Ruolo della Struttura della Cromatina nella Regolazione Genica
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Ruolo della Struttura della Cromatina nella Regolazione Genica . Struttura della Cromatina nelle sequenze codificanti del gene. Struttura della Cromatina nel promotore. Ruolo del nucleosoma nel bloccare l’accesso al promotore. I nucleosomi possono essere spostati?. +. Fibre di

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Ruolo della struttura della cromatina nella regolazione genica

Ruolo della Struttura della Cromatina nella Regolazione Genica

  • Struttura della Cromatina nelle sequenze codificanti del gene.

  • Struttura della Cromatina nel promotore.

  • Ruolo del nucleosoma nel bloccare l’accesso al promotore.

  • I nucleosomi possono essere spostati?


Ruolo della struttura della cromatina nella regolazione genica

+

Fibre di

Cromatina

Fibra cromatinica

da 30nm

Fibra cromatinica

da 10nm (collana di

perle)

Istoni core altamente

acetilati (specialmente

H3 ed H4)

N-Termini carichi

(legano il DNA di

nucleosomi adiacenti)

  • Alti livelli di istone H1

  • Trascrizione OFF

  • Ridotti livelli di istone H1

  • Trascrizione ON


Ruolo della struttura della cromatina nella regolazione genica

DOMINI CROMATINICI

  • EUCROMATINA:

  • Cromatina decondensata, trascrizionalmente attiva.

  • Replicazione precoce.

  • Iperacetilazione degli istoni

  • Ricca in metH3K4, 36 e 79

  • Geni eucromatici sottoposti a silenziamento sono ricchi in:

  • meH3K9, 3meH3K27, meH4K20


Ruolo della struttura della cromatina nella regolazione genica

  • ETEROCROMATINA:

  • Cromatina altamente compattata e silenziata trascrizionalmente.

  • Replicazione tardiva.

  • Ipoacetilazione degli istoni

  • Alti livelli di metilazione.

  • Costitutiva: adiacente al centromero e contenente grandi blocchi

  • di ripetizioni Alpha Satellite nell’uomo (Major Satellite

  • repeats in topo)

  • Silenziata irreversibilmente

  • Ricca in 3meH3K9 + meH3K27 + 3meH4K20

  • Facoltativa: E’ silenziata reversibilmente e può tornare ad essere

  • attiva (Esempio: cromosoma X femminile)

  • Ricca in 2meH3K9 + 3meH3K27 + meH4K20


Ruolo della struttura della cromatina nella regolazione genica

Relazione tra stato della cromatina ed espressione genica

  • Regola generale:

  • L’organizzazione nucleosomale nelle regioni a monte dei geni è correlata

  • negativamente con l’espressione dei geni a valle.

  • L’attivazione genica si correla di solito con una riduzione dell’occupanza

  • nucleosomale nei promotori.

Studi di Epigenetica hanno dimostrato anche il contrario.

La cromatina può adottare diverse conformazioni con proprietà biochimiche e

biofisiche distinte.

Regioni genomiche diverse mostrano differenze nella compattezza globale e

nell’accessibilità ad enzimi modificanti.


Ruolo della struttura della cromatina nella regolazione genica

  • Studi fatti sulla frazione di cromatina “aperta” isolata da cellule e analizzata

  • con microarrays hanno mostrato che:

  • Esiste una correlazione tra cromatina aperta e densità genica

  • es.: sui cromosomi 17, 19 e 22, più ricchi di geni e di cromatina aperta,

  • si forma un loop decondensato nel nucleo interfasico

  • MA

  • 2) Non c’è sempre correlazione tra stato aperto della cromatina e livelli di

  • espressione genica

  • I GENI POSSONO A VOLTE ESSERE ATTIVI NELLEREGIONI CONDENSATE

  • E INATTIVI NELLE REGIONI DECONDENSATE


Ruolo della struttura della cromatina nella regolazione genica

HS = Siti di ipersensibilità alla DNasi I

  • I siti ipersensibili alla DNasi I sono circa 100 volte più sensibili a questo enzima

