Mesure de spectre de fluctuations de vésicules géantes par analyse de contours ;

1. Mesure de spectre de fluctuations de vésicules géantes par analyse de contours ; application aux membranes passives et actives Jacques Pécréaux

2. (Thomas M. Terry) De la membrane cellulaire à la vésicule géante

3. Un système modèle pour les physiciens

4. Rappels sur la physique des membranes Reconnaissance de contours Résultats Validation sur les vésicules passives Résultat membranes actives Conclusion Plan de l'exposé

5. Théorie des membranes

6. -1 L= q z y x Modèle physique Canham, P. B. (1970). J. Theor. Biol.26: 61-81, Helfrich, W. (1973). Z. Naturforsch. C28: 693-703.

7. Spectre de fluctuations k module de rigidité de courbure s tension Helfrich, W. et al. (1984). Il Nuovo Cimento3D(1): 137-151.

8. kT - » u ( q , t ) u ( q , t ) ~ ~ ^ ^ 2 4 s + k e q q ^ ^ X 2 ~ ~ k = k - e c Présence d'inclusions (protéines) dans la membrane Ramaswamy, S. et al. (2000). Physical Review Letters84(15): 3494-3497.

9. [ [ ] ] 2 2 - - X X 2 2 kT kT P P w w P P w w kT kT - - » » + + a a a a u u ( ( q q , , t t ) ) u u ( ( q q , , t t ) ) ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ^ ^ ^ ^ 2 2 4 4 2 2 2 2 s s + + k k c c s s + + k k s s + + k k e e e e q q q q ( ( q q )( )( q q ) ) ^ ^ ^ ^ ^ ^ ^ ^ X X X X X X 2 2 2 2 2 2 2 2 2 - - - ~ ~ ~ P P P w w w w w w w w w ~ ~ ~ ¢ ¢ ¢ k k k = = = k k k - - - - - - r r r - - - e e e a a a P P P w w w = = = ­ ­ ­ ¯ ¯ ¯ P P P F F F a a a c c c c c c a a a a a a 2 2 2 w w w ~ ~ ~ ¢ ¢ ¢ k k k = = = k k k - - - r r r 2 2 2 2 2 2 - - - P P P w w w w w w w w w a a a ¢ ¢ ¢ ¢ ¢ ¢ = = = ­ ­ ­ ¯ ¯ ¯ P P P F F F a a a a a a 2 2 2 w w w Manneville, J.-B. et al. (2001). Physical Review E64(2): 021908. Prost, J. et al. Europhysics Letters33(4): 321-326. Membranes actives (J. Prost et al)

10. Expériences de micropipettes sur les membranes actives :

11. Bicouche lipidique (EPC) Rouge Þ passive Jaune Þ active BR H+ Vésicule Géante 10-50 mm Luecke, H. et al. (1999). Science286: 255-260. Pompe à protons photoactivable (abs. max = 570 nm) Pompage de H+(cycle 5ms) vert Þ pompage rouge Þ pas de pompage Système expérimental : vésicules contenant de la bactériorhodopsine

12. Manneville, J.-B. et al. (2001). Physical Review E64(2): 021908. A 5 ln(s) F passive 4 A p active 3 DIC p p p k k k DL Rv 8 8 8 æ ö 2 k - X eff 2 T P w P w 2 s s s = = = D D D a a a ç ÷ ln ln ln = + a a 1 2Rp ~ ç ÷ ~ ~ kT kT kT k c k T e è ø eff eff eff DP Excès d’aire du aux fluctuations 1 = = eff 2 3 4 5 exp exp : : T T 1 1 . . 85 85 T T T eff eff £ £ theor : 1 , 7 2 Da (%) T Amplification des fluctuations Activité Pa estimé ~ 4×10-20 J

13. Vers l'analyse de contours Des Expériences de Micropipettes... • Mesure de la température effective seulement • Pertubent le système ...A une mesure du spectre de fluctuations

14. r i 1.5×1016 m-2 7.5×1016 1.5×1015 7.5×1014 1.5×1014 s h Pai 10-9 N/m 10-8 10-7 4×10-20 J.m 10-6 3×10-20 2×10-20 10-5 1×10-20 0.5×10-20 Simulations : effet de la concentration Simulations : effet de la tension Simulations : effet du dipôle

15. Objectifs • Mesure d’un spectre de fluctuations jusqu’à grands vecteurs d’onde • Qui s’applique loin de la forme sphérique • Résultats interprétables avec une théorie en membrane plane

16. Deux techniques de reconnaisance et d'analyse de contours existantes

17. Permet d’accéder à un spectre de fluctuation • Analyse assez fine • Ne s’applique qu’aux objets sphériques • Nécessite une théorie en harmoniques sphériques Reconnaissance d'objet sphérique Mitov, M. D. et al. (1992). Advances in Supramolecular Chemistry. Gokel. Greenwich (Connecticut), Jai Press. 2: 93-139.

