Células Dendríticas:
This presentation is the property of its rightful owner.
Sponsored Links
1 / 1

Células Dendríticas: Um Vigilante contra o cancro/Explorando Novas Vacinas PowerPoint PPT Presentation


  • 59 Views
  • Uploaded on
  • Presentation posted in: General

Células Dendríticas: Um Vigilante contra o cancro/Explorando Novas Vacinas. DOMINGOS, Cátia 1 ; FARINHA, Diogo 2 ; FERREIRA, Mariana 3 ; LAMY, Ana 1 ; CABRAL, Guadalupe 4 ; SILVA, Zélia 4

Download Presentation

Células Dendríticas: Um Vigilante contra o cancro/Explorando Novas Vacinas

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation

Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author.While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server.


- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - E N D - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

Presentation Transcript


C lulas dendr ticas um vigilante contra o cancro

Células Dendríticas:

Um Vigilante contra o cancro/Explorando

Novas Vacinas

DOMINGOS, Cátia1; FARINHA, Diogo2; FERREIRA, Mariana3; LAMY, Ana1; CABRAL, Guadalupe4; SILVA, Zélia4

1Escola SecundáriadaAmadora, 2Colégio SagradoCoração de Maria; 3Escola Secundária José Gomes Ferreira; 4Universidade Nova de Lisboa , Centro de Estudos de DoençasCrónicas – CEDOC – Faculdade de CiênciasMédicas

Na última década, têm-se realizado inúmeros estudos na tentativa de manipular o sistema imunitário com o objectivo de produzir vacinas celulares para usar como terapia.

Neste sentido, tem-se estudado o potencial de um tipo de células do sistema imunitário – as Células Dendríticas (DCs, dendritic cells). As DCs são células com longas extensões membranares que têm elevada capacidade fagocítica no estado imaturo e capacidade profissional de apresentação de antigénios processados aos linfócitos T. A activação destes linfócitos é, por sua vez, essencial para uma resposta eficaz contra organismos invasores ou contra células cancerígenas.

O processo de produção de células dendríticas para utilizar em imunoterapia envolve o isolamento de monócitos do sangue periférico e sua diferenciação in vitro em células dendríticas. Estas células são designadas dendríticas derivadas de monócitos e são re-inoculadas no paciente após terem contactado com antigénios tumorais do mesmo.

  • OBJECTIVOS

  • Contacto com o procedimento de obtenção de células dendríticas (DCs) a partir de monócitos – Isolamento de Monócitos;

  • Familiarização com técnicas de laboratório normalmente utilizadas para o estudo das células;

  • Caracterização fenotípica das células nas várias fases de isolamento – Monitorização do Isolamento.

  • A técnica de Citometria de Fluxo foi usada para:

  • Monitorização de todas as fases do processo de isolamento de monócitos a partir de sangue periférico;

  • Avaliação da eficácia da estimulação das DCs pelo LPS.

Neste trabalho, procedeu-se ao isolamento de monócitos e induziu-se a sua diferenciação em células dendríticas por adição das citocinas IL4 e GMCSF ao meio de cultura. Seguidamente, induziu-se a maturação das DCs, por estimulação com LPS, e avaliou-se a eficácia desta estimulação.

MONITORIZAÇÃO DO ISOLAMENTO - RESULTADOS EXPERIMENTAIS

Método Utilizado – Citometria de Fluxo – Fenotipagem das DCs

PROCEDIMENTO

Duas lavagens e centrifugação com PBS

Centrifugação em anel leucocitário descontínuo

Dimensão e nível de complexidade das células

Nível de expressão de CD14 nas células

1- ISOLAMENTO DE MONÓCITOS A PARTIR DE SANGUE PARA OBTENÇÃO DE DCs

Plasma

Plasma

Observou-se a presença de duas populações: Linfócitos eMonócitos.

Amostra

Centrifugação

Centrifugação

1.1.

Leucócitos

Anel Leucocitário

1.2.

Ficoll

Gráfico 1.1.:

Linfócitos – pequenas dimensões;

Monócitos – maiores dimensões.

Gráfico 1.2.:

Linfócitos – CD14- e CD3+;

Monócitos – CD14+ e CD3-.

