浙江中医药大学 生命科学学院

1. 浙江中医药大学 生命科学学院 生物化学教研室

2. 一．重要性 二十一世纪是生物世纪，也是一个竞争的世纪。对你们来说，喜忧参半，很是矛盾。首先，你们应该喜，应该骄傲，你们学习到最前沿的科学，将来会成为科技前沿的工作者，但你们也应忧，也应看到眼前的困难，因为很多学校都在办生科、生技专业，毕业生越来越多，就业压力越来越大。尽管如此，机会对大家来说还是均等的，我们学的理论课程都是王境岩的二版教材，生化技术也就是那六大技术，大家都能学会。所以，想会大家不会的很难，但如何做的比别人好，这是问题的关键。我们开展生物化学大实验的目的，就是给大家一个动手的机会，竞争的原则就是优胜劣汰，我们不仅要会做，而且要做的比别人好，这样才能使自己立于不败之地，在这个竞争的世纪里，找到一个适合自己地岗位，并且是自己喜爱且胜任的工作。（讲解工作的流动性与稳定性的优缺点）

3. 二．目的 1．提高学生动手能力：一定要亲自动手去做，举00级的例子，行家伸伸手，变知有没有。 2．培养严谨的科学作风：制药的例子，奶业的例3．掌握生物化学的实验方法和实验技术 1）．通过生物大分子的制备如生物大分子的分离 纯化，学习到下列实验方法： ①沉淀法 ②离心 ③透析 ④超滤 ⑤层析 ⑥液相色谱 ⑦电泳 ⑧冰冻干燥 ⑨样品的保存 2）学习到生物化学的实验技术： ①离心技术 ②层析技术 ③电泳技术 ④免疫化学技术 ⑤分光光度技术 ⑥高效液相技术

4. 三．实验总过程 1．离心分离血浆脂蛋白 2．透析浓缩 3．层析:凝胶过滤 4. SDS－PAGE电泳 5．双向免疫电泳 6. lowry法测蛋白浓度 7. 冰冻干燥 8. 样品的保存

5. 四．离心分离血浆脂蛋白 • [原理]:本实验采用正常人抗凝血浆，以NaBr为密度介质，利用各脂蛋白颗粒密度不同，经过序列超速离心大量制备低密度血浆脂蛋白。

6. [操作步骤] • 1．血浆准备：取血库血浆250mL ，提前一天放入冰箱4℃冷藏 • 2．CM和VLDL分离： • 1）取约250ml血浆置于250ml量筒中，加入适量的双蒸水（放入密度计时液体离量筒管口约1厘米），调节密度至 1.019g/mL，（比重计 1.000～1.1000）分置于8个离心管中，加液体离管口5－8 mm,盖好盖子，并在相关器械内（盖盖子器）检查是否盖好，如盖好，则用注射器加入调好的血浆（密度1.019g/mL），加满，小螺丝盖好（稍松），大螺帽适紧。将8支离心管两两平均分成4组，置于天平上平衡，两两调平衡后，盖好小螺帽（小螺帽有阻力就行），试管标记编号。

7. 2）将离心管两两对应放入角度转头RT-50T内，注意在橡胶密封圈上涂油脂。2）将离心管两两对应放入角度转头RT-50T内，注意在橡胶密封圈上涂油脂。 • 3）输入离心数据，编离心程序： • ①离心机显示屏上有速度、时间、温度、加速、减速及功能设定，上面为实际的，下面为设定的。可根据自己的要求设定相关的参数。我们设温度在8℃，转速40000rpm，离心时间20－23小时，加速为9，减速为9。 • 功能function的设定有六个方面，常用的有RLM，键入enter则显示不同的转子，上下键选定自己要用转子，向下选出RP－50T，键入enter，显示转动还是创建或改变，还有删除,按自己需求设定，选出1.runing,再次键入enter，则屏幕下方显示你设定的转子，共转了多少转。我们可看到RP－50T共转了多少转。

8. 4）在记录本上记录此转子总体使用的转数及时间。并记录其他相关信息。如姓名，年、月、日等等。4）在记录本上记录此转子总体使用的转数及时间。并记录其他相关信息。如姓名，年、月、日等等。 • 5)装转子，特别注意垂直放入，轻轻上下提几下，不要蹩着，看是否放好，切记：未放好则不要随意转动。

9. 6）盖好离心机盖子，键入START,观察三项指标：6）盖好离心机盖子，键入START,观察三项指标： • ①真空的三个三角号是否达到。（先抽真空， vacuum为一个▲，速度可达4000转/分，accelerate变为wait等待符号，继续抽真空达两个▲▲号，则又出现accelerate，速度进一步加速到40000转/分，再等十几分钟，则vacuum出现三个▲▲▲。） • ②温度是否逐渐降下来。 • ③转速是否到达设定的转速。 • 并注意听有无异常的声音，如有则键入stop,查找原因。一般三项指标正常后再离开。

