Preparazione Dei Campioni per l'Analisi Istologica

1. Preparazione Dei Campioniper l'Analisi Istologica Come si preparano le sezioni istologiche per la microscopia ottica.

2. Preparazione di un Campione Biologico per la Microscopia Ottica • Acquisizionedel campione e taglio in pezzi (1cm3) • Biopsia, intervento chirurgico, autospia postmortem. • Prelevato rapidamente utilizzando strumenti adatti (bisturi).

3. Fissaggiodel campione (immobilizzare, "uccidere" e preservare) • generalmente per mezzo di aldeidi reattive (formaldeide); • cross-link delle macromolecole, in particolare le proteine; • si ottiene un effetto indurente sui tessuti "molli"; • deve essere fatto rapidamente per evitare che gli enzimi persenti degradino il tessuto.

4. Disidratazionedel campione attraverso passaggi in soluzioni a concentrazione crescente di etanolo • Paraffina (materiale usato per l'inclusione) non è solubile in H2O. • Eliminazionedell'etanolo e passaggi in xilene • Paraffina non è solubile nemmeno nell'etanolo

5. Inclusionedel campione in in mezzo appropriato paraffina o resina • Tessuti sono "molli" e fragili • Diversi passaggi in paraffina calda • La paraffina occupa lo spazio precedentemente occupato dall'H2O • La paraffina fredda si indurisce e permette di sezionare il campione

6. Taglioper mezzo di un microtomo, che produce sezioni dello spessore di 1-10 µm • Montaggiodelle sezioni su vetrini per microscopia. Sezione non colorata

7. Colorazionedelle sezioni con il metodo più appropriato. • I coloranti sono a base acquosa, per cui si elimina lo xilene attraverso passaggi in etanolo. Colorazione automatizzata

8. Colorazioni • Colorazione • Un colore brillante di certe componenti del tessuto. • Contro colorazione • Resto del tessuto con un colore contrastante.

9. Ematossilina/Eosina Ematossilina ha affinità per le molecole cariche negativamente (DNA, RNA ed alcune proteine). Eosina ha affinità per le molecole cariche positivamente (proteine del citosol).

10. Perchè questa "slide" è blu … • Se una porzione di tessuto o di una cellula si colora diblu/porpora, viene detta Basofila • È colorata dall'ematossilina • Nucleieribosomigeneralmente sono basofili

11. … e questa rossa ? • Se una porzione si colora inrosso /arancio /rosa, viene dettaAcidofila o eosinofila • È colorata dall'eosina • Sono proteine del citosol

12. Altre colorazioni • PAS • Per sostanze ricche in zuccheri (muco) • Tricromica • Per i tessuti connettivi • Le fibre si colorano in blu • Con E&E sono rosa.

13. Cellule nervose Cellule del sangue Mielina • Osmio o Sudan black • Per grasso/lipidi/mielina • I lipidi non incorporano coloranti acquosi • Argento ed oro • Per fibre delicate e processi cellulari • Giemsa • Per le cellule del sangue • Simile ad E&E

14. E le aree "bianche"? Mesenchima • I fluidi presenti nei tessuti o negli spazi interstiziali non si colorano con E&E • Sangue, linfa etc. • Si riconoscono come ampi spazi bianchi • Anche i lipidi ed il grasso non si colorano.

15. Come si osserva il campione? • Attraverso un buon microscopio ottico • Fotografandolo • Misurandolo Per avere un'idea delle dimensioni delle strutture osservate si può usare come riferimento un eritrocita (˜ 8 micron)

16. Interpretate il campione !!!

17. Artefatti • Shrinkage • Lascia dello spazio aggiuntivo • Disidratazione e fissaggio • Fratture al piano di taglio • Tagli netti e ben visibili • Lama deteriorata

18. Colorante precipitato • Macchie di colore a "grano di pepe" • Tessuto "pinzato" • Strumento per l'excisione deteriorato • Durante o dopo il sezionamento • Pieghe • Durante il montaggio