אפיון אוכלוסייה הטרוגנית של תאי הרג טבעיים ( NK )

1. אפיון אוכלוסייה הטרוגנית של תאי הרג טבעיים (NK) מנחה: פרופ' רמית מר גב' מיכל סימון אילנה ברוצקי מאיה טנסה

2. רקע תאורטי מערכת החיסון: • מולדת • נרכשת תאי NK שייכים למע' המולדת- אינם ספציפיים, מהווים קו הגנה ראשון.

3. בקרה: • סיגנלים משפעלים • סיגנלים מעכבים • איזון בין השניים תאוריית "העצמי החסר"- תאי NK משופעלים במגע עם תאים שאינם מבטאים MHC-CLASS I.

4. שיטת ניסוי חדשה, המתבססת על מעקב מיקרוסקופי רציף אחרי תאי NK בודדים שנזרעו בבאריות של פלטת סיליקון, מאפשרת להתבונן בסינפסה האימונולגית בין תא ההרג לתא המטרה ולאסוף נתונים ברמת הפרט הבודד (3).

5. מטרת הפרוייקט אפיון אוכלוסיית תאי NK ודפוסי הרג: • האם מדובר על אוכלוסייה הומוגנית/הטרוגנית? • במידה והטרוגנית- אילו סוגי תאים יש ומה מאפיין אותם? • האם יש קשר בין תנועת התא (מהירות, מרחק, זמני תגובה) לתגוביות התא ואחוזי ההרג? תאי NK מהווים חלק חשוב בהתמודדות מערכת החיסון עם תאים שעברו התמרה סרטנית ווריאלית בפרט, ועם פתוגנים בכלל. השאיפה היא שהבנת מנגנוני הפעולה ודפוסי ההרג של תאים אלו תעזור, בעתיד, לפתח טיפולים יעילים וממוקדים יותר כנגד סרטן ומחלות נוספות.

6. נתונים • הנתונים הופקו בסדרה של 3 ניסויי הדמייה ברזולוצייה גבוהה של תאי NK שנזרעו בבאריות פלטת סיליקון יחד עם תאי מטרה ומדיום. התאים צולמו במשך 12 שעות, במרווחים של 2 דקות. קובץ הנתונים הגולמי הכיל: • מיקום תא ה-NK במרחב בכל דגימה.. • זמני הדבקות לתא המטרה (conj_start), זמני סיום ההרג (conj_end) וזמני הנתקות סופית מתא המטרה (ADH_end). Onfelt B. Et al. (2010). Imaging Immune Surveillance of Individual Nature Killer Cells Confined in Microwell Array. PLoS ONE, vol.5, issue 11.

7. Onfelt B. Et al. (2010). Imaging Immune Surveillance of Individual Nature Killer Cells Confined in Microwell Array. PLoS ONE, vol.5, issue 11.

8. שיטות • עיבוד נתונים: • חישוב מהירויות- מהירות במשך כל מפגש ומהירות בין המפגשים וחישוב המרחקים שעבר התא בהתאמה (אלגוריתם במטלב). • חישוב הסתברויות וממוצעים של מאפייני התאים- מס' אינטרקציות, אחוזי הרג, זמני תגובה, מהירות וכו' ויצירת גרפים על סמך התוצאות. • חלוקת התאים לקבוצות דומות על ידי אשכול היררכי- נלקחו בחשבון תאים שעשו לפחות מפגש אחד ותאים שהרגו לפחות פעם אחת (אלגוריתם במטלב). • תוכנות: • IBM SPSS Statistics 21 • Microsoft Office- EXCEL 2007 • MATLAB, R2013b (8.0.0.783)