10. 7）二日，离心机停下，按vacuum键进气，打开离心机腔体盖子，垂直提出转子。用小锣丝刀斜提试管从转子内取出。7）二日，离心机停下，按vacuum键进气，打开离心机腔体盖子，垂直提出转子。用小锣丝刀斜提试管从转子内取出。 • 8）取盖子时一手握着试管，另一只手向上提盖子，一只手顶着另一只手，一定小心，慢慢将盖子取掉。 • 9）CM和VLDL浮于离心管上层，发白的不透明乳液，用胶头滴管小心吸取，置于锥形瓶中密封保存（标记日期、样本名称--VLDL，4℃冷藏，全部实验结束后，用塑料瓶冷冻保存）。

11. 3．LDL分离： • 1）将8个离心管中的下层溶液取出，用滴管吸取离出的下清液多次清洗试管，将下层全部液体倒入烧杯中，加入磁子置于磁力搅拌器上混合均匀，将离心出来的下层不溶液体化开，然后将液体全部倒入250ml量筒中，加入适量的双蒸水（放入密度计时液体离量筒管口约1厘米），用药勺取适量的NaBr加入，将调节密度至1.063g/mL，分装液体至8只试管，加液体离管口约5－8 mm,盖好盖子，并在相关器械内（盖盖子器）检查是否盖好。如盖好则用注射器加入调好的血浆（密度1.063g/mL），加满，小螺丝盖好（稍松），大螺帽适紧，。将8支离心管平均分成4组，置于平衡天平上，两两调平衡，然后盖好小螺帽（小螺帽有阻力就行），试管标记编号。

12. 2）用筷子夹着脱脂棉将离心机转子内的冷凝水沾干，然后将油脂少许涂于密封橡胶圈，将转子准备好。2）用筷子夹着脱脂棉将离心机转子内的冷凝水沾干，然后将油脂少许涂于密封橡胶圈，将转子准备好。 • 3）将离心管两两对应放入角度转头后RT-50T，其他操作同前，设定 在8℃，40000rpm，离心20－23小时，加速为9，减速为9，并选定RT-50T转子。注意放转子时垂直上下放，稍微提几下，不要蹩着转子，然后记录本上记录。

13. 4）三日，离心机停下，按vacuum键，进气，打开离心机腔体盖子，垂直提出转子。用小锣丝刀斜提试管从转子内取出试管。LDL浮于离心管上层，为发黄液体，用胶头滴管小心吸取，置于烧杯中。等待浓缩及透析。 • 5）将8个离心管中的下层液体倒入锥形瓶中，密封保存（标记日期、样本名称--LDL，4℃冷藏，全部实验结束后，用塑料瓶冷冻保存）。

14. 4．透析，已分离出来的LDL含有大量的NaBr，需要透析脱盐，将LDL溶液装入3个透析袋中，用蒸馏水透析脱盐6h，每2h换透析液一次。4．透析，已分离出来的LDL含有大量的NaBr，需要透析脱盐，将LDL溶液装入3个透析袋中，用蒸馏水透析脱盐6h，每2h换透析液一次。 • 5 ．浓缩，经透析后的LDL溶液连同透析袋一起放入40%的聚乙二醇PEG20000的烧杯中浓缩至6～8ml。

15. 注意：全部离心完成后，将离心机转子按前面进行操作，沾干管腔内的冷凝水，将油脂少许涂于密封橡胶圈，将离心机转子放于柜子中。并将离心机密封圈涂油脂，腔体用丝布擦干净，关机。注意：全部离心完成后，将离心机转子按前面进行操作，沾干管腔内的冷凝水，将油脂少许涂于密封橡胶圈，将离心机转子放于柜子中。并将离心机密封圈涂油脂，腔体用丝布擦干净，关机。

16. 四种血浆脂蛋白的比重：

17. 五、离心分离技术 • 离心技术(centrifugal technique)是根据颗粒在作匀速圆周运动时受到一个外向的离心力的行为而发展起来的一种分离技术。这项技术应用很广，诸如分离出化学反应后的沉淀物、天然的生物大分子、无机物、有机物。在生物化学以及其它的生物学领域常用来收集细胞、细胞器及生物大分子物质。

18. 生物化学实验中常常涉及细胞成分的生化分析或某种物质的制备，因此，必需利用有效的生物化学分离方法，常用的方法有：离心技术、层析技术、电泳技术和膜分离技术等。

19. 1.1 基本原理 • 离心技术（centrifugal technique）是根据颗粒在作匀速圆周运动时受到一个外向的离心力的行为而发展起来的一种分离技术。