  • di un normale sito cromatinico

  • Quasi ogni gene attivo contiene un tale sito di ipersensibilità, a volte più

  • di uno, nella regione del promotore

  • In SV40 si ha un’interruzione nell’organizzazione nucleosomica visibile al

  • microscopio elettronico di circa 350bp che corrisponde alla regione di

  • ipersensibilità


Ruolo della struttura della cromatina nella regolazione genica

  • SITI IPERSENSIBILI ALLA DNasiI

  • Possono rappresentare:

  • Regioni occupate contemporaneamente da istoni e fattori di

  • trascrizione – MMTV

  • Regioni dove gli istoni sono stati rimossi dal DNA- geni per

  • la β-globina, SV40


Ruolo della struttura della cromatina nella regolazione genica

Problema importante: Come avviene l’esclusione dei nucleosomi dalle

regioni Ipersensibili?

Ipotesi: Il sito ipersensibile viene riconosciuto da proteine specifiche

che escludono la formazione del nucleosoma


Ruolo della struttura della cromatina nella regolazione genica

Come si dimostra che i nucleosomi sono esclusi da una regione?

Mappatura di siti ipersensibili alla DNasi I

Nuclei isolati

DNA nudo

Si usano quantità molto piccole di DNAsi I in modo da avere solo circa un

taglio per molecola

Questo permette di tagliare solo il DNA nudo e non quello nucleosomale.

La cromatina viene poi deproteinizzata

RI

RI

Sonda

Taglio con EcoRI, elettroforesi e blot.


Ruolo della struttura della cromatina nella regolazione genica

Domini cromosomici definiti tramite la DNAsi I

Eritrociti di pollo (cellule

adulte):

Un gene diventa suscettibile

all’enzima nei tessuti in cui

è maggiormente espresso.

L’ipersensibilità definisce

uno stato di predisposizione

alla trascrizione.


Ruolo della struttura della cromatina nella regolazione genica

Gli esperimenti con la DNasiI hanno permesso di definire e provare

L’esistenza di DOMINI intesi come unità di trascrizione funzionali

(che contengono geni attivi).


Ruolo della struttura della cromatina nella regolazione genica

Tipicamente siti di ipersensibilità alla DNasi I sono riscontrati

su sequenze regolative come gli ENHANCER e i PROMOTORI,

ma anche su altri elementi più complessi

LCR

ISOLATORI

Questi elementi delimitano e definiscono dei domini funzionali

e presentano ipersensibilità piuttosto estesa alla DNasi I (a volte

su regioni di parecchie Kb).


Ruolo della struttura della cromatina nella regolazione genica

LCR: Locus Control Region

  • LCR: è un cluster di siti ipersensibili alla DNAsi I scoperto nel locus

  • genico delle β-globine e necessario per la loro espressione.

  • Scoperto a causa dell’inattivazione di transgeni (globine) che mancano

  • di queste sequenze.

  • Tutti i siti devono essere presenti per l’attivazione, ma il loro effetto

  • è cooperativo, la delezione di ognuno riduce debolmente la trascrizione

  • del locus.

  • Ogni gene è poi regolato ulteriormente dai propri controlli specifici,

  • e questo dipende dai fattori di trascrizione gene-specifici di volta in

  • volta attivi.

  • La sua delezione ripristina la resistenza alla DNAsi I.

  • Probabilmente funziona rendendo la cromatina di questa regione

  • più aperta.


Ruolo della struttura della cromatina nella regolazione genica

LOCUS CONTROL REGION (LCR)

  • E’ un sito regolatore di legame al DNA lontano dal promotore

  • indipendente dall’enhancer.

  • Di solito lega sia fattori ubiquitari che tessuto specifici. Nel

  • locus delle globine ogni sito HS contiene lo stesso tipo di

  • siti di legame per gli stessi fattori di trascrizione.

