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ENSAIOS IMUNOQUÍMICOS Técnicas Imunológicas Ensaios Hormonais PowerPoint PPT Presentation


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ENSAIOS IMUNOQUÍMICOS Técnicas Imunológicas Ensaios Hormonais. BIOMEDICINA FIEL. DAISY DE SOUZA ARAÚJO . PATOLOGISTA-CLÍNICO. Reações imunoquímicas. Reação - ANTÍGENO + ANTICORPO – princípio básico: detecção deste complexo Reação química especial

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ENSAIOS IMUNOQUÍMICOS Técnicas Imunológicas Ensaios Hormonais

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Presentation Transcript


Ensaios imunoqu micos t cnicas imunol gicas ensaios hormonais l.jpg

ENSAIOS IMUNOQUÍMICOSTécnicas Imunológicas Ensaios Hormonais

BIOMEDICINA FIEL

DAISY DE SOUZA ARAÚJO

PATOLOGISTA-CLÍNICO


Rea es imunoqu micas l.jpg

Reações imunoquímicas

  • Reação - ANTÍGENO + ANTICORPO – princípio básico: detecção deste complexo

    • Reação química especial

      • Reconhecimento do antígeno (depende do tipo de antígeno a ser pesquisado))

        • Superfície da célula

        • Disperso em solução

      • Parâmetros que dependem do Anticorpo Utilizado

        • Sensibilidade (anticorpos policlonais ou monoclonais, classe de anticorpo)

        • Especificidade anticorpos policlonais ou monoclonais, classe de anticorpo)

        • Afinidade

        • Avidez

        • Diversidade


Classifica o dos imunoensaios l.jpg

Classificação dos Imunoensaios


Rea es de precipita o l.jpg

Reações de Precipitação

  • QUANTIFICAÇÃO dos complexos formados pela reação Antígeno+anticorpo que se precipitam no meio.

  • Reação Antígeno x Anticorpo é REVERSÍVEL

    • O precipitado se dissolve quando há excesso de um dos componentes: FENÔMENO PR0-ZONA

  • Desnecessária separação do complexo antígeno+anticorpo (fase ligada) das substâncias livres no meio

  • COMPLEXO ANTÍGENO-ANTICORPO pode ser quantificado:

    • visualmente a olho nu

    • visualmente usando um microscópio

    • por medida da turbidez (turbidimetria)

    • quantificado por nefelometria


Rea es de precipita o5 l.jpg

Reações de Precipitação

  • Fatores interferentes:

    • Concentrações do antígeno e do anticorpo presentes no “sistema” (amostra+reagente)

    • Outros fatores físico-químicos (temperatura, pH)

    • Precipitação máxima: concentrações equivalentes de Antigeno (Ag) e Anticorpo (Ac)

  • Sensibilidade:

    • 10 microgramas/mL


Rea es de precipita o direta cl ssica l.jpg

Reações de Precipitação Direta Clássica

  • triagem inicial p/ SÍFILIS OU LUES

    • VDRL– Venereal Desease Research Laboratory

    • RPR – Reagina Plasmática Rápida

    • RPS - Reagina Para Sífilis

    • medido nestas reações:

      • presença de anticorpos para o material lipoproteico das células danificadas pela doença.

      • presença de anticorpos para a cardiolipina dos Treponemas

  • Métodos não treponêmicos e INESPECÍFICOS

  • Sensibilidade:

    • 78% na fase primária (74 a 87%)

    • 100% na fase secundária

    • 95% na fase latente (88 a 100%)

    • 71% na fase tardia (37 a 94%)


Rea es de precipita o derivadas l.jpg

Reações de Precipitação DERIVADAS

  • MANUAIS

    • Imunodifusão

    • Imuno-eletroforese (contra imuno eletroforese)

    • Imunofixação

    • Eletroimunodifusáo

      • UTILIZADAS EM LABORATÓRIOS DE PESQUISA

  • AUTOMATIZADAS

    • NEFELOMETRIA E TURBIDIMETRIA

      • UTILIZADAS EM GRANDES LABORATÓRIOS


Nefelometria e turbidimetria l.jpg

Nefelometria e Turbidimetria

  • Possibilidade de Automação total

  • Nefelômetros

  • Equipamentos de bioquímica (turbidimetria)

