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第 12 章 遗传工程

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第 12 章 遗传工程. 本章教学时数: 2 学时。 本章重点:基因工程的基本流程。 本章难点:分子标记和基因图谱; 研究基因功能的方法. §1 遗传 工程概述. 遗传工程: 细胞工程 酶工程 发酵工程 基因工程. 遗传工程的概念. 遗传工程 ( genetic engineering), 也称生物工程( biological engineering)。 是指利用工程技术的方法改造和修饰生物体,使其产生新的性状或更适合人类需求的产品的遗传学手段。. 广义遗传工程和狭义遗传工程:.

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本章教学时数:2学时。
  • 本章重点:基因工程的基本流程。
  • 本章难点:分子标记和基因图谱;

研究基因功能的方法

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§1遗传工程概述

遗传工程:

细胞工程

酶工程

发酵工程

基因工程

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遗传工程的概念
  • 遗传工程 (genetic engineering),也称生物工程(biological engineering)。
  • 是指利用工程技术的方法改造和修饰生物体,使其产生新的性状或更适合人类需求的产品的遗传学手段。
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广义遗传工程和狭义遗传工程:
  • 广义:包括细胞工程、基因工程、酶工程和发酵工程等。
  • 狭义:基因工程。
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细胞工程
  • 在离体(in vitro)条件下以细胞为基本单位,借助人工培养基,对生物细胞进行培养、繁殖,或者使其发生变异,从而改良生物品种、创造新品种、加速繁育,或利用细胞培养生产有用物质的过程。
  • 细胞工程包括细胞培养、细胞融合、细胞器转移、生物体的克隆与规模化繁殖等。
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酶工程
  • 利用酶的催化作用,在一定的生物反应器中,将相应的原料转化成所需要的产品。
  • 是酶学理论与化工技术相结合的新技术体系。
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发酵工程
  • 利用微生物与现代化工程技术相结合,工厂化生产人类需要的物质的一种技术体系。
  • 目前医用抗生素、农用抗生素绝大部分都是发酵工程产品。
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基因工程
  • 利用人工方法在体外(in vitro)切割、拼接、重组生物的遗传物质,获得重组DNA分子,然后导入宿主细胞或个体,使受体的遗传特性得到修饰或改良。
  • 基因工程操作的对象是DNA分子。
  • 又称为重组DNA技术
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§2 基因工程的工具酶
  • 内切核酸酶(endonuclease)
  • DNA连接酶(ligase)
  • DNA聚合酶(DNA polymerase)
  • RNA聚合酶(RNA polymerase)
  • 反转录酶(reverse transcriptase)
  • 最重要的工具酶是限制性核酸内切酶(restriction endonuclease)
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限制性内切核酸酶
  • 或称限制性酶(restriction enzyme),是基因工程最重要的工具。
  • 在细菌中这些酶的功能是降解外来DNA分子,以限制(restriction)或阻止病毒侵染。
  • 这类酶能识别双链DNA分子中特异的核苷酸序列,并在特定的位置将双连DNA分子切断。
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限制性内切核酸酶的命名原则:
  • 根据分离出这种酶的细菌在分类学上的属名、种名和菌株名来命名。
  • 名称的第一个字母是该细菌的属名的第一个字母,大写,斜体。
  • 名称的第二、三个字母是该细菌种名的前两个字母,小写,斜体。
  • 名称的第四个字母是菌株的名称,大写或小写,正体。如果没有菌株名称就不写。
  • 名称最后的是罗马数字,表示从这种细菌中分离出来的酶的序号,如从某个菌株中分离出来的第一种酶为Ⅰ,第二种酶为Ⅱ,等等。
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如EcoRⅠ来自大肠杆菌(Escherichia coli)R菌株,读作echo-r-one;
  • Hind Ⅲ 来自流感噬血杆菌

(Hemophilus influenzae)d菌株,读作hind-three

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限制酶的分类
  • 限制性核酸内切酶的工作分为2个步骤:

识别特定的DNA序列

在特定的位置切割DNA分子

  • 根据其作用特点,可以将限制性酶分为三种类型:

Ⅰ型

Ⅱ型

Ⅲ型。

  • 在基因工程中用途最广泛的是Ⅱ型限制酶。
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Ⅰ型限制酶
  • 有特定的识别序列
  • 但切割位置远离识别位置
  • 有的种类可以在同识别序列相距1000bp的位置上随机切割DNA分子
  • 在基因工程中没有什么用途
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Ⅲ型限制酶
  • 有特定的识别序列
  • 切割位置在识别序列3’端相距20bp处,可以产生各种类型的单链末端。
  • Ⅲ型限制酶在基因工程中有特定的用途,但总体来说,用途不大。
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Ⅱ型限制酶
  • 在DNA上有特定的识别序列
  • 而且其切割位点就在识别序列内部
  • 基因工程中用途最广
  • 识别序列是对称的,在一条链中从5’到3’方向的序列与其互补链从5’到3’方向的序列完全相同,称为回纹对称序列(palindrome)。
dna dna ligase
DNA连接酶(DNA ligase)
  • 共价连接5′-磷酸和3′-OH,形成磷酸二酯键(3′-5′phosphodiester bond),封闭DNA双链上的缺刻(nick)。
3 vector
§3 载体(vector)
  • 将外源DNA片段运送进宿主细胞(host cell)进行扩增或表达的运载工具称为载体。
  • 载体也是DNA分子。
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常用载体:
  • 细菌质粒、噬菌体、病毒等。
  • 都要经过人工改造。
  • 细菌人工染色体(BAC)
  • 酵母菌人工染色体(YAC)
  • 人类人工染色体(HAC)
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载体的基本条件

①有独立的复制原点(ori),能独立地自我复制,而且能带动外源DNA一起复制。

②具有多种限制性酶的切点,用于连接外源DNA 片段。

③载体上的限制酶酶切位点对于任何一种限制酶来说只能有一个。

④具有一个选择标记基因。

2 69 kb 500
质粒载体①分子量小(2.69kb),但能携带较大的外源片段;②拷贝数多,在每个宿主细胞可达500个;③酶切位点多,克隆方便;④具有α-互补显色表型,便于检测。质粒载体①分子量小(2.69kb),但能携带较大的外源片段;②拷贝数多,在每个宿主细胞可达500个;③酶切位点多,克隆方便;④具有α-互补显色表型,便于检测。
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Ti质粒
  • Ti质粒是根癌农杆菌的染色体外遗传物质
  • 双链闭合环状DNA,150~200kb
  • 植物基因工程常用的载体
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Ti质粒结构
  • T-DNA

Transfer DNA

  • 是农杆菌侵入植物细胞时从Ti质粒上转移到植物细胞的一段DNA
  • T-DNA两端个有一段25bp的同向重复序列,是T-DNA的边缘区
  • LB;RB
  • 在同一条单链的LB和RB内各形成一个缺口,单链T-DNA进入植物细胞
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§4基因的分离与鉴定