20. 应用：各种生物样品的分离和制备。如分离收集细胞、细胞器及生物大分子物质；提纯、鉴定生物大分子；分离化学反应的沉淀物。应用：各种生物样品的分离和制备。如分离收集细胞、细胞器及生物大分子物质；提纯、鉴定生物大分子；分离化学反应的沉淀物。 • 生物样品悬浮液在离心力作用下使悬浮的微小颗粒以一定速度沉降，从而与溶液分离，其沉降速度与颗粒的质量、大小和密度相关。

21. 相对离心力 • 离心力因离心半径不同而不同，因此用“相对离心力” （relative centrifugal force，RCF）表示离心力，若RCF值不变，一个样品可在不同的离心机上获得相同的结果。

22. Dole和Cotzias制作了与转子速度和半径相对应的离心力的转换列线图。Dole和Cotzias制作了与转子速度和半径相对应的离心力的转换列线图。 • 在用图将离心机转数换成相对离心力时，先在离心机半径标尺上取已知的离心机半径和在转数标尺上取已知的离心机转数，然后将这两点间划一条直线，在图中间RCF标尺上的交叉点，即为相应的离心力数值。

23. 例已知离心机转数为2500rpm，离心机的半径为7.7cm，将两点连接起来交于RCF标尺，此交点500×g即是RCF值。 • RCF(×g)=1.119×10-5×r×rpm2。

25. 1.2 离心分类 • 根据离心原理，按照实际工作的需要，设计了许多离心方法，大致可分三类。 • 差速离心法(differential velocity centrifugation) • 速率区带离心法（rate zonal centrifugation） • 等密度离心法（isopycnic centrifugation）

26. 1.2.1 差速离心法 • 利用不同的粒子在离心力场中沉降的差别，在同一离心条件下，沉降速度不同，通过不断增加相对离心力，使一个非均匀混合液内的大小、形状不同的粒子分部沉淀。 • 操作过程中一般是在离心后用倾倒的办法把上清液与沉淀分开，然后将上清液加高转速离心，分离出第二部分沉淀，如此往复加高转速，逐级分离出所需要的物质。

27. 差速离心的分辨率不高，沉淀系数在同一个数量级内的各种粒子不容易分开，常用于其他分离手段之前的粗制品提取。差速离心的分辨率不高，沉淀系数在同一个数量级内的各种粒子不容易分开，常用于其他分离手段之前的粗制品提取。 • 关键是选择适合于各分离物的离心力。 • 例如用差速离心法分离已破碎的细胞各组份。

28. 差速离心分离细胞组分

30. 1.2.2 速率区带离心法 • 速率区带离心法是在离心前于离心管内先预装密度梯度介质（如蔗糖、甘油、CsCl等），将待分离的样品铺一薄层在梯度液的顶部进行离心。

32. 离心后在近旋转轴处（r1）的介质密度最小，离旋转轴最远处（r2）介质的密度最大；离心后在近旋转轴处（r1）的介质密度最小，离旋转轴最远处（r2）介质的密度最大； • 但最大介质密度必须小于样品中粒子的最小密度，即ρP＞ρm。

33. 根据分离的粒子在梯度液中沉降速度的不同，使具有不同沉降速度的粒子处于不同的密度梯度层内分成一系列区带，达到彼此分离的目的。根据分离的粒子在梯度液中沉降速度的不同，使具有不同沉降速度的粒子处于不同的密度梯度层内分成一系列区带，达到彼此分离的目的。

34. 梯度液在离心过程中以及离心完毕后，取样时起着支持介质和稳定剂的作用，避免因机械振动而引起已分层的粒子再混合。梯度液在离心过程中以及离心完毕后，取样时起着支持介质和稳定剂的作用，避免因机械振动而引起已分层的粒子再混合。

35. 由于ρP＞ρm可知S＞0，因此该离心法的离心时间要严格控制。由于ρP＞ρm可知S＞0，因此该离心法的离心时间要严格控制。 • 如果离心时间过长，所有的样品可全部到达离心管底部；离心时间不足，样品还没有有足够的时间使在介质中分离形成区带。 • 由于此法是一种不完全的沉降，沉降受物质本身大小的影响较大，一般是应用在物质大小相异而密度相同的情况。 • 常用的梯度液有聚蔗糖（Ficoll）、硅溶胶（例如，Percoll）及蔗糖。

37. 离心时，由于离心力的作用，颗粒离开原样品层，按不同沉降速率向管底沉降。离心一定时间后，沉降的颗粒逐渐分开，形成一系列界面清楚的不连续区带。离心时，由于离心力的作用，颗粒离开原样品层，按不同沉降速率向管底沉降。离心一定时间后，沉降的颗粒逐渐分开，形成一系列界面清楚的不连续区带。 • 沉降系数越大，沉降越快。离心必须在沉降最快的颗粒（大颗粒）到达管底前或刚到达管底时结束，使颗粒处于不完全的沉降状态，而出现在某一些特定的区带内。

