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布鲁氏菌病原学、血清学诊断. 丽水市疾病预防控制中心 兰进权. 主要内容：. 1、布鲁氏菌病原学； 2、布鲁氏菌诊断标准； 3、布鲁氏菌血清学实验的几种方法。. （一） 布氏菌概述. 1887年英国医生布鲁氏首先从死于 “ 马尔他热 ” 的英国士兵脾脏中分离出羊种布氏菌后，布鲁氏菌属（ Brucella)， 包括6个种19个生物型。 羊种布氏菌（ Br melitensis) 牛种布氏菌（ Br abortus) 猪种布氏菌（ Br suis) 沙漠森林野鼠种布氏菌（ Br neotomae) 绵羊附睾种布氏菌（ Br ovis)
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布鲁氏菌病原学、血清学诊断 丽水市疾病预防控制中心 兰进权
主要内容： 1、布鲁氏菌病原学； 2、布鲁氏菌诊断标准； 3、布鲁氏菌血清学实验的几种方法。
（一）布氏菌概述 1887年英国医生布鲁氏首先从死于“马尔他热”的英国士兵脾脏中分离出羊种布氏菌后，布鲁氏菌属（Brucella)，包括6个种19个生物型。 羊种布氏菌（Br melitensis) 牛种布氏菌（Br abortus) 猪种布氏菌（Br suis) 沙漠森林野鼠种布氏菌（Br neotomae) 绵羊附睾种布氏菌（Br ovis) 犬种布氏菌（Br canis)
年份 菌名 发现人 国家 宿主 1887 羊种菌 Bruce 马尔他 羊 1897 牛种菌 Bang 丹麦 牛 1914 猪种菌 Traun 美国 猪 1953 绵羊附睾种菌 Buadle 新西兰 公绵羊 1956 沙漠森林鼠种菌 Stoennen 美国 沙漠森林野鼠 1966 犬种菌 Carmichael 美国 小猎犬 布鲁氏菌的发展史
（一）病原学概述 布鲁氏菌属（Brucella) 包括6个种19个生物型。 牛种布氏菌（Br abortus) ： 1、2、3、4、5、6、7、9型 羊种布氏菌（Br melitensis) ：1、2、3型 猪种布氏菌（Br suis) ： 1、2、3、4、5型 沙漠森林野鼠种布氏菌（Br neotomae) 绵羊附睾种布氏菌（Br ovis) 犬种布氏菌 （Br canis)
1、形 态 • 布鲁氏菌是一组微小的球状、球杆状、短杆状细菌； • 宽约0.3—0.5微米、长0.6—1.5微米。电镜下见到的羊种菌为明显的球杆状、牛种菌和猪种菌为短杆状； • 6种布鲁氏菌靠形态很难区分，一般来说，羊种菌最小，牛种菌产次之，猪种菌较大； • 布鲁氏菌没有鞭毛，不形成芽胞和夹膜。
2、染 色 • 涂片染色检查多为单个排列，少见成对短链排列。 • 布鲁氏菌可被碱性染料着色； • 革兰染色阴性； • 柯兹罗夫斯基提出用0.5%沙黄水溶液染色，加热出现气泡，水洗后用0.5%孔雀绿或1%美兰复染，布鲁氏菌呈红色，其它细菌呈绿色和兰色。
布鲁氏菌： 革兰阴性， 长约0.6-1.5μm, 宽约0.3-0.6μm, 用柯氏染色染成红色,无鞭毛、不形成芽胞和荚膜。
