Small interfering rna sirna
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Small interfering RNA ( siRNA ). Cristina Teixidó Febrero. Historia. En los 90. Las primeras observaciones de silenciamiento de genes se hicieron al querer mejorar cultivos de interés económico

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Small interfering RNA ( siRNA )

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Presentation Transcript


Small interfering rna sirna

Small interfering RNA ( siRNA )

Cristina Teixidó Febrero


Historia

Historia

  • En los 90. Las primeras observaciones de silenciamiento de genes se hicieron al querer mejorar cultivos de interés económico

  • 1990 R. Jorgensen “Introduction of a Chimeric Chalcone Synthase gene into petunia results in reversible co-supression of homologous genes in trans.” Plant Cell

  • 1997 David Baulcombe Intentar frenar la infección vírica en la planta del tabaco. Introducir genes virales en plantas transgénicas las protegía de la infección por el virus. “A Species of Small Antisense RNA in posttranscriptional gene silencing in plants” Science

  • 1998 Andrew Fire yCraig Mello C. elegans. Se puede silenciar la expresión de un gen a través de la introducción del dsRNA correspondiente. Andrew Fire denominó este fenómeno RNAi

  • 2001 Thomas Tuschl. Demostró que siRNAs sintéticos eran capaces de inducir RNAi en células de mamífero “Duplexes of 21-nucleotide RNAmediate RNA interference incultured mammalian cells” Nature


Introducci n

Introducción

  • La ribointerferencia es un mecanismo de silenciamiento post-transcripcional de genes específicos, ejercido por moléculas de RNA que, siendo complementarias a un RNA mensajero, conducen a la degradación de éste

  • ARNi es una molécula de RNA que suprime la expresión de genes específicos

  • El siRNA, ARN pequeño de interferencia, es también conocido como RNA de silenciamiento. Es uno de los tipos de RNA interferente y se produce mediante el procesamiento de la enzima Dicer

  • Es altamente específico para la secuencia de nucleótidos de su RNA mensajero diana, interfiriendo por ello con la expresión del gen respectivo

Imagen de Dicer


Estructura

Estructura

  • Doble cadena de 21-23 pb

  • Cada hebra de RNA tiene un grupo fosfato 5’ y un grupo hidroxilo (-OH) en 3’

  • Los siRNA no están presentes en organismos unicelulares, sino que son propios de células eucariotas. Esto sugiere que se trata de una función biológica bastante nueva, que han adoptada las células más avanzadas durante la evolución


Aplicaciones y funciones

Aplicaciones y funciones

  • Mecanismo de control de la expresión génica

  • Permite estudiar la función de cada gen e identificar genes esenciales en procesos celulares

  • Regulación del desarrollo y el mantenimiento del genoma

  • Funcionan como un sistema de defensa contra virus, control de transposones o elementos génicos anómalos.

  • Estrategia terapéutica potencial en enfermedades virales, descubrimiento de fármacos diana y terapia del cáncer

  • Validar dianas terapéuticas

  • Suelen utilizarse precursores de RNAi, ya sea RNA doble cadena del gen diana a reprimir o directamente RNA monocatenario complementario al RNAm a silenciar

  • Con cultivos celulares, generalmente el vehículo utilizado son liposomas

    .


V a del rnai

Vía del RNAi


Rnai transitivo

RNAi transitivo

  • En plantas, hongos y Caenorhabditis elegans

  • La molécula de siRNA provoca, tras el corte del mRNA diana, la síntesis de nuevos siRNA a partir de secuencias que están en dirección 5’ del punto de corte, con lo que se amplifica la señal

  • RNA polimerasas dirigidas por RNA, las cuales aparentemente no existen en humanos


V a del rnai1

Vía del RNAi

  • Dicer puede cortar dsRNA a siRNAs de: (A) secuencias propias, (B) virus o (C) miRNAs.

  • Algunos virus generan dsRNA dentro de las células a las que infectan. Las células infectadas detectan estos dsRNA y montan una respuesta de defensa, que termina con la degradación del RNA invasor


Dise os de los sirna

Diseños de los siRNA

  • Diseño aleatorio.

    - Selección de 21 bases del ARNm diana sin tener en cuenta la secuencia que tiene en el transcrito

    - Uso por los investigadores del mecanismo de acción de los ARNi para identificar posibles nuevos parámetros o atributos relacionados con la funcionalidad del ARNi

  • Diseño racional

    - Procedimiento informático dirigido a identificar las dianas óptimas del siRNA en un ARNm

    - Empleo de un complejo algoritmo que incluye amplios análisis bioinformáticos para identificar siRNAs funcionales únicos con efectos secundarios mínimos

    - Permite elegir un siRNA altamente funcional

    - Lleva a cabo comparaciones sistemáticas de secuencias

    - Elimina de forma efectiva los siRNA no funcionales del conjunto de candidatos

    El algoritmo emplea un sistema de criterios como el contenido GC, perfiles de estabilidad interna, estructura interna, presencia de bases en posiciones clave, etc


Dise o convencional

Diseño convencional

  • Elegir el sitio diana del siRNA

  • Longitud de 21-23 pb sense/antisense con los extremos 3’ salientes y los 5’ fosforilados.

