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植物基因组 DNA 的提取 及 纯度与含量的测定

植物基因组 DNA 的提取 及 纯度与含量的测定. 实验八. 第一部分. 植物基因组 DNA 的提取. 一、实验目的和要求 1 、学习并掌握植物基因组 DNA 的提取原理和方法； 2 、了解琼脂糖凝胶电泳检测核酸的原理和操作； 3 、学习并掌握对电泳检测基因组 DNA 结果的初步分析。. 二、实验基本原理

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植物基因组 DNA 的提取 及 纯度与含量的测定

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  1. 植物基因组DNA的提取及纯度与含量的测定 实验八

  2. 第一部分 植物基因组DNA的提取

  3. 一、实验目的和要求 1、学习并掌握植物基因组DNA的提取原理和方法； 2、了解琼脂糖凝胶电泳检测核酸的原理和操作； 3、学习并掌握对电泳检测基因组DNA结果的初步分析。

  4. 二、实验基本原理 植物基因组DNA的提取方法就其提取原理主要有二种：十六烷基三乙基溴化铵（CTAB)法、十二烷基硫酸钠 (SDS)法。十六烷基三甲基溴化铵和十二烷基硫酸钠等离子型表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以游离出来。再加入苯酚和氯仿等有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸(DNA、RNA)水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。上清液中加入无水乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于TE溶液中，即得植物基因组DNA溶液。 由于植物中的次生代谢产物——多酚类化合物可介导DNA降解，而多糖的污染也是影响植物核酸纯度最常见的问题，这些多糖能抑制限制酶、连接酶及DNA聚合酶等分子生物学酶类的生物活性。传统的CTAB-DNA提取法步骤多，较烦琐，DNA产率低，而且由于酚很难完全去除，容易影响以后的酶切等工作的效率。SDS法操作简单，温和,也可提取到较高分子量DNA，但所得产物含糖类杂质较多,这将直接影响DNA的限制性核酸内切酶酶切效果。由于植物细胞匀浆含有多种酶类(尤其是氧化酶类)对DNA的抽提产生不利的影响，在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂(如巯基乙醇)以降低这些酶类的活性。

  5. DNA的琼脂糖凝胶电泳鉴定: DNA分子在琼脂糖凝胶中有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在高于等电点的溶液中带负电荷，它在电场中向正极移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即具有不同的相对分子量的DNA片段泳动速度不同。DNA片断在凝胶中当用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙锭（EB）染色后，在紫外光下可见橙红色带，并可确定DNA片断在凝胶中的位置。

  6. 影响DNA泳动速率（迁移率）的因素有： ⑴ DNA分子质量的影响：双链DNA分子迁移的速率与DNA分子量对数成反比。分 子量越大，迁移率越小。 ⑵ DNA构型的影响：超螺旋DNA＞线状DNA＞开环DNA ⑶ 胶浓度的影响： 浓度越低，相同核酸分子迁移越快，一般常用的凝胶浓度 为1％～2％； ⑷ 电场强度的影响：电场强度愈大，带点颗粒的泳动越快。但凝胶的有效分 离范围随着电压增大而减小，所以电泳时一般采用低电压，（一般5V/cm） （电场强度） 。而对于大片段电泳，甚至用0.5～1.0V/cm电泳过夜。进行 高压电泳时，只能使用聚丙烯酰胺凝胶。 ⑸ EB的影响：溴化乙锭（EB）插入双链DNA造成其负电荷减少、刚性和长度增 加。 ⑹ 电泳缓冲液的影响:核酸电泳常采用TAE、TBE、TPE三种缓冲系统，但它们 各有利弊。TAE价格低廉，但缓冲能力低，必须进行两极缓冲液的循环。 TPE在进行DNA回收时，会使DNA污染磷酸盐，影响后续反应。所以多采用 TBE缓冲液。在缓冲液中加入EDTA，可以鳌合二价离子，抑制DNase，保护 DNA。缓冲液pH常偏碱性或中性，此时核酸分子带负电，向正极移动。 ⑺ 碱基组成与电泳温度的影响:一般影响不大

  7. 在DNA提取过程中必须始终注意以下几个关键问题：在DNA提取过程中必须始终注意以下几个关键问题： （1）DNA的二级结构和双链易受多种因素（如强酸、强碱、加热、低盐浓度、有机溶剂、酰胺类、尿素等）的影响引起双链解开，即“变性”，因此抽提时避免使用变性的条件。 （2）抑制内外源DNase的活力。DNase就象一把刀，它能把大分子的DNA切成碎片，所以要加以杜绝，现可以通过多种途径来做到这一点：a、低温操作；b、调节pH，使偏碱（pH8.0）；c、抽提液中加表面活性剂；d、加螯合剂（EDTA）除去酶的铺助因子（Mg2+），使酶活性丧失。 （3）防止化学降解。如过酸或过碱以及其它化学因素，会使DNA降解，一般综合考虑，取pH8.0左右为宜。 （4）防止物理因素降解。如温度太高或机械张力剪切等，DNA分子特别大，极易被机械张力拉断，甚至在细管中稍急一些的流动也会使DNA断裂，所以在抽提过程中要特别注意这一点，操作过程要尽量简便、温和、减少搅拌次数，也不要剧烈摇动。 （5）植物的次生代谢物（主要是胞质内的多酚类或色素类化合物）对核酸提取有干扰作用。因此，一般尽可能选幼嫩的、代谢旺盛的新生组织作为提取DNA的材料，这是因幼嫩的新生组织次生代谢物较少，DNA含量高，且易于破碎，植物材料最好是新鲜的。