3、培养特性 1.布鲁氏菌培养营养要求高： 需要各种氨基酸和各种金属离子，有的菌种需要血清才能生长。 2.生长缓慢：一般需经4—6天，有的甚至21—30天才能长出菌落。 3.生长所需温度：20—40℃，最适为37℃,超过42℃则不生长。 4. C02: 绵羊附睾种菌和牛种菌的某些生物型菌需严格的C02(5～10％)。
（4） 细菌变异 • 布氏菌在各种理化因素作用下易发生变异; • 即从光滑型（S）变为非光滑型——粗糙(R)或粘液(M)状。 • 变异菌落常比光滑型稍长，表面有颗粒。菌落颜色为灰白色或褐色，
（5） 抵抗力 • 布氏菌在合适条件下能生存很长时间，有较高的抗灭活能力。 • 对湿热、紫外线和各种射线以及常用的消毒剂、抗生素、化学药物比较敏感； • 对低温和干燥有较强的抵抗力，故可用冷冻真空干燥法保存菌种。
自然条件 生存时间（天） 自然条件 生存时间（天） 水 50—120 奶油 25—65 尘 4—120 奶酪 21—90 粪 21—72 冻肉 14—47 畜舍墙棚 4—150 腌肉 20—45 地面 4—150 培养基 60—318 衣服 30—80 干燥胎膜 120 皮毛 45—120 腐败脏器 死亡 鲜牛乳 2—550 人工胃液 20—50 布氏菌在自然条件下的生存能力
(1)对物理因子的抵抗力 物理因子对布氏菌的影响 物理因子 生存时间 物理因子 生存时间 湿热56℃ 60分钟以上 干热80℃ 60分钟以上 湿热63℃ 60分钟以上 干热90℃ 60分钟以上 湿热80℃ 30分钟以上 干热100℃ 7分钟以上 湿热90℃ 10分钟以上 直射阳光 1～4小时 湿热100℃ 半分钟死亡 散射阳光 7～8天
(2)对化学因子的抵抗力 化学因子对布氏菌的影响 药物名称 浓度(%) 生存时间 药物名称 浓度(%) 生存时间 新洁尔灭 0.1 30秒钟 漂白粉 0.2～2.5 2分钟以内 石炭酸 1～2 1～5分钟 红 汞 2 7分钟 来苏儿 2 1～3分钟 过锰酸钾 0.1～0.2 7～15分钟 来苏儿 3 1分钟以内 甲 醛 0.2 20分钟以上 氯亚明 0.2 5～7分钟 乳 酸 0.5 1分钟以内 氯亚明 0.5 3～5分钟 氢氧化钾 2 3分钟 升 汞 0.05 1分钟以内 肥皂 2 20分钟以上
主要化学药品对三型菌的影响 ────────────────── 浓度 布鲁氏菌生存时间(分钟) 化学药品名称 ────────────── (%) 羊型 牛型 猪型 ────────────────── 石 碳 酸 1 ≤5 ≤3 ≤5 石 碳 酸 2 1 2 1 来 苏 儿 2 ≤3 ≤1 ≤3 来 苏 儿 3 瞬间 瞬间 瞬间 漂白粉澄清液 0.2 1-2 瞬间 瞬间 漂白粉乳剂 2.5 1-2 瞬间 瞬间 肥 皂 水 2 ≥20 ≥20 ≥20 ─────────────────────────────
（二）布鲁氏菌分离培养 • 采用何种方法、 • 取何种材料、 • 何种培养基 • 实验室条件
布氏菌的分离培养 • 一、从可疑病人分离布氏菌 • 血培养： 30天未培养出菌，可定位阴性 。 • 骨髓培养：抽取骨髓（接种双相培养基） • 尿培养： • 其他病原材料培养:乳、脑脊液、关节液和滑囊液分离布氏菌，参照血培养观察结果，15天不长菌定为阴性
二、从牲畜材料中分离布氏菌 • 从牲畜流产羔检菌： • 从胎衣检菌： • 从阴道分泌物检菌： • 尿液检菌： • 乳汁检菌： • 脓汁检菌： • 血液培养： • 脏器检菌：
