11-21

Inconvénients :

  • nécessite la purification des complexes

  • méthode compliquée et coûteuse

Application :

  • identification des protéines présentes dans un complexe


Tap tag tandem affinity purification1

TAP-Tag : Tandem Affinity Purification

Avantages :

  • seul l’appât est modifié, pas les autres protéines du complexe

  • taux d’expression biologique des protéines

  • identification de complexes avec plus de 2 protéines

Inconvénients :

  • seules les interactions très stables peuvent être détectées

Application :

  • identification des complexes protéiques


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