18. Permet la reconnaissance de formes non sphériques, et leur analyse • Limitée aux petits vecteurs d’onde, pas réellement de mesure du spectre Wilson, T. et al. (1981). Optik59(1): 19-23. Analyse de Contours : ce qui existait Reconnaissance de formes Döbereiner, H.-G. et al. (1997). Physical Review E55: 4458-4474.

19. Notre méthode de reconnaissance de contours

20. Reconnaissance de Contours : notre méthode Dispositif expérimental Pécréaux, J. et al. (2004). European Physical Journal E (accepted).

21. Détection de Contours : stratégie générale

22. Détails de l'analyse de contours

23. Analyse d'une série de contours

24. Spectres obtenus

25. Notre méthode d'analyse de contours

26. Utilisation de theorie sur des membranes planes Passage des séries de Fourier aux transformées de Fourier

27. Coupe par le plan diamétral Pour une membrane plane à 3D Helfrich, W. and R.-M. Servuss (1984). Il Nuovo Cimento3D(1): 137-151. Pour la coupe d’une Membrane plane

28. avec On ne peut pas négliger l’effet du temps d’intégration Effet du temps d'intégration

29. Négligeable pour Henriksen, J. R. et al. (2002). European Physical Journal E9: 365-374. Effet de la gravité

30. Détection à résolution finie ; correction

31. La reconnaissance et l'analyse de contours permettent • La mesure d’un spectre de fluctuation jusqu’à de grands modes (n=35) par rapport aux techniques précédentes (n=10-15) • L’utilisation d’une description théorique en membrane plane (et donc en transformée de Fourier) • La prise en compte de l’intégration en temps • Une mesure non intrusive du spectre de fluctuations

32. membranes passives

33. Buts Valider notre méthode de mesure du spectre de fluctuations en retrouvant des valeurs raisonnables des paramètres physiques des vésicules • Développement de l’analyse spécifique • Réalisation d’expériences sur EPC, SOPC, et SOPC:CHOL

34. -19 10 -20 10 -21 10 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 6 x10 Résultats SOPC

36. Conclusion Notre méthode permet une réelle mesure du spectre de fluctuations et permet pour la première fois un “fit” du spectre • Bon accord entre nos résultats et les valeurs des modules de rigidité de courbure trouvés par d’autres auteurs • Valeurs de la tension raisonnables

37. membranes actives

38. Buts Mesurer l’effet de l’activité hors équilibre de pompe Sur les fluctuations de la vésicule ? • Théorie : amplification des fluctuations et un nouveau spectre de fluctuations • Manneville, J.-B. et al. (2001). PRE64(2): 021908. • Prost, J. et al. (1996). EPL33(4): 321-326. • Experience : Préparer un système contrôlé de vésicules actives et effectuer la mesure du spectre de fluctuations

39. + Solution de lipides et de BR en éther 200 nm H+ Girard, P., J. Pécréaux, et al. (2004). Biophys. J. (submitted).

40. SOPC Fit membrane lipidique SOPC/BR=1150 Fit membrane passive SOPC/BR=230 Fit membrane passive Résultats : présence de la protéine

41. Résultats : un effet du gradient ?

42. SOPC/BR=230 SOPC/BR=230 SOPC/BR=230 SOPC/BR=230 FCCP Résultats : activité de la protéine ?

43. Conclusions sur les membranes actives Expérimentalement • On detecte l’effet de la présence de la protéine passive. • On est capable de détecter l’activité de la protéine à partir d’une modification du spectre • Le modèle théorique est insuffisant pour rendre compte des observations • Différences avec les observations de J-B Manneville Mais Perspectives • Mener des expériences complémentaires • Développements théoriques en vue de comprendre les mesures sur les membranes actives • Mesure avec d’autres pompes

44. Membranes hors-équilibre par apport de lipides Collaboration avec J. Solon Mise en évidence d’une tension négative

45. Conclusions et perspectives • Mesure du spectre de fluctuation à la fois précise et rapide, validée par des mesures sur des membranes passives • Mesure de spectres de membranes hors-équilibre moyennés sur des temps longs • Mesure de phénomènes à dynamique rapide • Reconstitution de la BR en liposomes géants par une méthode générale • Gamme de tensions accessibles (10-8-10-6 N/m) • Limite en vecteur d’onde q<4×106 m-1 • Mesures en diffusion de lumière pour accéder à des vecteurs d’onde plus grands

46. Merci à La Protéine, reconstitution en petits liposomes et test, marquage FITC J.-L. Rigaud D. Levy P. Girard Travaux théoriques sous-tendant cette étude J. Prost J.-F. Joanny D. Lacoste (PCT, ESPCI) Bases sur la reconnaissance et l’analyse de Contours H.-G. Döbereiner (Golm, Germany) Expériences de Micropipettes J.-B. Manneville

47. Mesure de spectre de fluctuations de vésicules géantes par analyse de contours ; application aux membranes passives et actives Jacques Pécréaux

48. Membranes hors-équilibre par apport de lipides Collaboration avec J. Solon