  • Rende un promotore attivo a prescindere dalla sua posizione

  • nella cromatina.

  • Funziona aprendo la struttura nucleosomale del promotore,

  • in modo che i fattori possono legarsi.

  • Parecchi loci presentano elementi LCR a delimitare i loro confini:

  • b-globine umane, di pollo e di topo

  • Locus Th2 delle citochine umane

  • Locus GH (growth hormone; comprende GHN, CSA, CSB, CSL e GHV)


Ruolo della struttura della cromatina nella regolazione genica

LCR funziona attraverso una specifica

organizzazione cromatinica che viene

stabilita durante la replicazione.

E’ necessario che LCR sia in continua

comunicazione con gli elementi regolativi

del cluster, cioè con gli enhancer e

promotori dei singoli geni

E’ probabile che questo assetto cromatinico

si formi quando ha luogo

il differenziamento della linea eritroide.

Il meccanismo prevede l’ancoraggio a proteine

del “nucleoscheletro”. Probabilmente

questo avviene tramite fattori che legano

LCR e contemporaneamente fattori che

legano gli enhancer dei singoli geni (GATA e

motivi di legame CACC).

Gli elementi regolativi vengono tutti ancorati

e le sequenze interposte formano anse con un

meccanismo diverso da quello che riguarda

le anse formate sulla matrice nucleare.

RF = Replication Factory


Ruolo della struttura della cromatina nella regolazione genica

Come funziona l’elemento LCR?

LCR

Acetylase

Pol II

Una delle possibilità è che siano coinvolti sistemi di rimodellamento della

cromatina, associati ai punti di ancoraggio delle anse


Ruolo della struttura della cromatina nella regolazione genica

32Kb

In topo:

NF-E2 e GATA-1 reclutano

CBP (CREB-binding protein-

acetiltrasferasi) sull’LCR

Si ha acetilazione sull’LCR e

a valle fino al distale 3’HS1

In human

Pit1- attivatore trascrizionale

del locus presente su LCR e su

promotore.

Delezione di Pit1 porta a forte

riduzione dell’acetilazione e

dell’espressione di GHN


Ruolo della struttura della cromatina nella regolazione genica

Struttura cromatinica

“predisposta”

Struttura cromatinica

“attiva” ACH

  • Tecniche recenti hanno mostrato la stretta associazione spaziale

  • tra i siti HS e i geni trascritti

  • Si tratta di un’associazione dinamica dipendente dallo stadio

  • dello sviluppo

Fattori della linea eritroide contribuiscono alla formazione della

struttura ACH

EKLF (Erythroid kruppel-like factor)

GATA-1

FOG-1 (friend of GATA)


Ruolo della struttura della cromatina nella regolazione genica

“predisposta”

in tutte le cellule

della linea T

“predisposta”

solo in cellule T mature

ed NK

  • Nel caso del locus Th2 sono i promotori a realizzare la struttura ad ansa.

I fattori GATA-3 e STAT6 sono responsabili di questa struttura


Ruolo della struttura della cromatina nella regolazione genica

Gli Isolatori: scs-scs’ – specialized chromatin structures

Sono elementi che posti tra un enhancer e un promotore impediscono

all’enhancer di agire sul promotore.

Si può dire che delimitano un dominio.

L’isolatore di Hsp70 in Drosophila lega un fattore BEAF-32 (di cui

esistono due isoforme, A e B, prodotte per splicing alternativo) che

viene evidenziato nelle interbande dei cromosomi politenici.

Un’altra proteina che lega scs è SBP, sia in vitro che in vivo.

Anche il sito HS4 dei geni della -globina di pollo è un isolatore.

Hanno azione direzionale (vedi il trasposone gipsy di Drosophila).

Posti tra un gene attivo e l’eterocromatina schermano il gene dall’azione

silenziatrice dell’eterocromatina.


Ruolo della struttura della cromatina nella regolazione genica

Proteine che agiscono sull’Isolatore gypsy

su(Hw):

mutazioni in questo gene aboliscono la

capacità isolativa.

