第八节  研究
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第八节 研究 DNA 与蛋白质相互作用的方法 PowerPoint PPT Presentation


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第八节 研究 DNA 与蛋白质相互作用的方法. 8.1 凝胶阻滞试验( Gel Retardation Assay ) 原理. 又叫做 DNA 迁移率变动试验,是 80 年代初出现的用于在 体外研究 DNA 与蛋白质相互作用 的一种 特殊的凝胶电泳技术 。简单、快捷,是当前被选作分离纯化特定 DNA 结合蛋白质的一种典型的实验方法。 EMSA ( Electrophoretic Mobility Shift Assay )

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第八节 研究 DNA 与蛋白质相互作用的方法

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Presentation Transcript


Dna

第八节 研究DNA与蛋白质相互作用的方法

8.1 凝胶阻滞试验(Gel Retardation Assay)

原理

又叫做DNA迁移率变动试验,是80年代初出现的用于在体外研究DNA与蛋白质相互作用的一种特殊的凝胶电泳技术。简单、快捷,是当前被选作分离纯化特定DNA结合蛋白质的一种典型的实验方法。

EMSA ( Electrophoretic Mobility Shift Assay )

在凝胶电泳中,由于电场的作用,裸露的DNA朝正电极移动的距离是同其分子量的对数成反比,如果DNA分子结合上一种蛋白质,那么由于分子量加大,在凝胶中的迁移作用便会受到阻滞,朝正电极移动的距离也就相在缩短了。所以当特定的DNA片段同细胞提取物混合之后,若其在凝胶电泳中的移动距离变小了,这就说明它已同提取物中的某种特殊蛋白质分子发生了结合作用。


Dna

凝胶阻滞试验方法

用放射性同位素标记待检测的DNA片段(亦称探针DNA

加DNA结合蛋白

同细胞蛋白质提取物一道温育,于是便有可能形成DNA一蛋白质复合物

将它加样到非变性的凝胶中,在控制使蛋白质仍与DNA保持结合状态的条件下进行电泳分离

如果细胞蛋白质提取物中不存在可同放射性标记的探针DNA结合的蛋白质,那么所有放射性标记都将集中出现在凝胶的底部;反之,将会形成DNA一蛋白质复合物,由于凝胶阻滞的缘故,其特有的放射性标记的探针DNA条带就将滞后出现在较靠近凝胶顶部的位置。所以也称这种试验为条带阻滞试验(band retardation assay)。

应用放射自显影技术显现具放射性标记的DNA条带位置


Dna

凝胶阻滞试验用途

鉴定特殊细胞提取物中,是否存在可同放射性标记的探针DNA结合的蛋白质分子(比如特异的转录因子等)

研究发生此种结合作用之精确的DNA序列的特异性:其办法是在DNA一蛋白质结合反应体系中,加入超量的非标记竞争DNA。如果竞争同一种蛋白,由于竞争DNA与探针DNA相比是极大超量的,绝大部分蛋白质都会被其竞争结合掉而使探针DNA处于自由状态,自显影图片上不出现阻滞的条带,相反,如果不竞争同一蛋白,探针DNA仍与特定蛋白复合,呈现阻滞的条带。

使用竞争DNA,可间接阐明体内的DNA与蛋白质的相互作用。如,使用一种具有与已知转录因子结合位点的竞争DNA,就可以判断检测到的蛋白质是否属于此类转录因子,或是与之相关的其它转录因子;如果事先引入突变,可以检测突变对其与转录因子结合作用的影响。


Dna

SND1, a NAC Domain Transcription Factor, a Key Regulator of Secondary Wall Synthesis in Fibers of Arabidopsis

  • NAC (NAM, ATAF1,2, CUC2)


Snd1 specifically expressed in interfascicular fibers and xylem cells

SND1 Specifically expressed in InterfascicularFibers and Xylem Cells


Myb46 gene is predominantly expressed in fibers and vessels in arabidopsis inflorescence stems

MYB46 Gene Is Predominantly Expressed in Fibers andVessels in Arabidopsis Inflorescence Stems


Expression of the myb46 gene is regulated by snd1

Expression of the MYB46 Gene Is Regulated by SND1


Snd1 could bind to myb46 promoter

SND1 could bind to MYB46 Promoter


Dna

由“钓鱼”引发“钓蛋白”