我国出菌宿主及材料 • 我国从人、羊、牛、猪、犬、鹿、马、骆驼等家畜及黄羊、岩羊、黄鼠、黄胸鼠等野生动物检出布氏菌。从牧区水塘水和羊毛中也检出过布氏菌。 • 出菌材料有血液、关节液、滑囊液、骨髓、脑髓液、胸液、淋巴结、乳汁、脓汁、胆汁、尿、阴道分泌物、等20余种。 • 由于取材难易等原因，人多由血液、关节液、滑囊液、骨髓出菌；羊多由流产羔、胎盘、死羔检出菌；牛多由流产犊、乳汁检出菌；猪多由流产仔猪、胎盘出菌。
布氏菌的鉴定及分型 (一)常规确定布氏菌属细菌的方法 • 菌落生长时间和形态; • 菌体形态和染色; • 布氏菌血清凝集试验; (二)特殊方法： • 1．细菌DNA鸟嘌呤十胞嘧啶克分子百分比(C+CMOL％)的测定; • 2．布氏菌DNA与可疑菌DNA杂交试验; • 3．应用色谱技术鉴定布氏菌;
布氏菌属的种、型鉴定方法 • 初代分离培养对二氧化碳的需要 • 硫化氢产生试验 • 染料抑菌试验 • 单项特异性血清A、M、R凝集试验 • 粗糙型（R型）血清凝集试验（玻片、试管法） • 噬菌体裂解试验 • 尿素酶活性试验
布鲁氏菌分离用培养基 • 血清葡萄糖琼脂培养基 • 胰酶大豆培养基 • 土豆琼脂培养基 • 胰示琼脂 • Albimi琼脂培养基 • 肝琼脂培养基 • 土豆+10%马血清培养基 效果最好
人间布病诊断方法和判定标准 1、流行病学接触史： 密切接触家畜、野生动物、畜产品、 布鲁氏菌培养物等或生活在疫区内的居民。 2、临床症状和体征:应排除其他疑似疾病。 3、实验检查：病原分离 试管凝集试验 补体结合试验 抗人球蛋白试验 参考：（皮内变态反应试验、虎红平板凝集试验）
人间布病血清学阳性判定标准 病原分离:检出布鲁氏菌； 试管凝集试验:1:100(++)及以上为阳性； 补体结合试验:1:10 (++)及以上为阳性； 抗人球蛋白试:1:400(++)及以上为阳性；
人间布病诊断方法和判定标准 • 凡具备1、2和第3项中的任何一项检查阳性即可确定为布病病人。 • 对已确诊的慢性布病病人和接种过菌苗的人，应以临床症状为主要依据，血清学试验效价高低，皮变反应仅供参考。
(1）布氏菌素皮内变态反应试验 原理：当机体受布氏菌抗原作用之后，导致T细胞过敏。致敏T细胞再遇到相同抗原后进行分化，衍变，产生能释放各种淋巴因子的效应细胞，局部的皮肤变态反应就是各种淋巴因子综合作用的结果，是一种迟发型变态反应。 注意： 布氏菌素注射后，不会使人感染布病；也不会导致常规检测的抗体增加。 器材及试剂： 布氏菌素、酒精棉球，1ml注射器，测量尺
皮内变态反应操作方法 1.每次注射前必须详细询问职业、健康情况曾否接种过布氏菌活菌苗等。 2.前臂掌侧中部皮肤用75%酒精棉球消毒，待干后，用1ml注射器皮内注射0.1ml。 3.判定反应时间：注射后24、48h各观察一次（以48H结果为准）。 4.判定反应标准：阳性反应局部红肿达2x2cm或面积4cm2
皮内变态反应注意事项 • 部位：要皮内注射，切勿皮下注射 • 剂量：为0.1ml，注射后应在注射部位有小白泡隆起，注射液不得从针口漏出。 • 消毒：用酒精，切勿用碘酒，以免引起假阳性反应。 • 面积计算：浸润、伪足都属于测量范围 • 制品浑浊，有摇不散的沉淀，有异物，安瓶有裂纹，标签不清，过期失效者不可使用。 • 保存：布氏菌素于4-10℃冷暗处.