  8. 三、实验材料与试剂 1、实验材料：植物幼嫩叶子 2、实验试剂 （1）基因组DNA提取缓冲液 （2）氯仿:异戊醇:乙醇抽提液 （3）TE缓冲液 （4）平衡酚： （5）RNA酶A （6）酚/氯仿 （7）氯仿/异戊醇 （8）异丙醇、无水乙醇、70%乙醇。 （9） 3mol/L NaAc （10） 5×TBE缓冲液 （11） 6×电泳上样缓冲液 （12） 1.0%琼脂糖凝胶 （13） EB （14） DNA分子量Markers： 125，564，2027，2322，4361，6557，9416，23130bp.

  9. 四、实验器材与仪器 1、研体 2、离心机、离心管（7ml）及离心管架； 3、微量移液器10ul、1000ul及枪头； 4、恒温水浴箱65 ℃ 5、制冰机； 6、冰箱； 7、恒温水浴箱 37℃； 8、微波炉； 9、电泳仪及电泳槽； 10、紫外检测仪。

  10. 五、实验操作方法和步骤 （一） 植物基因组DNA的提取 置于预热到65℃的研体中，加少许石英砂；加入预热到65℃的基因组DNA提取缓冲液3ml 迅速研成匀浆 转移到7ml带盖离心管中 称取植物幼嫩叶子0.5g 65℃水浴保温1hr，其间经常轻柔摇动 轻柔颠倒混匀后， 室温静置分层5min 加入3ml氯仿-异戊醇-乙醇溶液 上清液转移到干净7ml离心管中，记录体积，弃沉淀，*① 离心5,000g×5min 转移上清于新7ml离心管中，记录体积*② 加入等体积的平衡酚，轻柔颠倒混匀，室静置10min 4℃离心12,000g×10min 加入等体积酚/氯仿，轻柔颠倒混匀，室温放置15min 吸取上清转移到一新7ml离心管中，记录体积*③ 4℃离心（12,000g，5min） 加入1/10体积3mol/L NaAC和2×体积–20℃预冷的无水乙醇–20℃放置20min *⑤ 加入等体积的氯仿，颠倒混匀，室温放置5min 吸取上清转移到一新7ml离心管中，记录体积*④ 4℃离心（12,000g，10min） 4℃离心（5,000g，3min）收集沉淀*⑥ 用70%乙醇洗涤沉淀，倾倒掉乙醇溶液，干燥，让酒精完全挥发 用1mlTE溶解沉淀， 即为植物基因组DNA溶液*⑦ 加入5μl RNase（5μg/μl），37℃保温10min 4℃保存备用 ① 凝胶电泳检测基因组DNA（分子量大小、纯度） ② 紫外吸收法测定基因组DNA纯度与含量 说明：如果蛋白质和RNA未去除干净，重复酚，酚/氯仿，氯仿抽提步骤，乙醇沉淀和洗涤，重溶于TE中，继续用RNase处理，直至基因组DNA纯度和质量符合要求。

  11. *植物基因组DNA的提取操作过程现象 ① ② ④ ③

  12. *植物基因组DNA的提取操作过程现象 ⑤ ⑥ ⑦

  13. （二）琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA 1、制胶（1％琼脂糖凝胶） 在胶模上架好梳子。称取01g琼脂糖，置于250ml锥形瓶中，加100ml 0.5×TBE电泳缓冲液，加热熔化至无颗粒状琼脂糖，待其冷却至50～60℃后，加入EB，使其终浓度为0.5mg/L，摇匀后立即倒入准备好的胶模中，待胶凝固后，放入电泳槽中，倒入适量0.5×TBE（刚好淹过胶面），拔去梳子备用。（注：EB为诱变剂、致癌物，接触凝胶必须戴手套操作） 2、加样 取5ul纯化的DNA原溶液样品，与1ul 6×电泳加样缓冲液混匀，用微量移液枪小心加入样品槽中（注：勿划破或戳穿加样孔，勿带入气泡）。若DNA含量偏低，则可依上述比例增加上样量，但总体积不可超过样品槽容量。每加完一个样品要换枪头以防互相污染。注意上样时要小心操作，避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。 3、电泳 加完样后，盖上电泳槽盖，立即接通电源，使电压调到100V，恒压电泳。当溴酚蓝条带移动到距凝胶前缘约2cm时，停止电泳（约需30～60min）。 4、观察和拍照 取出胶块置于紫外灯下观察，DNA存在处可显示出肉眼可辨的橘红色荧光带，再用成像仪进行拍照，以便于分析。（注：紫外光对眼睛有害，观察时戴上防护镜或眼镜，或隔着玻璃或有机玻璃观察）。