  • Dosagem de proteínas em sangue e outros fluidos (exemplo LCR)

    • Alfa 1 glicoproteína ácida (mucoproteína)

    • Fator Reumatóide

    • Microalbumina

    • Proteína C Reativa

    • Apoliproproteína

    • inúmeras outras substâncias (imunoglobulinas, transferrina etc)


Rea es de aglutina o l.jpg

Reações de Aglutinação

  • Formação de agregados grandes de partículas com múltiplos determinantes antigênicos interligados por pontes moleculares de anticorpos;

  • Ligação: sítios antigênicos iguais em diferentes partículas

  • Detectam tanto a presença de IgM quanto de IgG

  • Visualização: depende do tamanho dos agregados formados

  • Pode ser realizadas em placas, tubos ou lâminas:


Rea es de aglutina o fatores interferentes l.jpg

Reações de AglutinaçãoFatores interferentes:

  • Classe do Anticorpo envolvido;

  • Eletrólitos;

  • Macromoléculas Hidrofílicas;

  • Enzimas;

  • pH (6 a 8);

  • Tempo;

  • Temperatura


Falso negativas l.jpg

Falso Negativas

  • Quantidade pequena de anticorpos:

    • a partícula ficar com o anticorpo preso ‘a sua superfície (sensibilizada), não formando pontes e não aglutinando;

  • Quantidade muito grande de anticorpos (fenômeno Pró-zona)


Tipos de particulas utilizadas l.jpg

TIPOS DE PARTICULAS UTILIZADAS

  • Determinantes antigênicos Naturais:

    • Eritrócitos humanos – determinação grupo sangüíneo ABO

    • Bactérias – SLIDEX meningites

    • Protozoários

  • Partículas inertes revestidas

    • Látex (mais comum) – teste de gravidez

    • Gelatina

    • Betonita, polipeptídeos

  • Células antigenicamente não relacionadas

    • Células revestidas com antígenos solúveis: ou com antígenos solúveis adsorvidos ou fixados

      • Hemácias e bactérias


Aglutina o t cnicas mais utilizadas l.jpg

Aglutinação: Técnicas mais Utilizadas

  • Aglutinação direta : ex teste de gravidez

  • Aglutinação passiva

  • Hemaglutinação direta: ABO RH

  • Hemaglutinação indireta: Toxoplasmose

  • Hemaglutinação Passiva

  • Inibição de Hemaglutinação

  • Inibição de Hemaglutinação passiva


Imunofluoresc ncia manual 1 l.jpg

Imunofluorescência Manual 1

  • Baseia-se na capacidade das moléculas de anticorpo se ligarem covalentemente a fluocromos, mantendo a especificidade contra o antígeno.

  • Reagentes Utilizados:

    • Anticorpos Marcados (Fluocromos – Isotiocianato de Fluoresceína* )

    • Glicerina Alcalina

    • Corantes (Azul de Evans)


Imunofluoresc ncia manual 2 direta l.jpg

Imunofluorescência Manual 2 - DIRETA

  • A reação Ag-Ac é detectada pela emissão de fluorescência

  • Pesquisa de antígeno

  • • amostra (Ag??) + Ac específico conjugado a substância fluorescente (conjugado)*

  • microscópio de fluorescência


Imunofluoresc ncia manual 3 ifi indireta l.jpg

Imunofluorescência Manual 3 – IFI - INDIRETA

A- pesquisa de antígeno

  • • amostra (Ag??) + Ac específico ®Ag-Ac *

  • • Ag-Ac + conjugado anti-imunoglobulina *

  • • microscópio de fluorescência

  • • * lavagens

    B- pesquisa de anticorpos

  • • Ag (lâmina) + soro do paciente (Ac??) ® Ag-Ac *

  • • Ag-Ac + conjugado anti-imunoglobulina *

  • • microscópio de fluorescência

  • • determinação do título e classe do Ac


Imuno ensaios quantitativos classifica o tipo de rea o cin tica l.jpg

IMUNO-ENSAIOS QUANTITATIVOSclassificação tipo de reação (cinética)

  • COMPETITIVOS

    • Há competição entre a substância presente na amostra (ou o padrão) e outro marcado com alguma substância geradora de sinal, por uma quantidade limitada de anticorpos específicos – variante: Radioimunoensaio (RIA).