  • AA(N19)TT. En los 3’ va bien usar 2 dt seguidos

  • La cadena con el 5’ termodinámicamente menos estable es la incorporada en el RISC

  • 5’ cadena guía: Tm menos estable (rico en A/U)

  • 5’ cadena pasajera: Tm más estable (rica en G/C)

  • Las tres primeras pautas: extremo 5 ’ de la cadena antisentido sea el termodinámico menos estable


Dise o convencional1

Diseño convencional

  • Evitar:

    • Diana esté en un intrón

    • Los 5’ y 3’ de UTRs (untranslated regions)

    • Los primeros 75 - 100 pb des del codón de inicio

    • Secuencias con > 50% GC (30-70%)

    • Secuencias que contengan repeticiones internas

  • Comparar el candidato con marcadores de secuencia expresados en bases de datos públicas (ej BLAST) para asegurar la especificidad (IMPORTANTE)

  • Modificaciones químicas haciéndolos más estables

  • Modificar posición 2’ de ERI-1, una ribonucleasa que tiene una actividad 3' 5' exonucleasa que está implicada en la regulación y en la degradación de los siRNAs

  • La eficiencia debe ser > 90% a 1-20 nM

  • Recomendación: knockdown del gen con dos siRNAs independientes para controlar la especificidad del efecto del silenciamiento


Ventajas

Ventajas

  • Puede sustituir tres métodos: knock-out, dominantes negativos e inhibidores químicos

  • Disminuye tiempo, coste y aumenta la especificidad

  • Técnica fácil y rápida

  • Facilita los análisis sobre tratamientos nuevos para el cáncer, enfermedades inflamatorias o infecciosas

  • Se pueden realizar experimentos en cualquier tipo celular de interés

  • Se puede realizar in vivo e in vitro

  • La eficacia del sistema de interferencia radica en que RISC cataliza múltiples ciclos de interferencia in vivo


Desventajas

Desventajas

  • Estabilidad

  • Administración

  • Off-target effects (OTEs) Material foráneo por el SI: respuesta IFN

  • Genes con complementariedad incompleta son downregulados sin darse cuenta dando problemas en la interpretación de los datos

  • Los liposomas catiónicos muchas veces son tóxicos para la célula

  • Baja eficiencia de la transfección

  • Saturación del complejo RISC por un uso de múltiples siRNAs no funcionales

  • Para hacer el knockdown se necesitan dosis muy elevadas. OTE son dosis dependientes

  • Ninguno es 100% efectivo (eficiencia 50-90%)

  • Inactivos por tener un SNP o una mutación puntual en el sitio diana


En un futuro

En un futuro

  • Avance de la investigación biomédica

  • Descubrir funciones biológicas nuevas para comprender mejor los mecanismos de las enfermedades humanas

  • Tecnologías para aumentar la especificidad, estabilidad y el rendimiento real del silenciamiento

  • Mínimos efectos secundarios con el mayor silenciamiento específico

  • Tratamientos nuevos para el cáncer, enfermedades inflamatorias o infecciosas

  • Desarrollo de nuevas terapias génicas

  • Descubrimiento y desarrollo de nuevos fármacos

  • Nueva clase de fármacos


Bibliograf a

Bibliografía

  • Design of active small interfering RNAs. Andrew S Peek & Mark A Behlke.

    Current Opinion in Molecular Therapeutics 2007 9(2):110-118

  • A Species of Small Antisense RNA in Posttranscriptional Gene Silencing in Plants. Andrew J. Hamilton. Science 286, 950 (1999)

  • Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Sayda M. Elbashir, Jens Harborth, Winfried Lendeckel, Abdullah Yalcin, Klaus Weber & Thomas Tuschl. Nature vol 411 24 may 2001

  • siDirect: highly effective, target-specific siRNA design software for mammalian RNA interference Yuki Naito, Tomoyuki Yamada, Kumiko Ui-Tei, Shinichi Morishita Kaoru Saigo1 Nucleic Acids Research, 2004, Vol. 32

  • Silenciamiento por RNA: de la regulación de la expresión génica a la defensa antiviral Daniel Barajas, Felix A. Atencio Biojournal.net

  • Nanoparticles and siRNA-Partners on the Pathway to New Cancer Therapies Joe Alper NCI Alliance for Nanotechnology in Cancer August 2006

  • Predicting siRNA efficiency W. Li and L. Cha Cell. Mol. Life Sciences Birkhuser Verlag, Basel, 2007


Bibliograf a1

Bibliografía

  • RNA interference: from gene silencing to gene-specific therapeutics Ray K.M. Leung, Paul A. Whittaker Pharmacology & Therapeutics 107 (2005) 222 – 239

  • Selecting effective siRNA sequences by using radial basis function network and decision tree learning Shigeru Takasaki*, Yoshihiro Kawamura and Akihiko Konagaya BMC Bioinformatics 2006, 7(Suppl 5):S22

  • Rational siRNA design for RNA interference Angela Reynolds, Devin Leake, Queta Boese Nature Biotechnology Volume 22 Number 23 March 2004

  • Design of antisense oligonucleotides and short interfering RNA duplexes (siRNA) targeted to BCL6 mRNA: Towards rational drug development for specific lymphoma subsets Anna Kalota a, J.B. Opalinska Blood Cells, Molecules, and Diseases 38 (2007) 199–203

  • http://www.encuentros.uma.es/encuentros101/rnai.htm

  • http://es.wikipedia.org/wiki/SiRNA

  • http://www.alnylam.com

  • http://www.prnewswire.co.uk/cgi/news/release?id=159958

  • http://www.dharmacon.com/

  • http://www.nature.com/focus/rnai/animations (vídeo)


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