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PART Ⅰ 色谱基础知识 南方医院临床试验研究中心 李 科 联系电话: 62787825/62787815 - PowerPoint PPT Presentation


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PART Ⅰ 色谱基础知识 南方医院临床试验研究中心 李 科 联系电话: 62787825/62787815. 一、色谱起源 色谱法起源于 20 世纪初, 1906 年 俄国植物学家 米哈伊茨维特 用 碳酸钙 填充竖立的玻璃管,以 石油醚 洗脱植物色素的提取液,经过一段时间洗脱之后,植物色素在碳酸钙柱中实现分离,由一条色带分散为数条平行的色带。由于这一实验将混合的植物色素分离为不同的色带,因此茨维特将这种方法命名为色谱法。. 色谱. 石油醚. 组分. 色素. 碳酸钙颗粒. 色谱的主要目的是对混合物中的目标物分离和定量.

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PART

色谱基础知识

南方医院临床试验研究中心

李 科

联系电话:62787825/62787815


一、色谱起源

色谱法起源于20世纪初,1906年俄国植物学家米哈伊茨维特用碳酸钙填充竖立的玻璃管,以石油醚洗脱植物色素的提取液,经过一段时间洗脱之后,植物色素在碳酸钙柱中实现分离,由一条色带分散为数条平行的色带。由于这一实验将混合的植物色素分离为不同的色带,因此茨维特将这种方法命名为色谱法。


色谱

石油醚

组分

色素

碳酸钙颗粒


色谱的主要目的是对混合物中的目标物分离和定量色谱的主要目的是对混合物中的目标物分离和定量

  • 色谱法:利用组分在两相间分配系数不同而进行分离的技术

  • 流动相:携带样品流过整个系统的流体

  • 固定相: 静止不动的一相,色谱柱


色谱优点色谱的主要目的是对混合物中的目标物分离和定量

  • 同时分析

  • 分离性能好

  • 灵敏度高(ppm-ppb 微克-纳克)

  • 进样量小 (1-100μL)


色谱分类色谱的主要目的是对混合物中的目标物分离和定量

  • 以流动相状态为标准划分类型。用气体作为流动相的色谱法称为气相色谱法Gaschromatography GC.

  • 用液体作为流动相的色谱法称为液相色谱法 Liquid chromatography LC.


Hplc vs gc
HPLC VS GC色谱的主要目的是对混合物中的目标物分离和定量

  • 液相色谱:

  • 适用于高沸点 大分子 强极性 热稳定性差的化合物的分析,流动相具有运载样品分子和选择性分离的双重作用

  • 气相色谱:

  • 适用于沸点低,热稳定性好的中,小化合物的分析。流动相只起到运载样品分子的作用


Hplc vs gc1
HPLC VS GC色谱的主要目的是对混合物中的目标物分离和定量

  • 高效液相色谱法采用高压输液泵输送流动相及特殊规格填料固定相等,分离效能高,应用范围广,如氨基酸 蛋白质 生物碱 维生素 有机酸 农药,都可用高效液相色谱法进行分析

  • 气相色谱法虽然也具有快速 分离效率高 用样少等优点,但它要求样品必须能够汽化,从而受到样品的挥发性限制。


HPLC色谱的主要目的是对混合物中的目标物分离和定量的分离类型

  • 正相色谱 (NP-HPLC)

  • 反相色谱 (RP-HPLC)

  • 反相离子对色谱 (RPIC)

  • 离子交换色谱 (IEC)

  • 空间排阻色谱 (SEC)

  • 手性化合物分离模式 (Chiral separation mode)


  • 液相色谱按两相极性不同分为色谱的主要目的是对混合物中的目标物分离和定量:

  • 正相色谱

  • 反相色谱

    化合物保留时间随流动相配比的变化

    不同极性的化合物出峰顺序


反相色谱的主要目的是对混合物中的目标物分离和定量HPLC 色谱柱

  • C18 (ODS) type

  • C8 (octyl) type

  • C4 (butyl) type

  • Phenyl type

  • TMS type

  • Cyano type

Non-polar property

-Si-C18H37

Si


反向色谱 色谱的主要目的是对混合物中的目标物分离和定量: 反向色谱用的填料常是以硅胶为基质,表面键合有极 性相对较弱官能团的键合相。适用于能溶于水/有机混合物的中性或非离子化合物样品

反向色谱所使用的流动相极性较强,通常为水、甲醇、乙腈等的混合物。样品流出色谱柱的顺序是极性较强的组分最先被冲洗出,而极性弱的组分会在色谱柱上有更强的保留。


正相色谱的主要目的是对混合物中的目标物分离和定量HPLC 色谱柱

  • 硅胶型

  • 氰基型

  • 氨基型 糖类分析

  • 二醇基型 蛋白质分析

-Si-CH2CH2CH2CN

-Si-CH2CH2CH2NH2

-Si-CH2CH2CH2OCH(OH)-CH2(OH)