Yeast one hybrid

A

B

X

C

O

A

V

R

D

B

A

O

F

P

A

Z

M

A

A

Q

Yeast One Hybrid

Reporter

Bait DNA

Expressed Protein Library

Prey


Dna

  • clone element into a reporter construct and make stable yeast strain

  • transfect aliquots of cDNA expression libraries that have fragments of DNA fused to yeast activator

  • if the fusion protein binds to your element then the reporter gene will be activated


Prolamin box

Prolamin-box及其结合蛋白


Systematic evolution of ligands by exponential enrichment selex

指数富集配体系统进化(systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX)

  • SELEX技术起源于20世纪90年代初

  • 通过该技术可以自起始寡核酸库中获得能够与靶分子(蛋白或小分子)具有高亲和力的特异性核酸序列

    SELEX技术操作流程包括:

    (1)人工合成库容量为1014-1015的随机核酸库,每条序列均包括两端的恒定序列区及位于序列中端的随机序列区,其中随机序列区长度为20-40个碱基;

    (2)与靶物质转录因子蛋白相作用,形成核酸-转录因子蛋白复合体;

    (3)将不能与靶物质结合的核酸序列分离出来;

    (4)复合体中的核酸序列利用PCR反应进行扩增;

    (5)重复核酸-转录因子蛋白复合体结合-洗脱-分离过程,直至获得高度富集的序列;

    (6)将经过筛选得到的核酸序列进行测序,序列拼接比对后确定能够与转录因子结合的保守序列


Opaque2

Opaque2 体外进化实验


8 2 dnasel

8.2 DNasel足迹试验

尽管凝胶阻滞试验能够揭示出在体内发生的DNA与蛋白质之间相互作用的有关信息,然而它却无法确定两者结合的准确部位。

要解答这个问题,则需要应用 DNasel足迹试验(footprinting assay)。它是一类用于检测与特定蛋白质结合的DNA序列的部位及特性的专门的实验技术。


Dnasel

DNasel足迹试验过程

  • 首先是将待检测的双链DNA分子用32P作末端标记,并用限制酶去掉其中的一个末端,得到只一条链单末端标记的双链DNA分子

  • 体外同细胞蛋白质提取物混合。待二者结合之后,再加入少量的 DNasel(它可沿着靶 DNA作随机单链切割)消化DNA分子,并控制酶的用量使之达到平均每条链只发生一次磷酸二脂键的断裂。如果蛋白质提取物中不存在与DNA结合的特异蛋白质,经DNasel消化之后便会产生出距放射性标记末端1个核苷酸、2个核苷酸、3个核苷酸等一系列前后长度均仅相差一个核苷酸的、不间断的、连续的DNA片段梯度群体。


Dna

  • 从此混合物中除去蛋白质之后,将DNA片段群体加样在变性的DNA测序凝胶中进行电泳分离,经放射自显影,便可显现出相应于DNasel切割产生的不同长度DNA片段组成的序列梯度条带。但是,如果有一种蛋白质已经结合到DNA分子的某一特定区段上,那么它就将保护这一区段的DNA免受DNasel的消化作用,因而也就不可能产生出相应长度的切割条带。所以在电泳凝胶的放射自显影图片上,相应于蛋白质结合的部位是没有放射标记条带的,出现了一个空白的区域,人们形象地称之为“足迹” 。


Dna

足迹试验的优点

形象地展示出一种特殊的蛋白质因子同特定DNA片段之间的结合区域。

如果使用较大的DNA片段,通过足迹试验便可确定其中不同的核苷酸序列与不同蛋白质因子之间的结合位点的分布状况。

如同凝胶阻滞试验一样,也可以加入非标记竞争DNA,来消除特定的足迹,据此确定其核酸序列的特异性。


Dnasel1

DNasel足迹试验发展

目前还出了若干种其它类型的足迹试验。例如,自由羟基足迹试验及菲咯琳铜足迹试验,硫酸二甲脂(DMS)足迹试验等。

硫酸二甲脂(DMS)足迹试验。它所依据的原理是,DMS能够促进DNA中裸露的G甲基化,而六氢吡啶又会对甲基化的G残基作特异的化学切割。假如有一种蛋白质同DNA分子中的某一区段结合,在它的保护下,区域内的G免受六氢吡啶的切割,于是在DNA片段的序列梯中,便不存在具这些G残基末端的DNA片段,故出现个空白区域,此即通常所说的足迹。