38. 离心过程中区带的位置和形状（或带宽）随时间而改变，因此，区带的宽度不仅取决于样品组分的数量、梯度的斜率、颗粒的扩散作用和均一性，也与离心时间有关。离心过程中区带的位置和形状（或带宽）随时间而改变，因此，区带的宽度不仅取决于样品组分的数量、梯度的斜率、颗粒的扩散作用和均一性，也与离心时间有关。 • 离心时间越长，区带越宽。适当增加离心力可缩短离心时间，并可减少扩散导致的区带加宽现象，增加区带界面的稳定性。 • 较长的离心管有助于提高分辨率。

39. 1.2.3 等密度离心法 • 等密度离心是依赖于样品颗粒的不同密度来进行离心分离的。

40. 等密度离心可在离心前预先配制介质的密度梯度，也可依靠离心力来形成梯度（自形成梯度），此种密度梯度液包含了被分离样品中所有粒子的密度，混合样品可以铺在梯度液之上，也可以置于梯度液之下，甚至可与梯度液混在一起。等密度离心可在离心前预先配制介质的密度梯度，也可依靠离心力来形成梯度（自形成梯度），此种密度梯度液包含了被分离样品中所有粒子的密度，混合样品可以铺在梯度液之上，也可以置于梯度液之下，甚至可与梯度液混在一起。

41. 在离心过程中由于样品各单一成份向自己的等密度区靠扰即达到了分离纯化的目的。等密度离心法中，梯度液的初始最大密度常常超过样品各组份的密度，利用每个单一组份沉降或上浮到它们各自的等密度区来达到分离的目的。在离心过程中由于样品各单一成份向自己的等密度区靠扰即达到了分离纯化的目的。等密度离心法中，梯度液的初始最大密度常常超过样品各组份的密度，利用每个单一组份沉降或上浮到它们各自的等密度区来达到分离的目的。

42. 当管底介质的密度大于粒子的密度，即ρm＞ρP时粒子上浮；在管顶处ρP＞ρm时，则粒子沉降，最后粒子进入到一个它本身的密度位置即ρP＝ρm，此时dr/dt为零，粒子不再移动，粒子形成纯组份的区带。当管底介质的密度大于粒子的密度，即ρm＞ρP时粒子上浮；在管顶处ρP＞ρm时，则粒子沉降，最后粒子进入到一个它本身的密度位置即ρP＝ρm，此时dr/dt为零，粒子不再移动，粒子形成纯组份的区带。

43. 沉降与样品粒子的密度有关，而与粒子的大小和其他参数无关。沉降与样品粒子的密度有关，而与粒子的大小和其他参数无关。 • 体系到达平衡状态后，延长离心时间和提高转速也不能改变粒子的成带位置。

44. 但提高转速可缩短达到平衡的时间，离心所需时间以最小颗粒到达等密度点（即平衡点）的时间为基准，有时长达数日。但提高转速可缩短达到平衡的时间，离心所需时间以最小颗粒到达等密度点（即平衡点）的时间为基准，有时长达数日。 • 此法一般应用于物质的大小相近，而密度差异较大时。常用的梯度液是CsCl。

46. 1.2.4 梯度溶液的制备 • ⑴ 梯度材料的选择原则 • 理想梯度材料具备的特点： • ①化学稳定性好，与被分离的生物材料不发生反应，对被分离样品渗透很少，且易与所分离的生物粒子分开。 • ②溶解度高，可达到要求的密度范围，且在所要求的密度范围内，粘度低，渗透压低，离子强度和pH变化较小。

47. ③不会对离心设备发生腐蚀作用。 • ④容易纯化，价格便宜或容易回收。 • ⑤较低的光吸收特性，有光折射率的对照资料，浓度便于测定。 • ⑥物理性质、热力学性质应该是已知的。 • 但很难找到一种适合于各种密度梯度离心的完美梯度液。

48. 基本符合原则的梯度材料： • ①糖类：蔗糖、甘油、聚蔗糖（Ficoll）、右旋糖酐、糖原 • ②无机盐类：CsCl、RbCl（氯化铷）、NaCl、KBr等 • ③有机碘化物：三碘苯甲酰葡萄糖胺（matrizamide）等 • ④硅溶胶：如Percoll • ⑤蛋白质：如牛血清白蛋白 • ⑥重水 • ⑦非水溶性有机物：如氟代碳等

50. ⑵梯度材料的应用范围 • ①蔗糖：水溶性大，性质稳定，其最高密度1.33g/ml，价格低易制备。但渗透压较高，高浓度时粘度较大。线性梯度范围是5~20%W/V或10~40%W/V。 • 用于细胞器、病毒、RNA分离的梯度材料，但由于有较大的渗透压，以及较高的渗透性，不宜用于细胞的分离。