Si

Si

Silica gel

Modified Si


  • 正相色谱:固定相通常为硅胶以及其他具有极性官能基团,如(正相色谱:固定相通常为硅胶以及其他具有极性官能基团,如(NH2,APS)和氰基团(CN,CPS)的键合相填料。适用于不溶于水/有机混合物的亲脂类样品

  • 使用的流动相(极性相对比固定相低,分离的次序是依据样品中各组分的极性大小,即极性较弱的组份最先被冲洗出色谱柱。


液相色谱流程图正相色谱:固定相通常为硅胶以及其他具有极性官能基团,如(

色谱柱

检测器

进样器

柱温箱

输液泵

溶剂

数据处理


色谱柱基本性能参数正相色谱:固定相通常为硅胶以及其他具有极性官能基团,如(

  • 硅胶纯度 填料硅胶的纯度与残留金属离子浓度

  • 尺寸 填料床的长度和内径

  • 粒径 平均颗粒直径,通常3-10μm

  • 孔径 颗粒的孔或者腔的平均尺寸,范围80-100A

  • 封尾 用短链将裸露的硅羟基键合后封闭起来


色谱中常用的术语正相色谱:固定相通常为硅胶以及其他具有极性官能基团,如(

  • 色谱图 组分从色谱柱流出并通过检测器时所产生的响应信号的微分曲线


  • 基线正相色谱:固定相通常为硅胶以及其他具有极性官能基团,如(正常情况下,仅有流动相通过检测线时所产生的响应信号的曲线。

  • 峰高(h) 峰最大值到峰底的距离

  • 峰宽(W) 峰两侧拐点处所做切线与峰底相交两点间的距离。峰高一半处的峰宽叫半高峰宽(W ½h)

  • 死时间(t0)实际上就是流动相流经色谱柱所需要的时间

  • 保留时间(tR)从进样开始到出现某组分色谱峰的顶点时为止所经历的时间,称为此组分的保留时间

  • 调整保留时间 (t'R)扣除死时间后的保留时间t'R= tR-t0

  • 容量因子(k) k= t'R /t0 k值越大,组分出柱越慢,保留时间越长


  • 柱效 正相色谱:固定相通常为硅胶以及其他具有极性官能基团,如(

  • 柱效简而言之就是色谱柱对色谱中物质分离能力的大小。柱效越高,分离效果越好,峰形越好。色谱柱的柱效和填料、柱长、柱内径均有关系,一般来说,填料越细密、柱长径比越大,柱效越高。柱校的衡量用理论塔板数来表示。

  • 理论塔板数(n) n=5.54×(tR/ W ½h)2

  • n=16×(tR/W)2

  • 理论塔板高度(H) H= L/n L:色谱柱长


  • 分离度(正相色谱:固定相通常为硅胶以及其他具有极性官能基团,如(R) R= 2(tR2-tR1)/(W1+W2)

  • 相邻两组分色谱峰保留值之差与两组分色谱峰宽总和一半的比值。

  • R<1时,两峰有部分重叠

  • R=1时,分离程度可达98%

  • R=1.5时,分离程度达99.7%,可认为两组分完全分离

  • 增加柱长可以提高分离度,但延长了分析时间


  • 拖尾因子(正相色谱:固定相通常为硅胶以及其他具有极性官能基团,如(T) T= W0.05/ 2d0.05

  • W0.05 W0.05 5%峰高处峰宽 D0.05 5%峰高处的前半峰宽

  • 中国药典》规定T应为0.95~1.05。T<0.95为前延峰,T>1.05为拖尾峰。



流动相色谱图的峰位置用于定性,色谱峰的峰高和峰面积用于定量,峰位置和峰宽用于色谱柱分离性能的评价和色谱条件的优劣。

流动相选择注意事项:

  • 纯度:采用“HPLC”级溶剂

  • 避免使用会引起柱效损失或保留特性变化的溶剂

  • 对试样有适宜的溶解度

  • 溶剂粘度要小

  • 与检测器相匹配


溶 剂 等 级色谱图的峰位置用于定性,色谱峰的峰高和峰面积用于定量,峰位置和峰宽用于色谱柱分离性能的评价和色谱条件的优劣。

  • 水的等级

    • 纯化水

    • 蒸馏水

    • 去离子水

吸光率

去离子水

纯化水

波长 (nm)

因为不纯物的存在,去离子的吸光率较高

纯化水中去除了无机和有机的污染物


HPLC色谱图的峰位置用于定性,色谱峰的峰高和峰面积用于定量,峰位置和峰宽用于色谱柱分离性能的评价和色谱条件的优劣。用水可以通过以下几个方面来得到:

  • 1 专门的纯水机或超纯水机;

  • 2 去离子水重蒸;

  • 3 二次或三次重蒸水;

  • 4 采用类似家用的纯水机;

  • 5 市场上瓶装的纯净水或蒸馏水;

  • 6 其它途径;



溶剂前处理不管采用何种途径,配制流动相应用新鲜水,水质越高放置时间越短。

过滤:0.45um或更小孔径滤膜

目的:除去溶剂中的微小颗粒,避免堵塞色谱柱,尤其是使用无机盐配制的缓冲液。


滤膜类型不管采用何种途径,配制流动相应用新鲜水,水质越高放置时间越短。:

聚四氟乙烯滤膜:

适用于所有溶剂,酸和盐,并无任何可溶物。

醋酸纤维滤膜:

不适用于有机溶剂,特别适用于水基溶液,推荐用于蛋白质和其相关样品。

尼龙66滤膜:

适用于绝大多数有机溶剂和水溶液,可用于强酸,70%乙醇、二氯甲烷、不适用于二甲基甲酰胺。

再生纤维素滤膜:

具有蛋白吸收低,同样适用水溶性样品和有机溶剂。


溶剂前处理不管采用何种途径,配制流动相应用新鲜水,水质越高放置时间越短。

脱气

目的:除去流动相中溶解或因混合而产生的气泡

一般混合溶剂中能容纳的空气量往往要比单个溶剂所能容纳的空气总量要小

气泡对测定的影响:

1)柱压波动,流量偏小

2)基线波动

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柱温箱不管采用何种途径,配制流动相应用新鲜水,水质越高放置时间越短。

进样器

输液泵

检测器

色谱柱

单一或混合溶剂

等度洗脱


A不管采用何种途径,配制流动相应用新鲜水,水质越高放置时间越短。

色谱柱

检测器

进样器

柱温箱

A 泵

B浓度

B

B泵

时间

梯度洗脱


等度洗脱不管采用何种途径,配制流动相应用新鲜水,水质越高放置时间越短。

MeOH / H2O = 6 / 4

分析时间长

分离度差

MeOH / H2O = 8 / 2

( column : ODS type )


梯度洗脱不管采用何种途径,配制流动相应用新鲜水,水质越高放置时间越短。

95%

MeOH 浓度

30%


高压不管采用何种途径,配制流动相应用新鲜水,水质越高放置时间越短。/低压梯度系统

高压梯度

低压梯度

混合器

低压梯度比例阀

脱气机


高压不管采用何种途径,配制流动相应用新鲜水,水质越高放置时间越短。/低压梯度系统

  • 高压梯度系统

    • 梯度准确度好

    • 系统复杂 (需两台或三台泵)

  • 低压梯度系统

    • 系统简单

    • 需在线脱气机

    • 存在时间滞后效应

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泵的保养不管采用何种途径,配制流动相应用新鲜水,水质越高放置时间越短。

  • 使用流动相尽量要清洁;

  • 进液处的砂芯过滤头要经常清洗;

  • 流动相交换时要防止沉淀;

  • 避免泵内堵塞或有气泡;

  • 每次分析结束后,要反复冲洗进样口,防止样品的交叉污染;


色谱柱不管采用何种途径,配制流动相应用新鲜水,水质越高放置时间越短。

ODS柱的使用注意点:

1)柱压低于150kgf/cm2(15cm色谱柱)

2)柱温在40℃左右,最高使用温度为50℃

3)流动相PH使用范围为2~7.5

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柱的保养:不管采用何种途径,配制流动相应用新鲜水,水质越高放置时间越短。

  • 柱子在任何情况下不能碰撞、弯曲或强烈震动;

  • 当柱子和色谱仪联结时,阀件或管路一定要清洗干净;

  • 要注意流动相的脱气;

  • 避免使用高粘度的溶剂作为流动相;

  • 进样样品要提纯;

  • 严格控制进样量;

  • 每天分析工作结束后,要清洗进样阀中残留的样品;

  • 每天分析测定结束后,都要用适当的溶剂来清洗柱;

  • 若分析柱长期不使用,应用适当有机溶剂保存并封闭;


LC不管采用何种途径,配制流动相应用新鲜水,水质越高放置时间越短。检测器

  • 紫外可见检测器(UV/VIS)

  • 二极管阵列检测器(PDA)

  • 示差检测器(RID)

  • 电导检测器(CDD)

  • 荧光检测器(RF)

  • 电化学检测器(L-ECD)

  • 质谱检测器(MS)

  • 蒸发光散射检测器(ELSD)


  • 第一部分到此结束 不管采用何种途径,配制流动相应用新鲜水,水质越高放置时间越短。

  • 谢谢各位同学老师

  • 欢迎批评指正


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