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GENETICA FUNCIONAL

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GENETICA FUNCIONAL. Estudio de la expresión de genomas completos. GENETICA FUNCIONAL. Bibliografía: Nature Genetics January 1999 Vol. 21, Supplement The Chipping Forecast. GENETICA FUNCIONAL.

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Presentation Transcript
genetica funcional

GENETICA FUNCIONAL

Estudio de la expresión de genomas completos

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GENETICA FUNCIONAL

Bibliografía:

Nature Genetics January 1999 Vol. 21, Supplement

The Chipping Forecast

genetica funcional2
GENETICA FUNCIONAL
  • 1) El entendimiento de los sistemas biológicos constituidos por miles de genes requiere la organización de las partes según sus propiedades:
    • + Similaridad de secuencia de DNA en las regiones codificantes y reguladoras
    • + Variaciones polimórficas entre especies y subgrupos
    • + Tiempo y lugar de expresión de los RNAs en el desarrollo, en respuesta a situaciones fisiológicas y/o patológicas.
    • + Localización subcelular de los productos génicos.
  • 2) Este entendimiento precisa el desarrollo de técnicas de "visión global" de los procesos biológicos: estimación simultanea de todos los componentes.
    • + DNA chips (o DNA microarrays)
    • + Serial Analysis of Gene Expresion (SAGE)
    • + Differential Display (Expresión diferencial).
  • 3) Estas técnicas permiten estudiar en paralelo los niveles de expresión de muchos genes y generan información estática (donde se expresa un gen) y dinámica (como se relaciona la expresión de unos genes con otros).
dna chips o dna microarrays
DNA Chips o DNA Microarrays

1) Evolución histórica:

+ Técnica de Shouthern: "Las moléculas de ácido nucleico marcadas de forma apropiada puede usarse para extraer información de muestras de de ácidos nucleicos fijadas a un soporte sólido": Técnicas de Shouthern, Northern, dot-blot, Slot-blot, etc.

+ Fijación de clones individuales de forma ordenada en filtros para localizar los clones deseados e investigar patrones de expresión de genes.

2) Innovaciones clave:

A) Utilización de soportes sólidos no-porosos, que permiten la miniaturización y la detección fluorescente.

+ Pueden inmovilizarse de forma automática hasta 10.000 cDNAs en un soporte microscópico e hibridarlo con sondas marcadas.

B) Desarrollo de métodos de síntesis in situ y a alta densidad, de oligonucleótidos en dichas superficies.

+ Mediante técnicas fotolitográficas: matrices con 400.000 oligonucleótidos distintos cada uno confinado en una región de 20 µm2

+ Mediante la colocación in situ de los reactivos de síntesis por dispositivos similares los utilizados en las impresoras de chorro de tinta.

3) Usos propuestos:

A) Análisis de niveles de expresión de RNAs.

+ cDNA arrays: Producidas por fijación de productos de PCR (0.6 a 2.4 Kb) que representan genes específicos.

+Oligonucleotide arrays: Idem pero por síntesis in situ de oligonucleótidos

B) Análisis de variantes polimórficas en DNA y nuevas mutaciones (SNPs- Single Nucleotide Polymorfisms).

+ Oligonucleotide arrays: Para secuenciación en paralelo.

impresi n o espoteo
Impresión o “espoteo”
  • Oligos , cDNA o fragmentos de PCR depositados sobre una superficie de vidrio
usos propuestos para los dna chips o dna microarrays
Usos propuestos para los DNA Chips o DNA Microarrays

A) Análisis de niveles de expresión de RNAs.

+ cDNA o oligonucleotide arrays: Producidas por fijación de productos de PCR (0.6 a 2.4 Kb) que representan genes específicos.

B) Secuenciación

+ Oligonucleotide arrays

C) Genotipado

+ Oligonucleotide arrays

cdna microarray

Bacteria grown in culture

Label cDNA from bacteria with red Cy3 dye

Bacteria from sit of infection.

Label cDNA from bacteria with green Cy5 dye

co-hybridization of cDNAs to DNA microarray

RNA binds to corresponding gene

cDNA microarray

Blank-not expressed

Green- expressed in infection only

Red- expressed in culture only

Yellow- expressed in

Both, culture and infection

genotipado
Genotipado

Matríz con 120.000 sondas diseñada para genotipar 3.000 loci bialélicos

slide29

SAGE

Serial Analysis of Gene Expression

slide30
SAGE
  • Una secuencia de nucleótidos corta (tag) de 9 o 10 pares de bases contiene suficiente información para identificar un transcrito.
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Cleave with anchoring enzyme (AE)

Bind to streptavidin beads

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GTAC

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Divide in half Ligate to linkers (A+B)

CATG

CATG

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AAAAA

GTAC

GTAC

TTTTT

TTTTT

Cleave with tagging enzyme (TE). Blunt Ends

Ligate and amplify with primers A and B

A

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A

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Cleave with anchoring enzyme

Isolate Ditags. Concatenate and clone

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