9. סכמת עבודה

10. בניית קבצי נתונים ב-SPSS: נתונים לפי תאים ונתונים לפי מפגשים. • שימוש במבחנים סטטיסטיים (מבחן t • לשני מדגמים בלתי תלויים, מבחן ספירמן, מתאם פירסון, רגרסיה:לינאית ולוגיסטית) כדי למצוא קשרים בין המשתנים. המבחן נבחר לפי סוג המשתנה. • חישוב הסתברויות, ממוצעים וכו' (סטטיסטיקה תיאורית) עבור פילוחים שונים של קבוצות תאים (לא הגיבו, לא הרגו, הרגו). • שימוש במבחנים סטטיסטיים (ANOVA, רגרסיה לוגיסטית) למציאת קשר בין קבוצות האשכול. • עיבוד נתונים סטטיסטי

11. אשכול הררכי: (140 תאים, i>0 ). האשכול התבסס על חישוב המרחק האוקלידי בין 5 תכונות: מס' אינטרקציות, מהירות ממוצעת, משך התגובה, מרחק כולל ואחוז ההרג. • יצרנו 3 אשכולים: חלוקה ל- 3, 7 ו- 20 קבוצות תאים. • האשכול נבנה לפי פונקציית linkage עם המרחק הממוצע של כל תא עפ"י חמשת התכונות הנ"ל. • חלוקת כל התאים ע"י ה- dendrogram . • סיווג כל תא שנבדק לקבוצה הנכונה בכל אשכול • חישוב ממוצע לכל קבוצה עפ"י כל תכונה ועיבוד הנתונים מבחינה ביולוגית • בדיקת הטרוגניות:

12. ניתוח הנתונים בניסוי נבדקו 178 תאי NK. תרשים 2- התפלגות התאים לפי סוג האינטרקציה עם תאי המטרה. תרשים 1- התפלגות מספר האינטרציות של תאי ה-NK עם תאי המטרה. i- number of interactions; k- number of kills;

13. תרשים 3- הסתברות לאינטרקציות עבור תאי NK שהגיבו לפחות פעם אחת עם תא מטרה. 0.75

14. n- number of cells; i- number of interactions; k- number of kills; t1- time (min) till first interaction.

15. percent אין תקופת "חימום"/"חניכה" תרשים 4- אינטרקציית ההרג הראשונה של התאים. First kill interaction percent תרשים 5- מספר מפגשי ההרג של תאי NK. Total killing 0.82

16. K>1 K>2 Cells (%) K>4 K>3 Killing (%) תרשים 6- התפלגות אחוזי ההרג לפי מספר מפגשי הרג, החל מהמפגש השני.

17. תרשים 7- מס' המפגשים עם תאי מטרה אחרי שתא ה-NK הפסיק להרוג.

18. Kinetic priming מודלים להסברת הקינטיקה ה"מתפרצת" של תאי NK: • Search time model • Kinetic priming Choi PJ & Mitchison TJ (2013) Imaging burst kinetics and spatial coordination during serial killing by single natural killer cells. PNAS.1221312110.

19. 0.78 תרשים 8- כמה מפגשי הרג יצרו התאים שהפסיקו להרוג בבת אחת.

20. תרשים 9-התפלגות ההרג בכל מפגש. כחול- מס' האינטרקציות המפגש. אדום- תאים שהרגו במפגש, ירוק- תאי הרג "סדרתיים", שהרגו גם בכל המפגשים הקודמים.

21. תרשים 10- השוואת זמנים בין תאים שהרגו לתאים שלא הרגו כלל.

22. אין הבדל מובהק באחוזי ההרג- כללי ובמפגש ה-1 יותר אינטרקציות ויותר הרג כולל interactions % תרשים 11- ממוצע אינטרקציות (<i>), ממוצע הרג כולל (<k>), אחוז הרג כולל ממוצע(<k%>) ואחוז הרג ממוצע במפגש הראשון (k1%) עבור כל קטגוריית זמן. קו שחור, פינה שמאלית עליונה- מספר תאי NK בכל קטגוריה.

23. תרשים 12-זמני ההקשרות של תאי NK לתאי המטרה, בחלוקה לתאים שהרגו/לא הרגו.

24. % תרשים 13 - אחוזי החפיפה בין מפגשי הרג, החל מהפגש השני. סגול בהיר- חפיפה בין זמני המפגשים. סגול כהה- אין חפיפה בין הזמנים, זמן ממוצע (דקות) עד לתחילת האינטרקציה הבאה).