与其它足迹试验不同,由于DMS足迹试验中被切割的是G残基,因此可用来鉴定同转录因子蛋白质结合的DNA区段中的特异碱基。


Dna

8.3 甲基化干扰试验

应用甲基化干扰试验(methvlation interference assay)技术,可以检测靶DNA中特异G残基的优先甲基化对尔后的蛋白质结合作用究竟会有什么效应,从而更加详细地揭示DNA与蛋白质之间相互作用的模式。


Dna

甲基化干扰试验的具体操作

先用硫酸二甲脂(DMS)处理靶DNA,控制反应条件,使平均每条DNA分子只有一个G甲基化,而后将这些局部甲基化的DNA群体同含有DNA结合蛋白的适当的细胞提取物一道温育,并作凝胶阻滞试验。经电泳分离之后,从凝胶中切取出具有结合蛋白质的DNA条带和没有结合蛋白质的DNA条带,并用六氢吡啶处理之,于是甲基化的G残基被切割,非甲基化的G残基则不被切割。显而易见,如果某个G因甲基化而不与蛋白质结合,那么六氢吡啶对这个甲基化G残基的切割作用,就只能在没有同蛋白质结合的DNA分子上表现出来。相反地,如果一个特殊的G残基在DNA与蛋白质的结合中不起作用,那么六氢吡啶对这个G残基的切割作用,则在同蛋白质结合的DNA分子及不同蛋白质结合的DNA分子中均可观察到(图2-44)


Dna

甲基化干扰试验的用途

甲基化干扰试验不仅可以用来研究蛋白质与G残基之间的联系,而且同样也可以用来研究DNA结合蛋白质与结合位点中的腺嘌呤A残基之间的联系作用。

头一个办法是使所有的嘌呤残基甲基化,以便同时研究甲基化的G和A残基对蛋白质与DNA结合的干扰效应。

第二种办法是使用焦碳酸二乙脂(DEPC)特异性修饰A,而使之易受六氢吡啶的切割作用。对于研究诸如像具有相对少数G残基的八聚体基序(例如 OCt-1,OCt-2等,它们可与八聚体结合蛋白质结合)这样的序列而言,这些甲基化干扰试验技术具有特别的价值,因为只要研究G残基的甲基化干扰,就可获得有用的信息。


Dna

DMS化学干扰的主要局限性

它只能使G和A残基甲基化,而不能使T和C残基甲基化。尽管如此,它仍不愧为足迹试验的一种有效的补充手段,可以鉴定足迹区段中DNA与蛋白质相互作用的精确位置。


Dna

8.4 体内足迹试验

上面所讨论的这三种方法有一个共同的不足之处,即它们都是在体外进行的试验。因此人们自然会问,这些结果能够确切地反映活细胞内发生的DNA一蛋白质相互作用的真实情况吗?为了解答这个问题,科学工作者又设计出了一种体内足迹试验体系。然而究其实质而言,这种技术无非是体外DMS足迹试验的一个变种而已。


Dna

体内足迹试验的方法

用有限数量的化学试剂DMS处理完整的游离细胞,并使其渗透到细胞内的浓度恰好导致天然染色质DNA中的G残基发生甲基化。

而后从这些细胞中提取DNA,并加入六氢吡啶作体外消化。

同体外足迹试验一样,能同某种特殊蛋白质因子结合的DNA区段,其上的G残基就不会被DMS甲基化,因而也就不会被六氢吡啶所切割。

同对照的体外裸露DNA所形成的序列作比较,就会发现由完整的活细胞染色质DNA形成的序列中,缺少了G残基没有被切割的相应条带(图2-45)。


Dna

体内足迹试验优缺点

显而易见,与应用克隆DNA片段所作的体外足迹试验的结果相比,经体内足迹试验从染色质总DNA中所获得的任何一种特异DNA的数量,都是微不足道的。因此,有必要通过PCR扩增特异的靶DNA,以获得足够数量的DNA样品。如今体内足迹试验已发展成为研究在完整的活细胞内,DNA一蛋白质结合位点及检测结合位点中碱基突变效应的一种极有效的手段。


Dna

  • 应用凝胶阻滞试验、DNasel足迹试验、甲基化干扰试验,以及体内足迹试验等多种用于研究DNA与蛋白质相互作用的基本实验手段

  • 有助于深入地探讨基因启动子元件的结构与功能,及其与蛋白质转录因子之间相互作用的有关细节;

  • 揭示mRNA转录超始和终止的分子本质与主要步骤;

  • 阐明在发育过程中基因表达调节的时空特异性;

  • 以及外源基因在转基因植株中表达的分子机理等等。

  • 这些研究结果,将为我们提供大量重要的信息,以最终弄清基因表达调节的真实内容。


Dna

重要知识点:

1、研究DNA与蛋白质相互作用的方法有哪些?2、凝胶阻滞试验原理是什么?