Eritrócitos

Amostra de Sangue

Ficoll

Eritrócitos e

Granulócitos

Retirou-se uma alíquota para se fazer a monitorização

  • Remoção do plasma

  • Remoção do anel leucocitário

  • Adição de Ficoll

  • Remoção do anel leucocitário

  • Adição de PBS

Legenda gráficos 3.1, 3.2. e 3.3.:

DC não estimuladas HLA-DR, CD83, CD45, CCR7

DC não estimuladas CD45

DC estimuladas com LPS HLA-DR, CD83, CD45, CCR7

DC estimuladas com LPS CD45

Nível de expressão de CD3 nas células

Nível de expressão de CD14 nas células

  • Observou-se que as células desta alíquota:

  • Gráfico 2.1.:

  • Expressavam CD3.

  • Gráfico 2.2.:

  • Não expressavam CD14 .

  • Foram removidos os linfócitos da amostra (CD3+ e CD14-).

2.1.

2.2.

Recolha de amostra que não marca com CD14

2- SEPARAÇÃO IMUNOMAGNÉTICA COM COLUNAS LS

Retirou-se uma alíquota de cada tubo de ensaio para se fazer a monitorização

Recolha de amostra que marca com CD14

“Tampão Beads” e marcação de monócitos com CD14 MicroBeads

Coluna Magnética

Nível de expressão de CD14 nas células

Nível de expressão de CD3 nas células

Observou-se que:

Gráfico 2.3.:

89,13% das células não expressavam CD3;

1,52% das células expressavam CD3.

Gráfico 2.4.:

89,13% das células expressavam CD14;

1,52% das células não expressavam CD3.

9,53% das células são contaminantes (granulócitos).

Ou seja, 89,13% das células são monócitos, não expressavam CD3 e expressavam CD14 e 1,52% das células são linfócitos, expressavam CD3 e não expressavam CD14.

2.4.

2.3.

Diferenciação de monócitos em células DCs

Maturação das DCs induzida no 5º dia de diferenciação das células

3- CULTURA DE CÉLULAS COM INDUÇÃO DE DIFERENCIAÇÃO EM DCs

Nível de expressão de CD83 nas DCs

Nível de expressão de HLA-DR nas DCs

Nível de expressão de CCR7 nas DCs

3.1.

3.3.

3.2.

Citocinas IL4 e GMLCSF

Estímulo LPS

Monócito

DC imatura

DC matura

Legenda gráficos 1.1, 1.2., 2.1., 2.2, 2.3.,2.4.:

CD14-

HLA-DR++

CD83-

CCR7-

CD14-

HLA-DR+++

CD83+

CCR7+

t = [1;5[ dias

t = [5;6[ dias

Observou-se um aumento na expressão dos marcadores HLA-DR e CD83( gráficos 3.1. e 3.2., respectivamente).

Linfócitos

Monócitos

Contaminantes

CONCLUSÕES

A Citometria de Fluxo é uma técnica comummente utilizada na fenotipagem e contagem de células, dado que avalia vários parâmetros como o volume, a complexidade morfológica e fluorescência da célula.

Para a monitorização do isolamento de monócitos, utilizaram-se os anticorpos anti-CD3, que marcaram os linfócitos, e anti-CD14, que marcaram os monócitos. Antes de aplicar a amostra na coluna, esta continha monócitos e linfócitos. Após aplicação da amostra na coluna, obteve-se duas fracções: a CD3+; CD14-, maioritariamente com linfócitos, e a CD3-;CD14+, maioritariamente com monócitos. A segunda fracção tinha um grau de pureza de 89%, pelo que se conclui que o processo de isolamento foi bem sucedido.

O LPS foi eficaz na indução da maturação das DCs, aumentando a expressão dos marcadores HLA-DR e CD83. Observou-se, no entanto, que algumas das DCs diferenciadas tinham iniciado o processo de maturação na ausência de estímulo (LPS), daí a presença de dois picos nos níveis de expressão de HLA-DR nas DCs não estimuladas.

Agradecimentos:Universidade Nova de Lisboa, Centro de Estudos de DoençasCrónicas – CEDOC – Faculdade de CiênciasMédicas (Dra. Guadalupe Cabral e Dra. Zélia Silva) e à Ciência Viva.


  • Login