L’isolatore di gipsy contiene 12 siti di legame

per su(Hw).

mod(mdg4):

mutazioni di questo gene aumentano

l’efficienza dell’isolatore, ma esso perde

la direzionalità.

Interagisce con su(Hw) e impone direzionalità

alla capacità di su(Hw) di svolgere la funzione

isolatrice.


Ruolo della struttura della cromatina nella regolazione genica

Modelli di isolamento

Il modello dei domini lega l’organizzazione fisica del cromosoma

con le caratteristiche funzionali dell’isolatore.

L’isolatore delimita un dominio che favorisce l’interazione

produttiva di elementi all’interno del dominio ma preclude

l’interazione con elementi al di fuori di esso.


Ruolo della struttura della cromatina nella regolazione genica

Trascrizione della cromatina

Un’idea su come possa funzionare:

Girando intorno a un DNA-loop

Studitsky, Clark, Felsenfeld Cell 76, 371 (1994)


Ruolo della struttura della cromatina nella regolazione genica

TATA

TATA

TATA

TATA

Il Nucleosoma può bloccare l’accesso all’apparato trascrizionale

Esperimenti di Roeder mostrano che il nucleosoma può bloccare TBP,

fattori e polimerasi II. DNA usato è quello di Adenovirus.

Fattori e pol II aggiunti

prima, poi gli istoni

Nucleosomi aggiunti prima

di TFIID, fattori e pol II

+

+

II

II

Trascrizione

Nessuna trascrizione

Questo può avvenire in seguito alla replicazione


Ruolo della struttura della cromatina nella regolazione genica

  • In un altro esperimento in vitro:

  • DNA 5S + TFIIIA → TRASCRIZIONE

  • Successiva aggiunta di ottameri istonici NON spiazza il

  • fattore di trascrizione

  • DNA 5S + ISTONI → + TFIIIA NESSUNA TRASCRIZIONE

Questo è stato chiamatoMODELLO DELL’ACCAPARRAMENTO


Ruolo della struttura della cromatina nella regolazione genica

PROMOTORE DI Hsp70 di Drosophila

DNA + fattore GAGA

Nel promotore inizialmente nucleosomizzato, appare una regione

di ipersensibilità alle nucleasi.

QUESTO AVVIENE ANCHE DOPO LA FORMAZIONE DEI

NUCLEOSOMI

ESISTE ANCHE UN MODELLO DINAMICO

Anche questo modello è formulato sulla base di esperimenti in vitro.

LA REGIONE DI IPERSENSIBILITA’ (probabilmente più libera dai

nucleosomi) METTE IN FASE I NUCLEOSOMI ADIACENTI


Ruolo della struttura della cromatina nella regolazione genica

STABILITA’ DEI SITI IPERSENSIBILI ALLA DNAsiI

  • FIBROBLASTI DI POLLO

  • TRASFORMAZIONE CON UN VIRUS ts

  • CRESCITA A TEMPERATURA PERMISSIVA

  • espressione delle globine

  • comparsa dei siti ipersensibili

  • PASSAGGIO A TEMPERATURA NON PERMISSIVA

  • disattivazione delle globine

  • i siti ipersensibili permangono per circa 20 generazioni

  • e poi scompaiono

Esistono meccanismi per l’instaurazione dell’ipersensibilità

e per il suo mantenimento?


Ruolo della struttura della cromatina nella regolazione genica

  • Analisi sulla struttura nucleosomale su larga scala in lievito ha rivelato

  • Numerose ORF e promotori di geni repressi hanno nucleosomi ben posizionati.

  • Quasi tutti i geni hanno DHS (siti ipersensibili alla DNasi) nei promotori

  • a prescindere dallo stato trascrizionale dei geni stessi.

  • LA PRESENZA DI DHS RIFLETTE “COMPETENZA” TRASCRIZIONALE

  • PIU’ CHE “ATTIVITA’” TRASCRIZIONALE


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