3、用图示的方法说明DNasel足迹试验的过程。

4、甲基化干扰试验有什么用途?

5、什么是体内足迹试验?


Dna

第九节DNA的提取与纯化

由于提取DNA的目的、种类、所用的生物、组织材料、实验条件等不同,DNA的提纯有很多方法。其中最常用的是碱抽提法。


Dna

磷酸

脱氧核糖

含氮碱基

脱氧核苷酸

DNA的化学组成

元素组成:

C H O N P

基本单位:

脱氧核苷酸

P

含氮碱基

脱氧核糖


Dna

A

C

腺膘呤脱氧核苷酸

胞嘧啶脱氧核苷酸

G

T

鸟瞟呤脱氧核苷酸

胸腺嘧啶脱氧核苷酸

组成脱氧核苷酸的碱基:

腺嘌呤(A)鸟嘌呤(G)

胞嘧啶(C)胸腺嘧啶(T)

因此,脱氧核苷酸也有4种   


Dna

  • 四种构成DNA的碱基:

    腺嘌呤鸟嘌呤 胞嘧啶 胸腺嘧啶

    构成RNA的特殊碱基——尿嘧啶


Dna

  • 脱氧核糖核苷酸的组成:

    +

脱氧核糖

脱氧核苷

碱基

磷酸

脱氧核糖核苷酸


Dna

  • 核苷酸的组成:

+

核糖

碱基

核糖核苷

磷酸

核苷酸


Dna

DNA的空间结构

放大

从图中可见DNA具有规则的双螺旋空间结构

DNA的结构模式图


Dna

DNA分子的结构特点

A

T

G

C

A

T

A

T

C

G

G

C

(1)DNA分子是由两条反向平行的脱氧核苷酸长链盘旋成双螺旋结构。

A

T

G

C


Dna

DNA分子的结构

小结

★化学组成:

一分子含氮碱基

一分子脱氧核糖

基本组成单位:四种脱氧核苷酸

一分子磷酸

两条脱氧核苷酸长链

★空间结构

碱基对

规则的双螺旋结构

氢键

碱基互补配对原则

★分子结构的多样性和特异性


Dna

DNA 分子的特性

DNA分子具有稳定性、多样性和特异性

稳定性:

DNA分子的双螺旋结构是相对稳定的。这是因为在DNA分子双螺旋结构的内侧,通过氢键形成的碱基对,使两条脱氧核苷酸链稳固的并联起来。另外,碱基对之间纵向的相互作用力也进一步加固了DNA分子的稳定性。各个碱基对之间的这种纵向的相互作用力叫做碱基堆积力。它是芳香族碱基π电子间的相互作用引起的。现在普遍认为碱基堆积力是稳定DNA结构的最重要因素。再有,双螺旋外侧负电荷的磷酸基团同带正电荷的阳离子之间形成的离子键,可以减少双链间的静电斥力,因而对DNA双螺旋结构也有一定的稳定作用。


Dna

多样性:

DNA分子由于碱基对的数量不同,碱基对的排列顺序千变万化,因而构成了DNA分子的多样性。例如,一个具有4000个碱基对的DNA分子所携带的遗传信息是44000种,即102408种。

特异性:

不同的DNA分子由于碱基对的排列顺序存在着差异,因此,每一个DNA分子的碱基对都有其特定的排列顺序,这种特定的排列顺序包含着特定的遗传信息,从而使DNA分子具有特异性。


Dna

1.核酸的两性性质及等电点

与蛋白质相似,核酸分子中既含有酸性基团(磷酸基)也含有碱性基团(氨基),因而核酸也具有两性性质。由于核酸分子中的磷酸是一个中等强度的酸,而碱性(氨基)是一个弱碱,所以核酸的等电点比较低。如DNA的等电点为4~4.5,RNA的等电点为2~2.5。