从基因库中分离基因

聚合酶链式反应(PCR)扩增基因

人工合成基因

T-DNA标签法

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(一)从基因库中分离基因

1.构建基因库

2.筛选基因库

3.阳性克隆的分析与鉴定

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1.构建基因库
  • 基因库 (library)是一组DNA或cDNA序列克隆的集合体。
  • 创建基因文库的目的是从特定的材料中分离目的DNA片段或基因。
  • 把所有的基因集中在一个库中,采用一定的方法在库中筛选目的基因。
  • 同时也便于基因的长期保存。
genomic dna library
基因组文库 Genomic DNA library
  • 使用与切割载体相同的限制酶,将供体生物的基因组DNA切割成许多片段
  • 将所有片段连接到载体上,构成一个重组DNA群体
  • 这个群体包含全基因组的遗传信息
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cDNA文库
  • cDNA library
  • 以mRNA为模板,经反转录酶合成互补DNA(complementary DNA,cDNA)
  • 将双链cDNA与适当载体连接
  • 转化到宿主细胞内进行扩增,建成cDNA文库
slide41
基因组文库与 cDNA文库的比较:
  • 基因组文库包含基因组的所有基因
  • cDNA文库只包括某一特定细胞类型、某一组织、或某一发育时期的表达序列
  • 分离特定基因,cDNA库比较方便
  • 研究调控序列,必须基因组文库
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从基因库中筛选特定的克隆
  • 一个基因文库中有几万个克隆,目的基因到底在哪个克隆上呢?
  • 根据待选基因相关信息 确定筛选方法和条件。
  • 最常用的方法是利用一段核苷酸序列作探针,用放射性同位素或非放射性同位素标记探针,筛选基因库
dna probe
DNA探针(probe)
  • 探针是一段能够与待选目的基因互补的核酸序列
  • DNA、cDNA、寡聚核苷酸
  • 单链、双链
  • 同位素标记、荧光标记、颜色标记
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筛选文库
  • 质粒基因库筛选
  • 细菌混合液在培养在平板上
  • 转移到尼龙膜上
  • 裂解细菌
  • 变性DNA
  • 标记探针
  • 杂交
  • 漂洗
  • 放射自显影或荧光检测
  • 挑取对应菌落、培养
  • 抽提质粒
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阳性克隆的分析与鉴定
  • 从基因库中筛选出的阳性克隆,还需进一步分析、鉴定,才能最后得到目的基因
  • 测序 自动测序仪
  • 功能分析 预测软件
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核酸序列分析与功能预测
  • 同源性比较
  • 同源基因是指那些起源相同、序列相似的基因。
  • 可从核酸及蛋白质两种水平比较基因间的同源性。
  • 将测出的核酸序列同杂交的探针序列进行比较
  • 将得到的序列发到BLAST等DNA Data库的网址上比较
open reading frame orf
开放阅读框(open reading frame, ORF)分析
  • 开放阅读框:一段能编码一条多肽链,并具有翻译起始信号(ATG)和终止信号 (TAA、TAG或TGA)的核苷酸序列。
  • 来自cDNA库的序列可直接进行0RF分析,比较其与其他序列的同源性来确定其身份。
  • 来自核基因库的序列,因大多数真核生物基因含有内含子。
slide52
TGCTCGCTCCTACGAATCCTGCCCCTGAGTAACAATGACTGACTTTTAATTTGTTTGCAG
  • 61 CTAGGGTGGGGATCGAGATGGTGATCTTGGAGCAGCCACAGCTGCTCCTTCTTCTTCTTC
  • 121 TTCTTGTAGCAGCTGCAGCTGCAACCGGCGCCACAGCAGCCGACGACGAGTTGGAGTGTC
  • 181 CCTCCTCCATCTTCGGTAAGTAGCAAAGCACAGTATGACATTCACGAATGCATGTCATGA
  • 241 TCTATCACTCCCTTTGTCTTCGCTACATTACATACTCTGCCTGTGTTTACCTACTGTACC
  • 301 CGTCTTCAATTCAATTTGCTGTTGGCTCCCGCGCTTTCCCGAAGCCGCGTGTAGTAGTAT
  • 361 CATAAAAGTAGGAGTAGATCTTTAATTTGCCCGGCGAAAACTGCTCCTAGTGGTAGATCT
  • 421 TTGGCTCGGATCGGAGAAGATATTGTAGCTGTACTCTGATCGAGAGCATGCATGCTTGTT
  • 481 AATCCGATCGAGCGTATTCCTCTGAGTTTGTTATGCTCTGATATTGTAATTGTGGCTGGA
  • 541 TAATTTTCAAGAAAAAAAAATCGGTTACATACATGCATTTGCACTAATTAACTAGATTGT
  • 601 GCATCAACAGATCACGCTGTGAACTCTCAAGGCGCCATTCAGTTCCCCGTGTTCCACAAG
  • 661 AAGCACCAATGCCTCCGCCCATGGTCTGTCCGTGCAACCCAGGCATCCTCGACCGGAGCA
  • 721 TCAGGAGCAGGAAAAGGAGGAGGATTGAACAATCTACAGGAAGAGGAGATCACTTCATCA
  • 781 AGTAGTACAAAAATCGACGTGATCGAAGACAGCAGCATCAACGACTTCCTGTTCCTAATG
  • 841 GCCGTCAGTCTGGGCAAGCCACCGGTTGTGAACCTGGTGGCGATCGACACGGGATCCACC
  • 901 CTCTCGTGGGTGCAATGCCAGCCGTGCGCGGTGCACTGCCACACGCAGTCCGCGAAGGCC
  • 961 GGCCCGATATTCGATCCCGGCAGATCCTACACATCCCGGCGAGTTCGCTGCTCGTCGGTC
  • 1021 AAGTGCGGCGAGCTGAGGTACGATCTGCGGCTCCAGCAAGCCAATTGCATGGAGAAGGAA
  • 1081 GACAGCTGCACGTACAGCGTCACGTACGGGAACGGGTGGGCGTACAGCGTGGGCAAGATG
  • 1141 GTGACAGACACGCTGAGGATTGGGGACTCGTTTATGGATCTCATGTTCGGGTGCAGCATG
  • 1201 GATGTCAAGTACAGCGAATTCGAGGCCGGCATCTTTGGTTTCGGCAGCAGCAGCTTCTCT
  • 1261 TTCTTCGAGCAGCTGGCAGGGTACCCTGATATTCTGAGTTACAAGGCATTAAGCTACTGC
  • 1321 TTGCCCACTGACGAGACCAAGCCCGGATACATGATCCTGGGAAGATACGACCGTGCCGCC
  • 1381 ATGGATGGGGGTTACACTCCTCTCTTCCGGTCAATCAACAGGCCAACCTACTCACTGACG
  • 1441 ATGGAGATGCTTATCGCCAACGGGCAGAGATTGGTGACATCGTCTTCGGAGATGATCGTC
  • 1501 GATTCCGGGGCCCAGAGGACGTCCCTGTGGCCTTCCACTTTTGCTCTCCTTGACAAGACC
  • 1561 ATCACGCAGGCAATGTCGTCGATTGGGTATCACCGGACATCAAGAGCGCGCCAAGAATCA
  • 1621 TACATCTGCTACTTATCGGAGCACGACTATTCTGGTTGGAACGGCACCATCACGCCCTTC
  • 1681 TCCAACTGGTCCGCCTTGCCTCTGCTGGAGATCGGCTTCGCCGGCGGTGCTGCACTCGCT
  • 1741 TTGCCACCCAGAAACGTCTTCTACAACGATCCACACCGCGGTTTGTGCATGACCTTTGCT
  • 1801 CAGAATCCTGCTCTCAGGTCTCAGATACTGGGGAACAGGGTTACTCGATCCTTCGGAACA
  • 1861 ACCTTCGACATCCAGGGGAAACAATTCGGCTTCAAATATGCCGTTTGCTGATCGTCGATT
  • 1921 ATTCCTCATCCTATGATATCTTATAGCTTGCGGGTACGTACCAAGTATATATCAAACTAA
  • 1981 TTGCATACATGCTCTCCCTCCCTCTGTCCATGCATGTCCTCGTTTCATTGCAAATCTGCA
  • 2041 TCGATCAATCCAGTTACTGATAATTCCTCCTTATTAACTTAGGCTGATCGATCCATTGCT
  • 2101 TCTCGTGTGTATATTATGCAGGTCGATTAATTAGCTGGTTTGCCCAAATAACTGATCGGA
  • 2161 TTGGAGTCTTCTCCCGCGCTACACTACCCCTAGCTGCGATCGTATCACAAGCTAGCGGTA
  • 2221 CTTGATTTGGGACCTAATTCGTTCAAAAAAAACTTGGCAGCTTAATTTGGGACCTAGTAG
  • 2281CTAGCTGAGCCACTACTAGATGTTTACGTACCAGCTATCCGTCGTTTGTTTGTGTCTCCT
  • 2341 GTGCTTGTGCT 2351bp
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(二)聚合酶链式反应(PCR)扩增基因
  • 利用PCR方法可以在数小时内使目的DNA片段扩增到数百万个拷贝。
  • 基本原理:

根据待扩增基因的部分序列合成成对引物,在体外合成两个引物之间的DNA序列。

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PCR反应
  • 根据待扩增基因序列合成两个引物,10-20bp,分别与待扩增基因二条链的两端互补。
  • 在DNA模板变性成单链后,两个引物分别与单链DNA复性,在耐热的Taq polymerse及4种脱氧核苷酸存在下,由引物引导合成DNA新链。
  • 3个步骤:

变性 94-95℃,双链变性成单链

复性 50-70℃,两个引物分别与单链DNA互补

延伸 72℃,在引物Taq酶的作用下从5\'→3\'的方向合成模板DNA的互补链。

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PCR反应常有25-35个循环
  • 经过25个循环以后,理论上原来一个分子DNA可以扩增为106个拷贝。
  • 仅用少量的模板DNA分子,可以得到大量扩增产物。
  • 通常可以扩增5kb左右的DNA片段。
  • 性能更好的Taq酶可以扩增长达40kb的DNA片段。
  • PCR扩增的DNA序列经过核酸序列测定分析后,可作为基因工程的目的基因。
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PCR技术的关键
  • 人工合成寡核苷酸片段(引物)
  • 耐热的Taq DNA polymerase

(来自Thermus aquaticus,94kDa)

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PCR方法已成为分子生物学研究常规手段
  • 而且还用于遗传、发育、进化、疾病诊断、法医学等领域
  • PCR技术的发明是现代生物学发展史上的又一个里程碑
  • 发明人获得了1993年诺贝尔化学奖
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(三) 人工合成基因
  • 根据已知的基因序列,或根据氨基酸序列推测DNA序列
  • 将化学合成寡核苷酸的方法与酶促合成DNA的方法结合起来,可以很快地人工合成基因。
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首先化学合成多个含有80-100个核苷酸的寡聚核苷酸首先化学合成多个含有80-100个核苷酸的寡聚核苷酸
  • 每个寡聚核苷酸片段之间有19-24个核苷酸的重叠序列
  • 再将各个寡聚核苷酸等量(摩尔浓度)混合,在DNA聚合酶 (或Taq酶)作用下,各寡聚核苷酸又作为引物合成新链,使单链部分补齐成为双链。
  • 再用两个PCR引物,经PCR扩增出DNA片段。若将两个DNA片段放在一起,经SOE-PCR(sequence overlapped extension,SOE)扩增出完整的基因片段
t dna
(四) T-DNA标签克隆基因
  • 利用T-DNA插入创造突变体
  • 获得突变体的纯合材料
  • 分析突变体性状与T-DNA的共分离关系
  • PCR获得T-DNA的侧翼基因组序列
  • 用所得序列作探针筛选基因文库,获得目标基因或克隆
  • 再作进一步的分析
t dna1
T-DNA标签克隆基因的基本原理