25. number of interactions/speed (μm/min)/ killing (%) לפי אשכול 3- מי שהרג יותר (%)- פחות אינטרקציות ומהירות, מרחק ומשך מפגש קצרים יותר. • . תרשים 15 אשכול ראשוני, 3 קבוצות. בוצע על 140 תאים שהגיבו. תרשים 16- ערכים ממוצעים של מספר אינטרציות, מהירות ואחוז הרג עבור כל קבוצה באשכול. time (min) תרשים 18- מרחק כולל במהלך המפגשים, עבור כל קבוצה באשכול. תרשים 17- משך כולל של מפגשים, עבור כל תא באשכול.

26. סימולציה * הרצנו סימולציה במטלב- היא התמקדה בתאים הטרוגניים ללא סטימולציה("חימום ראשוני") , שיכולים להרוג כבר מהמפגש הראשון. • הסימולציה הנ"ל לא בחנה את ההרג כתלות בהיסטוריה. • נבדקו התפלגות הזמנים עד המפגש, ומשך המפגשים. תחילה חושבה ההסתברות המצטברת של הזמנים עד המפגש . לאחר מכן עשינו קומבינציות בין ההסתברות להרג לבין מקסימום מפגשים סימולטניים. • תוצאות הסימולציה לא תאמו את תוצאות הניסוי- תבנית ההרג בניסוי הייתה שונה ממסקנות הסימולציה; בסימולציה נספרו הרבה יותר מפגשים לכל תא מאשר בניסוי עצמו, כמו כן לא נמצאו "רוצחים סידרתיים".

27. To be continued.. סימולציות: התפלגות הומוגנית: • התפלגות הומוגנית- לא מתאים לנתונים. • התפלגות הומוגנית + במפגש הראשון פחות הרג- לא מתאים לנתונים. • התפלגות הומוגנית + kinetic priming- יש לבחון. הטרוגנית: • יש תלות בהיסטוריה, לפחות של המפגש האחרון- יש לבחון. • סוגי תאים עם מאפיינים שונים- יש לבחון. הנחות: • t1-ארוך. • .

28. דיון הנתונים שהתקבלו מצביעים על דפוס של "הרג סדרתי": • תאים שהרגו עשו זאת כבר מהאינטרקציה הראשונה- ללא צורך בתקופת "חימום" או "חניכה". • התאים הללו יצרו אינטרציה ראשונה מהירה יותר. • רוב התאים הללו הם בעלי 100% הצלחה- הרגו בכל מפגש שיצרו. • הסיכוי להרג במפגש i כאשר במפגש הקודם היה הרג הוא בסביבות 90%. רק תאים בודדים התחילו להרוג באינטרקציה שאינה הראשונה וללא היסטוריית הרג קודמת. • 0.6 מהתאים שהרגו הפסיקו ליצור אינטרקציות אחרי מספר מפגשי הרג- רוב התאים בקבוצה זו הרגו עד 3 פעמים. • בחנו התפלגות הטרוגנית ללא קשר להיסטוריה באמצעות הסימולציה- נמצא שתוצאותיה לא תואמות את תוצאות הניסוי; ראינו הרבה יותר מפגשים לכל תא מאשר בניסוי, לא נמצאו "רוצחים סדרתיים".

29. תודות • לראש המעבדה, פרופ' רמית מר- על ההדרכה והעזרה, על הלגיטימציה לנסות ולתהות ולגשש את דרכינו הראשונה במחקר מדעי; וכמובן- על הסבלנות וההבנה. • למיכל סימון, על ההדרכה והליווי (מזל טוב!!!). • לד"ר גתית לביא-שחף, על העזרה עם הניתוחים הסטטיסטיים. • לישי פיקמן, על העזרה הרבה בהכנת וניתוח האשכולים. • לניסים פנחס, על ההצעות והרעיונות והמוכנות לשבת איתנו ולתרום מהניסיון. • לכל חברי המעבדה- על ההערות וההארות הבונות, לשיפור המצגת הראשונית.