Dna

2.核酸的水解

(1)酸或碱水解

核酸分子中的磷酸二酯键可在酸或碱性条件下水解切断。

DNA和RNA对酸或碱的耐受程度有很大差别。例如,在0.1 mol/L NaOH溶液中,RNA几乎可以完全水解,生成2′-或3′-磷酸核苷;DNA在同样条件下则不受影响。这种水解性能上的差别,与RNA核糖基上2′-OH的邻基参与作用有很大的关系。在RNA水解时,2′-OH首先进攻磷酸基,在断开磷酯键的同时形成环状磷酸二酯,再在碱的作用形成水解产物。

(2)酶水解

生物体内存在多种核酸水解酶。这些酶可以催化水解多聚核苷酸链中的磷酸二酯键。

以DNA为底物的DNA水解酶(DNases)和以RNA为底物的RNA水解酶(RNases)。

根据作用方式又分作两类:核酸外切酶和核酸内切酶。

核酸外切酶的作用方式是从多聚核苷酸链的一端(3′-端或5′-端)开始,逐个水解切除核苷酸;核酸内切酶的作用方式刚好和外切酶相反,它从多聚核苷酸链中间开始,在某个位点切断磷酸二酯键。

在分子生物学研究中最有应用价值的是限制性核酸内切酶。这种酶可以特异性的水解核酸中某些特定碱基顺序部位。


Dna

3 核酸的紫外吸收

在核酸分子中,由于嘌呤碱和嘧啶碱具有共轭双键体系,因而具有独特的紫外线吸收光谱,一般在260nm左右有最大吸收峰,可以作为核酸及其组份定性和定量测定的依据。


Dna

大肠杆菌基因组DNA


Dna

一、质粒DNA的提取

分离质粒DNA的方法众多, 其依据是利用分子大小不同、碱基组成的差异以及质粒DNA的超螺旋共价闭合环状结构的特点来进行分离。目前常用的有碱变性抽提法、煮沸法、去污剂 (如Triton或SDS)裂解法、羧基磷灰石柱层析法、质粒DNA释放法、酸酚法等。


1 dna

1 碱裂解法提取大肠杆菌质粒DNA原理

◆碱裂解法由Birnboim和Doly设计并于1979年发表,基于染色体DNA与质粒DNA变性与复性的差异而达到分离目的。

◆在pH高达12.5的碱性条件下,染色体DNA的氢键断裂,双螺旋结构解开而变性,质粒DNA的大部分氢键也断裂,但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离。

◆当以pH4.6的KAc高盐缓冲液调节其pH至中性时,变性的质粒DNA又恢复原来的构型,保存在溶液中,而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构。

◆通过离心,染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。


Dna

plasmid DNA

Genomic DNA

The genomic DNA of E. coli: a single circular double-stranded DNA,

with the contour length about 850 times longer than the cell.


Dna

(1) 原理

变性

强碱

DNA双链

DNA单链

中性

复性

闭合环状的质粒DNA,在变性后不会分离,复性快;


Dna

染色体线性DNA和或有缺口的质粒DNA变性后双链分离,难以复性而形成缠绕的结构,与蛋白质—SDS复合物结合在一起,在离心的时候沉淀下去。

变性


Dna

(2)所用的试剂作用

①溶菌酶

能水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的-1,4糖苷键。

在碱性条件(pH>8)下有活性。

②葡萄糖

增加溶液的粘度,维持渗透压,防止DNA受机械力(震荡)的作用而降解。


Dna

③EDTA

Mg2+、Ca 2+的螯合剂,可抑制DNA酶的活性,防止DNA被酶降解。

④NaOH-SDS

NaOH:强碱,提供pH>12的碱性条件,使DNA双链变性。

SDS:离子型表面活性剂,溶解细胞膜蛋白和细胞内蛋白,并结合成“蛋白—SDS”复合物,使蛋白质(包括DNA酶)变性沉淀。


Dna

⑤ NaAc/ KAc -HAc缓冲液

冰醋酸把醋酸钠溶液的pH调到4.8。

用来中和NaOH变性液,使DNA复性。

高浓度的NaAc有利于变性的大分子(蛋白质、DNA、RNA等)沉淀。

⑥无水乙醇

用于沉淀DNA。

DNA分子以水合状态“溶于”水里,乙醇能夺去DNA分子的水环境。可以任意比例和水相混溶,且乙醇与核酸不会起任何化学反应,对DNA很安全。


Dna

⑦ RNase A

降解RNA渣滓。

以免提取后的DNA中含有小分子的RNA。

⑧ TE缓冲液

DNA保存液。

由Tris-HCl和EDTA配制。

Tris-HCl不含金属离子(不同于磷酸缓冲液或硼酸缓冲业),有利于以后操作;