  • NÃO COMPETITIVOS:

    • São utilizados dois anticorpos, um ligado à fase sólida e outro marcado com alguma substância geradora de sinal, que se ligam a SUBSTÂNCIA em estudo - Mais preciso e reprodutível, e possui níveis de sensibilidadeanalítica superiores. Desvantagem, precisam ter dois epítodos. Variante: Imunométrico


Competitivo ou n o l.jpg

Competitivo:

Quanto maior a concentração do analito menor a contagem do sinal

Amostras positivas tem leitura abaixo do valor limiar ou “cut-off”

Não Competitivo

Quanto maior a concentração do analito maior a contagem do sinal

Amostras positivas tem leitura acima do valor limiar ou “cut-off”

Competitivo ou não


Imunoensaios quantitativos l.jpg

IMUNOENSAIOS QUANTITATIVOS:

  • COMPETITIVOS

    • anticorpo primário na fase sólida – (pag 963) e antígeno marcado

    • anticorpo secundário na fase sólida – (pag 964) e antígeno marcado

  • NÃO COMPETITIVOS

    • SEQUENCIAL

    • SANDUÍCHE


Imunoensaios quantitativos classifica o tipos siglas l.jpg

IMUNOENSAIOS QUANTITATIVOS:CLASSIFICAÇÃO TIPOS / SIGLAS

  • Marcador radioativo:

    • Radioimunoensaio (RIE)

    • Imunorradiométrico (IRMA)

  • Marcador enzimático Enzimaimunoensaio (EIA)

    • ELISA - Ensaio imunoenzimático

    • MEIA - Ensaio imunoenzimático de micropartículas

  • Marcador FLUORESCENTE

    • Imunofluorométrico (IFMA)

    • FPIA – Fluorescence polarization immunoassay

    • ELFA -Enzyme Linked Fluorescent Assay

  • Marcador QUIMIOLUMINESCENTE

    • Quimioluminescência convencional EQL, Eletroquimioluminescência (ECLIA)

    • Ensaio imunológico quimioluminescente magnéticoCMIA


Imunoensaios quantitativos33 l.jpg

IMUNOENSAIOS QUANTITATIVOS:

  • Fatores Interferentes:

    • Reação cruzada: Ocorrem devido a, baixa especificidade dos anticorpos utilizados e o uso de anticorpos policlonais.

    • Presença de Anticorpos Heterófilos: Resultados falso positivos ou altos em pacientes transplantados ou submetidos a tratamento com antoicorpos monoclonais


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IMUNOENSAIOS QUANTITATIVOSFatores interferentes II

  • Contagem de fundo elevada (Background) Leituras mais elevadas do que as reais por ligação inespecífica de constituintes do soro ao suporte sólido, lavagens inadequadas ou conjugados de pobre afinidade.

  • Efeito HooK Resultados menores do que o esperado na quantificação de substâncias que na realidade encontram- se elevadas, bloqueando a ligação.


Ensaios com marcadores radioativos ria rie irma l.jpg

Ensaios com marcadores RADIOATIVOS – RIA, RIE, IRMA

  • pouco usado na rotina: exige profissional com credenciamento na CNEN (curso de seis meses em São Paulo)

  • um dos componentes do sistema é marcado com isótopo radioativo

    • ensaios competitivos : o reagente marcado é = à substância que se quer dosar (antígeno) (RIA/RIE)

    • ensaios não competitivos: o reagente marcado é um segundo anticorpo (IRMA)

  • O radioisótopo mais utilizado é o I125 (57,5 dias)