  14. 第二部分 基因组DNA纯度与含量的测定

  15. 一、实验目的和要求 1、学习紫外吸收法测定核酸基本原理和方法； 2、学习并掌握紫外吸收法测定基因组DNA纯度与含量的方法。

  16. 二、实验基本原理 核酸——DNA和RNA所含碱基的苯环结构（嘌呤环和嘧啶环）的共轭双键具有紫外吸收的性质，它们在260nm处有最大的吸收峰。因此，可以用260nm波长进行核酸含量的测定。 波长为260nm时，DNA或RNA的光密度的大小不仅与总含量有关，也与它们的不同构型而有差异。 对标准样品来说，浓度为1μg / ml时，DNA钠盐的OD260＝0.02。 当OD260＝1时，双链DNA含量约为50μg / ml 单链DNA含量约为37μg / ml RNA含量约为40μg / ml 寡核苷酸含量约为30μg / ml（由于底物不同有差异） 1、核酸样品DNA、RNA含量的测定： 如用1cm光径石英比色皿，用 H2O稀释DNA或RNA样品n倍并以H2O为空白对照，根据此时读出的OD260值即可计算出样品稀释前DNA的含量： DNA（μg/μl）=50×OD260读数× DNA样品稀释倍数/1000 RNA（μg/μl）=40×OD260读数× RNA样品稀释倍数/1000 若样品不纯，则比值发生变化，此时无法用分光光度法对核酸进行定量，可使用溴化乙锭法或其他方法进行估算。

  17. 当DNA样品中含有蛋白质、酚或其他小分子污染物时，会影响DNA吸光度的准确测定。由于 DNA在260nm处有最大的吸收峰，蛋白质在280nm处有最大的吸收峰，盐和小分子则集中在230nm处。所以，一般情况下同时检测同一样品的OD260、OD280和OD230，计算它们的比值来判断核酸样品的纯度。 2、核酸样品纯度判断的一般标准： ⑴ DNA纯度：OD260/OD280≈1.8，表示为纯的DNA； OD260/OD280 ＞1.9，表示有RNA污染； OD260/OD280 ＜1.6，表示有蛋白质、酚等污染。 ⑵ RNA纯度：1.7 ＜OD260/OD280＜2.0，表示为纯的RNA； OD260/OD280 ＜1.7时，表示有蛋白质或酚污染； OD260/OD280 ＞2.0时，表示可能有异硫氰酸残存。 ⑶ OD230/OD260的比值应在0.4-0.5之间，若比值较高说明有残余的盐和小分子如核苷酸、氨基酸、酚等的存在。 若样品不纯，则比值发生变化，此时无法用分光光度法对核酸进行定量；同时也会影响酶切和PCR的效果。

  18. 三、实验材料与试剂 1、实验材料 植物基因组DNA样品 2、实验试剂 ⑴ ddH2O； ⑵ TE缓冲液（pH 8.0）。 四、实验器材与仪器 1、离心机、离心管（5ml）及离心管架； 2、微量移液器10ul、200ul、1000ul及枪头； 3、紫外分光光度计； 4、石英比色皿（0.5cm光径）或1cm光径的微量石英比色皿（50ul、100ul）。

  19. 五、实验操作方法和步骤 方法1： 将提取的植物基因组DNA样品吸取20ul，加到新的5ml离心管中，再加一定量的ddH2O 或TE缓冲液（pH 8.0）稀释100倍，用0.5cm光径石英比色皿（约需1.6ml样品溶液）或微量石英比色皿在紫外分光光度计上测定230nm、260nm、280nm处的吸光度。计算植物基因组DNA样品溶液的DNA的含量以及DNA样品的纯度。 方法2： 直接取植物基因组DNA样品微量原液，用分光度计进行自动测定出230nm、260nm、280nm处的吸光度值，计算植物基因组DNA样品溶液的DNA的含量以及DNA样品的纯度。

  20. ⑴用TE调0（空白）：

  21. ⑵取植物基因组DNA样品原液5ul，进行自动测定230nm、260nm、280nm处的吸光度值：⑵取植物基因组DNA样品原液5ul，进行自动测定230nm、260nm、280nm处的吸光度值：

  22. 六、计算 1、植物基因组DNA样品溶液的DNA的含量： DNA（μg/μl ）= 50×OD260读数×2*×DNA样品稀释倍数/1000 （* 用0.5cm光径石英比色皿×2，用1cm光径石英比色皿×1。） 2、植物基因组DNA样品溶液的DNA的纯度： OD260/OD280＝ OD230/OD260＝ 3、样品纯度判断： ⑴ OD260/OD280 ≈1.8，表示为纯的DNA； ⑵ OD260/OD280 ＞1.9，表示有RNA污染； ⑶ OD260/OD280 ＜1.6，表示有蛋白质、酚等污染。 七、结果分析讨论

  23. 下 次 实 验 课 实验九 氨基移换反应及其产物的鉴定

  24. 值 日

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