EDTA抑制DNA酶,防止DNA被酶降解。


Dna

选用

⑨酚-氯仿

蛋白变性剂,酚与氯仿是非极性分子,水是极性分子,当蛋白水溶液与酚或氯仿混合时,蛋白质分子之间的水分子就被酚或氯仿挤去,使蛋白质失去水合状态而变性。经过离心,变性蛋白质的密度比水的密度大,因而与水相分离,沉淀在水相下面,从而与溶解在水相中的DNA分开。而酚与氯仿有机溶剂比重更大,保留在最下层。进一步抽提DNA溶液中的蛋白质,使蛋白质沉淀。

苯酚会残留在DNA溶液中。

(现多用各种商品化的层析柱纯化DNA)。

以上试剂有商业试剂盒;也可以自己配制。


Dna

(3)大肠杆菌质粒DNA的提取步骤

1,收集细胞沉淀

2,加入溶液I,II, III

酚-氯仿抽提

氯化铯密度梯度离心


Dna

第一步:溶菌

使用“溶液Ⅰ”溶解细菌细胞壁。

Solution I 的配制:

50mM葡萄糖,

25mM Tris-HCl(pH8.0),

10mM EDTA,

4-5mg/ml溶菌酶,

RNase A


Dna

pET28c(+)电泳结果


Dna

第二步:破膜,蛋白质和DNA变性

溶液II破坏细胞膜,蛋白质和DNA变性。

Solution II 的配制:

0.2N NaOH,1.0%SDS

第三步:中和

溶液III使DNA复性、并促使蛋白质-SDS复合物和染色体DNA、RNA沉淀。

Solution III的配制:

3M 醋酸钠(用冰醋酸调pH至4.8)


Dna

第二步:破膜,蛋白质和DNA变性

溶液II破坏细胞膜,蛋白质和DNA变性。

Solution II 的配制:

0.2N NaOH,1.0%SDS

第三步:中和

溶液III使DNA复性、并促使蛋白质-SDS复合物和染色体DNA、RNA沉淀。

Solution III的配制:

3M 醋酸钠(用冰醋酸调pH至4.8)


Dna

2. 影响质粒DNA产量的因素

最重要的是:

菌株的遗传背景,

质粒自身的拷贝数。

(1)受体菌株

一般要使用endA基因发生突变的大肠杆菌菌株。如DH5、JM109、XL1-Blue等。

endA基因编码核酸内切酶Ⅰ,在Mg2+的存在下可将双链DNA消化成7bp的寡核苷酸片断。


Dna

(2)质粒拷贝数

这是直接决定DNA产量的重要因素之一。

质粒本身的性质所决定。

(3)质粒大小

分子量大的质粒,拷贝数少。


Dna

若干常用质粒的理论产量


Dna

二、基因组或其他DNA的提取

1.细菌基因组DNA的制备

一般过程及原理:

(1)细胞裂解

10%SDS和蛋白酶K。37 oC温育。

不用NaOH !


Dna

(2)DNA纯化

CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)除去多糖,酚-氯仿-异戊醇除去蛋白。

(3)沉淀DNA

0.6倍体积的异丙醇。


Dna

2. 哺乳动物细胞基因组DNA的抽提

一般过程及原理:

(1)组织粉碎

动物组织剪成小块,置液氮中冻结后研磨成细粉末。

组织培养的细胞用胰酶消化松散后直接使用。


Dna

(2)细胞裂解

0.5%SDS和0.1mg/ml蛋白酶K。50 oC温育。

SDS是离子型去垢剂(detergent),可以使细胞膜崩解。

(3)纯化DNA

用苯酚和酚-氯仿抽提除去蛋白质污染。

(4)沉淀DNA

用2倍体积的无水乙醇。

(可以加入1/10体积的3M醋酸氨辅助沉淀)

(5)除去RNA污染

用RNase。


Dna

3. 从植物组织中制备DNA

一般过程及原理:

(1)组织粉碎

用液氮冷冻后研磨成细粉末。

(2)细胞裂解

用2%CTAB/2-ME (十六烷基三甲基溴化铵/2巯基乙醇)。

或1% SDS和蛋白酶K。65 oC温育。


Dna

(3)纯化DNA

用苯酚和酚-氯仿抽提除去蛋白质污染。

(4)沉淀DNA

用0.6倍体积的异丙醇(-20 oC)。

(可以加入1/10体积的3M醋酸氨辅助沉淀) 。

(5)除去RNA污染

用RNase A。


Dna

(三)DNA的纯化

根据实验要求不同,有时需要高纯度的DNA,对提取的DNA样品须进一步纯化并除去溴化乙锭(EB)。

常用的DNA纯化方法有:低熔点琼脂糖凝胶电泳法、透析袋电洗脱法、氯化铯-溴化乙锭连续梯度离心法、离子交换层析法、 “基因纯”试剂纯化等。


Dna

DEAE纤维素膜插片电泳法

原理:DEAE纤维素是一种阴离子交换纤维素,可以结合带负电荷的DNA分子。

将DEAE纤维素膜插入到经琼脂糖凝胶电泳分离的核酸条带前,继续电泳直至所需回收的DNA片段刚好转移到膜上。取出DEAE纤维素膜,低盐条件下洗去杂质,高盐条件下洗出DNA分子。

该法操作比较简单,可同时回收多个DNA片段,对500bp~5kb的DNA片段回收率好,纯度高,能满足大多数实验的要求。但DNA片段大于5kb时,因结合力增大而回收率下降。至10kb或为单链DNA时,其与膜的结合变得很牢固而难以回收。因此,本法不适合于分子量大于10kb的DNA片段的回收,也不能回收单链DNA。


Dna

低熔点琼脂糖凝胶挖块回收法 

该法是从低熔点琼脂糖凝胶中切出含待回收DNA的凝胶块,利用其纯度高、熔点低(65℃)及凝固温度低(30℃)的特点,在室温大于30℃,琼脂糖仍为液态的情况下,对DNA片段进行回收的方法。

根据不同的提取纯化方案,又可分为有机试剂提取法、玻璃珠(或玻璃粉)洗脱法和琼脂水解酶(agarase)法。

有机试剂法以酚、氯仿抽提DNA,可以有效回收0.5kb~5kb的DNA片段。

玻璃珠(或玻璃粉)洗脱法是将琼脂糖凝胶溶于高浓度的碘化钠(NaI)溶液或高氯酸钠溶液中,然后加入玻璃珠(或玻璃粉)以结合DNA,经分离、洗涤后,在低盐缓冲液中将DNA洗脱下来。玻璃珠(或玻璃粉)洗脱法较有机试剂提取法快,但回收率略低。