Ensaios com marcadores enzim ticos eia elisa meia elfa l.jpg

Ensaios com marcadores ENZIMÁTICOS – EIA, ELISA, MEIA, ELFA

  • EIA – Enzyme Imunoassay - Ensaio imunoenzimático

  • ELISA - Enzyme- Linked ImmunoSorbent Assay

  • MEIA – Microparticule Enzyme Immuno Assay ou Ensaio imunoenzimático de micropartículas

  • ELFA – Enzyme- Linked Fluorescent Assay: Ensaio imuno-enzimático fluorescente


Etapas elisa eia l.jpg

ETAPAS ELISA, EIA

  • sensibilização (ou cobertura) da fase sólida: adição de Ag ou do Ac

  • bloqueio (proteína inerte: soro fetal bovino, leite desnatado) *

  • adição da amostra (em diluente) *

  • adição do conjugado: anticorpo purificado marcado com enzima (ex: peroxidase) *

  • adição do substrato cromogênico: peroxidase: H2O2 (substrato) + OPD (ortofenilenodiamina)

  • interrupção da reação: SDS ou ácido forte

  • leitura: leitor de ELISA

    * lavagens


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EIA – ELISA Vantagens e Desvantagens

  • Sensibilidade, especificidade e simplicidade da técnica;

  • Cuidados com interferentes, reações cruzadas

  • Versatilidade, rapidez, baixo custo e objetividade da leitura;

  • Erros operacionais, variáveis analíticas

  • Adaptação a diferentes graus de automação

  • Instabilidade dos reagentes

  • Influência em manipulações e do equipamento


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Ensaios com marcadores FLUORESCENTES – MEIA, ELFA, FPIA

  • MEIA – Microparticule Enzyme Immuno Assay ou Ensaio imunoenzimático de micropartículas (detecção é fluorescente – Axsym) (ABBOTT)

  • ELFA – Enzyme- Linked Fluorescent Assay: Ensaio imuno-enzimático fluorescente

  • IFMA: Immuno FluoroMetric Assay ou ensaio Imunofluorométrico

  • FPIA: Fluorescence Polarization ImmunoAssay


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Ensaios com marcadores FLUORESCENTES

  • Utilizam enzimas com substratos Fluorescentes

  • Utilizam aparelhos denominados de Fluorômetros;

  • As técnicas diferem quanto ao suporte sólido

  • As técnicas diferem também á forma de ampliar o sinal;

    • Exemplos: MEIA, ELFA, FEIA; FPIA

  • Possui sensibilidade e especificidades elevadas;

  • Bom método para dosagens hormonais


Quimioluminesc ncia i l.jpg

QUIMIOLUMINESCÊNCIA I

  • Reação entre o Ag/Ac, marcada com fosfatase alcalina. Hidrolisa o substrato Quimioluminescente gerando um produto instável o qual após estabilização gera emissão de fótons de luz medida por FM, que tem a função de transformar a luz emitida pelos fótons em impulsos elétricos(CPS).

  • São reações de oxidação ►luz no espectro visível;


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QUIMIOLUMINESCÊNCIA II

  • A sensibilidade de um método enzimático aument cerca de dez vezes mais substituindo um substrato cromogênico por um luminescente;

  • É a emissão de luz produzida em algumas reações químicas envolvendo moléculas que emitem luz, quando passam do estado de excitação para o basal eletrônico;

  • São altamente sensíveis;

  • Método de escolha para quantificação de substâncias, como hormônios e marcadores tumorais.


Quimioluminesc ncia pra que serve qual vantagem l.jpg

QUIMIOLUMINESCÊNCIAPra que serve??? Qual vantagem?

  • UTILIDADES:

    • Dosagem de marcadores tumorais (PSA, CA-125, CA 15-3, CA-19-9, CEA, AFP)

    • HORMÔNIOS

    • DOENÇAS INFECCIOSAS: HIV, Hepatites,

    • VITAMINAS

    • DOSAGEM DE IGE TOTAL

    • HOMOCISTEÍNA

  • VANTAGENS:

    • Sensibilidade – 10 x maior na troca de substrato cromogênico por um luminescente


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