皮内变态反应禁忌 • 既往有各种过敏史者， • 支气管哮喘病者 • 不可使用
评价： • 此法敏感性较好，呈阳性反应的人只表示受过布氏菌感染，不能做最后判定。 • 此法用于流行病学调查和大量检疫，所以布病监测时为初诊方法，若皮变阳性，应采血进一步做特异性抗体检测。
（2）试管凝集试验 Nacl电介质 原理：Ag+Ab Ag-Ab 布氏菌侵入机体后，就会刺激机体产生特异性抗体，这种抗体可与相应抗原（布氏菌体）发生特异性结合，在电介质作用下，就会形成肉眼可见的凝集反应，我们就是用已知抗原查未知抗体。
弃去 0.5 稀释血清 试管凝集反应（SAT）示意图(1) 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 稀释度 1:25 1:50 1:100 1:200 1:400
每次试验须作三种对照 • 阴性血清对照 • 阳性血清对照 • 抗原对照
结果判定： 根据各管中上层液体的清亮度记录凝集反应程度（滴度），特别是50%清亮度（++）对判定结果关系较大，一定要与比浊管对比判定。 ++++ 等于完全凝集，上层液100%清亮。 +++ 等于几乎完全凝集，上层液75%清亮。 ++ 等于显著凝集，上层液50%清亮。 + 等于有凝集出现，液体25%清亮。 - 等于无凝集，液体不清亮。 人的诊断标准：1:100++为阳性，1:50++为可疑。
评价：试管凝集试验是Wright和Sample于1898年首先建立的，是布病诊断在国际上唯一的全标化方法，使用广泛，经久不衰。特异性好，也较敏感，实用性强，诊断、流调、监测均适用。评价：试管凝集试验是Wright和Sample于1898年首先建立的，是布病诊断在国际上唯一的全标化方法，使用广泛，经久不衰。特异性好，也较敏感，实用性强，诊断、流调、监测均适用。 缺点： — 有前带现象。 — 不能区别人工免疫和自然感染。 — 产生一定的交叉反应。 — 慢，需要两天。
（3）、虎红平板凝集试验 (一)器材及试剂 清洁脱脂玻片或有凹型孔的玻片，0.1毫升吸管或微量加样器、牙签或细铁丝。虎红平板凝集抗原、被检血清。 (二)操作方法 在玻片上加0.03毫升被检血清，然后加入虎红平板抗原0.03毫升，摇匀或用牙签混匀，在5分钟内判定结果。判定级别同平板凝集反应。亦可只分为(+)阳性，(-)阴性两类。
评价 • 简便、快速易行，具有较好的特异性， • 有一定的敏感性，检查牛的阳性率稍 高于绵山羊。 • 该法可用于大面积检疫。
（4）、补体结合试验(CFT) 原理 受检系统 指示系统 溶血反应 补体结合试验 1.仅有抗体 红细胞 阳性 阴性 溶血素 补体 抗体 2.仅有抗原 抗原 红细胞 阳性 阴性 溶血素 补体 3.抗原抗体反应 抗原 红细胞 阴性 阳性 补体 溶血素 抗体
补体结合试验（CFT）补体滴定须做对照 结果 抗原对照（加抗原不加补体）— 补体对照（加补体不加抗原）— 溶血素对照（加溶血素和绵羊红细胞） —
优点： 补体结合试验是一种传统的免疫学技术，特异性强。它所查的免疫蛋白主要是IgG类，此法不仅与布病临床表现、病期有较好一致性，常用于鉴别诊断。 缺点：参与反应的成分多， 影响因素复杂，操作 烦琐，不适与普查。
斑点金标免疫渗滤法（DIGFA） • 一种具有简便、快速、微量、敏感、特异、试剂稳定等优点的检测血清中抗布鲁氏菌特异性抗体的方法
方法 • 在小盒中央孔膜上加入A液1滴（50 μｌ），待渗入。 • 加入受检血清25μl，待渗入。 • 加试剂A1滴（50 μl ），待渗入。 • 加试剂B1滴（50 μl ），待渗入。 • 加试剂A2滴（100 μl ），待渗入。 • 如在膜上显现红色斑点，结果为阳性，否则为阴性。 注：试剂A：PBS稀释液 试剂B：金标记抗体结合物
DIGFA诊断布鲁氏菌病结果 上排：阳性结果； 下排：阴性结果