构建T-DNA载体

转化植物(T1,T-DNA杂合体)

筛选T2,获得突变体

寻找与T-DNA共分离的个体

让其自交,产生纯合体

PCR获得T-DNA两侧的基因组序列

利用侧翼DNA序列作探针从DNA文库中钓取基因

基因功能验证

(遗传互补测验,用分离的野生基因转化突变体,恢复功能)

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重组DNA分子的构建
  • 用相同的内切酶酶解目的基因与载体
  • 将载体与目的基因混合
  • 用DNA ligase连接
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§5 外源基因导入宿主细胞
  • 将目的基因与载体连接,构建重组DNA分子
  • 重组DNA分子必须导入宿主细胞才能扩增或表达
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重组DNA导入原核生物
  • 原核生物基因工程的受体通常是大肠杆菌
  • 导入方式多用转化法
  • 也有用结合的方法
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重组DNA导入植物

1、根癌农杆菌转化技术

2、基因枪法

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根癌农杆菌转化技术
  • 根癌农杆菌

(Agrobacterium tumefaciens)

  • 根癌农杆菌介导的植物转化是应用得最早而广泛的一种植物转化方法。
  • 双子叶植物、单子叶植物都可以用。
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将目的基因与花椰菜花叶病毒35S启动子及终止子组成嵌合DNA分子将目的基因与花椰菜花叶病毒35S启动子及终止子组成嵌合DNA分子
  • 插入到Ti衍生质粒的RB与LB之间构成重组质粒
  • 转化根瘤土壤杆菌细胞
  • 重组根瘤土壤杆菌感染植物细胞
  • 使质粒的部分DNA与目的基因一起整合到植物染色体上,实现遗传转化
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基因枪法
  • 基因枪(gene gun)法,又称微粒轰击法(microprojectile bombartment,biolistics)
  • 依赖高速的金属微粒将外源基因导入植物细胞
  • 优点:无宿主限制,可用于任何基因型的材料
  • 缺点:转化频率低,结果重复性差,多拷贝导入导致基因沉默,实验成本高
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基因工程的应用

1、生物科学基础研究的重要手段

2、改良植物

3、改良动物

4、基因工程工业

5、疾病诊断与基因治疗

6、环境保护

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生物科学基础研究的重要手段
  • 基因结构的重叠现象和不连续性
  • mRNA的剪辑
  • 转座因子
  • 基因表达的调控
  • 生物与环境信号的识别
  • 癌变机理
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改良植物
  • 抗虫植物
  • 抗除草剂植物
  • 1996年开始转基因作物投入生产
  • 2003年,抗虫作物 1000万hm2

抗除草剂作物 5000万hm2

  • 美国转基因棉花 80%;全球 50%
  • 我国进口的大豆绝大部分是转基因大豆
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改良动物
  • 比转基因植物发展慢
  • 原因:涉及社会伦理和宗教问题
  • 在技术上动物细胞的再生能力
  • 克隆羊Dolly
  • 转基因鱼是比较成功的
  • 将重组DNA导入受体合子细胞核中,借助于母体环境实现转基因动物生产
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基因工程工业
  • 生产工业、农业、药用蛋白质
  • 转移花色基因或特异性状,改变花卉的花色和外观,提高观赏价值
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疾病诊断和基因治疗
  • 正常基因替代缺陷基因
  • 修复突变基因
  • 制造疾病诊断试剂盒
  • 生产疫苗

用酵母菌生产人乙肝疫苗是第一个真核生物基因工程的商业化产品

  • 有人设想将蜘蛛丝弹性蛋白基因转入植物,生产弹性蛛丝蛋白,治疗人类软骨细胞增生
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基因工程用于环境保护

利用转基因微生物降解污染物

如:油船事故的处理

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转基因生物的安全性
  • 对环境的安全性
  • 对人类健康的安全性
  • 宗教及伦理问题
  • 风险未知
  • 既不能夸大风险,也不能掉以轻心
  • 国家有完善的安全性评价程序和一系列的政策法规