琼脂水解酶法对切下的含DNA的凝胶块进行消化,将琼脂糖水解为二糖,释放的DNA用酚抽提,乙醇沉淀回收。


Dna

电泳洗脱法

电泳洗脱法包括两个主要步骤,一是将待回收的DNA片段电泳出凝胶介质,使其进入一个便于回收的小容积溶液中;二是分离纯化出DNA片段。

按是否使用透析袋可分为透析袋电泳洗脱法与非透析袋电泳洗脱法两大类。

其中,透析袋电泳洗脱法需要切下含待回收DNA片段的凝胶条,然后放入透析袋内进行电泳,使DNA分子迁移出凝胶条进入透析袋的溶液中,最后经抽提纯化回收DNA分子。

该法操作很不方便而且不适合于同时回收大量不同的DNA片段,但可有效回收从200bp至大于50kb的DNA,尤其对大于5kb的DNA有良好的回收率。


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透析袋电洗脱法步骤

  • 适用于小剂量DNA纯化和酶切DNA片段回收。

  • DNA样品在琼脂糖凝胶电泳分带。

  • 切取含待纯化DNA带的琼脂糖凝胶块,装入透析袋,进行电泳1-2h后,再反向电泳1-2min。

  • 吸取透析袋中的洗脱液于离心管中离心。

  • 转移上清液到另一离心管中,加入2倍体积无水乙醇混匀,于-20℃放置过夜沉淀后,离心后上清液,最后把沉淀物溶于TE缓冲液中,-20℃保存备用。


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聚丙烯酰胺凝胶中回收DNA

聚丙烯酰胺凝胶中回收DNA的标准方法是压碎与浸泡法。

将含待回收DNA条带的凝胶块切出,用吸头或接种针将其压碎,然后以洗脱缓冲液浸泡,使DNA洗脱出来。

该法能很好回收小于1kb的单链或者双链DNA,且纯度很高,无酶抑制剂,也无对转染细胞或微注射细胞有毒的污染物,虽费时但操作简单,是小片段DNA回收的较好方法。

依分子量不同,其回收率从小于30%至大于90%不等。如果将切下的聚丙烯酰胺凝胶块包埋于琼脂糖凝胶中,再进行DEAE纤维素膜插片法电泳或透析袋电泳洗脱,可以缩短双链DNA的回收时间。


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通过凝胶电泳回收的DNA样品和氯化铯-溴化乙锭连续梯度离心制备的DNA样品,因检测需要而含有溴化乙锭(EB),会影响限制性核酸内切酶的切割,因此有必要去掉插入到DNA中的EB,常采用的方法有:正丁醇(或异戊醇)抽提或Dowex树脂层析法等。


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DNA的浓缩

当提取的DNA溶液的浓度达不到实验要求时,必须进行DNA溶液的浓缩。实验室常用的方法有:乙醇沉淀法、 正丁醇抽提法和聚乙二醇浓缩法等。


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三、DNA的定量和纯度测定

  • DNA样品的浓度的测定,一般采用紫外光谱分析、EB荧光分析、水平式琼脂糖凝胶电泳法、聚丙烯酰胺凝胶电泳法和脉冲电泳法等。

1. 紫外光谱法

原理:

DNA(或RNA)在260nm波长处有特异的紫外吸收峰。

蛋白质在280nm处有吸收峰

用微量比色杯(10l)在紫外分光光度计直接测定。


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  • 衡量所提取DNA的纯度可用OD260与OD280的比值,OD260/OD280对DNA而言其值大约为1.8。

  • 当OD260/OD280大于1.8则可能有RNA污染。

  • 当OD260/ OD280小于1.8时则有蛋白质污染。


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2. 琼脂糖凝胶电泳估计( EB荧光分析法)

原理:

溴化乙锭(EB)能插入DNA分子中,紫外光照射下能发红色荧光。

与已知浓度的DNA电泳带荧光强度对比,就可以估计出DNA含量。


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四、DNA分子量的估计

一般使用琼脂糖凝胶电泳,与已知分子量的DNA标准混合液对比得知。

DNA分子量Marker有许多公司的商品,使用非常方便。如DNA的HindⅢ酶切物等。

Marker

Marker


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DNA ladder

DNA Marker

1000bp

900bp

28kb

800bp

20kb

5000bp

700bp

600bp

2500bp

500bp

2300bp

400bp

1300bp

300bp

900bp

200bp

750bp

200bp

100bp


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RNA的分离和纯化

  • 细胞中的核酸:DNA和RNA。

  • RNA:rRNA、 tRNA、 mRNA 。

  • 一个典型哺乳动物细胞约含10-5μg RNA。

    -80%~85% rRNA(28S、18S、5S rRNA)。

    -15%~20%低分子量RNA(如tRNA、核内小分子RNA等)。

    -1%~5% mRNA。


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  • 实验成败关键:创造一个无RNase的环境

    • 去除外源性RNase的污染:DEPC(焦碳酸二乙脂)

    • 抑制内源性RNase的活性

      • RNase阻抑蛋白(RNasin,非竞争性抑制剂)

      • 氧铜核糖核苷复合物硅藻土


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RNA的抽提与纯化

  • 总RNA的制备

  • 真核生物mRNA的纯化

    • 从总RNA中,用寡聚(dT)中亲和层析柱分离mRNA。可应用Promega PolyAT tract mRNA 分离系统分离多聚(A)mRNA。将用生物素标记的寡聚(dT)引物与细胞总RNA共温育,加入与微磁球相连的抗生物素蛋白,用磁场吸附通过寡聚(dT)引物与抗生物素蛋白及强力微磁球相连的mRNA。


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RNA的电泳检测

  • RNA的浓度和纯度可通过测试其OD260来判断, OD260为 1时相当于浓度为40μg/mL。

  • 检测:琼脂糖凝胶电泳法、聚丙烯酰胺凝胶电泳法。


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