微生物学实验王振河

微生物学实验 王振河

微生物实验的意义、研究进展和实验内容 一、研究内容研究微生物的形态、结构、生理生化遗传变异、微生物与其他生物、与自然界之间的关系 1. 机理研究：微生物适应环境的机制鞭毛运动的机理等是生化和分子生物学研究的重要内容

2. 微生物与实际应用 微生物与发酵工程微生物与环境工程微生物与农业微生物与医学领域微生物与食品工业

二、微生物学研究进展 微生物基因组学研究（Microbial Genomics）不可培养微生物（Uncultured Microorganisms ） DNA芯片（DNA Chip）三域学说（Bacteria, Archae, Eucaryote）

三、微生物学与Nobel奖 到目前为止，几十项Nobel生理学和医学奖，化学奖都与微生物学有关参考：沈萍教授《微生物学》绪论部分 Nobel获奖者全书

四、如何进行微生物学实验 严肃认真科学态度分析问题搞清原理

五、微生物实验安排与考核 基础实验：80%，12次，一次考试自主设计实验：20% 设计实验方案实验操作总结汇报

微生物实验课注意事项 课程简介：必修课，24学时、1个学分考试成绩按以下公式计算：平时（10％）＋操作考试（20％）＋笔试（70％）

课堂纪律 • 严格遵守实验室规章制度 • 严肃课堂纪律不允许无故旷课、早退（1次）迟到（3次）工作服

实验室安全和卫生 • 安全实验室严禁吸烟。注意用水、防电和防火正确使用化学试剂和仪器 • 卫生每次实验需留下6位同学值日，协助保持实验室清洁

实验一细菌的单染色及油镜的使用 • 实验目的 • 实验原理 • 实验材料 • 实验步骤 • 实验结果 • 问题与讨论

一、实验目的 • 学习并掌握普通光学显微镜的构造和油镜的使用技术及维护的基本知识 • 学习微生物涂片、单染色的基本技术 • 初步认识细菌的形态特征， • 学习简单的无菌操作技术

显微镜的构造1.光学部分:目镜、物镜、 照明装置(聚光镜、虹彩光圈、反光镜等)。它使检视物放大,生成物象。二、实验原理1 2.机械部分:镜座、镜臂、镜筒、物镜转换器、载物台、载物台转移器、粗调节器、细调节器等部件.它起着支持调节固定等作用.

倒立的虚像 图1-1-2 光学显微镜的成像原理

显微镜的放大倍数和分辨率 1.放大倍数：物镜放大倍数×目镜放大倍数 2.显微镜的分辨率:是表示显微镜辨析两点之间距离的能力。可用公式表示为： D=λ/2n·sin(α/2 ) 式中D：物镜分辨出物体两点间的最短距离。 ：可见光的波长（平均0.55m) n:物镜和被检标本间介质的折射率。 ：镜口角（即入射角）。 D值越小，分辨率越高，看到的物象越清晰

油镜使用的原理油镜，即油浸接物镜。当光线由反光镜通过玻片与镜头之间的空气时，由于空气与玻片的密度不同，使光线受到曲折，发生散射，降低了视野的照明度。若中间的介质是一层油（其折射率与玻片的相近），则几乎不发生折射，增加了视野的进光量，从而使物象更加清晰。油镜使用的原理油镜，即油浸接物镜。当光线由反光镜通过玻片与镜头之间的空气时，由于空气与玻片的密度不同，使光线受到曲折，发生散射，降低了视野的照明度。若中间的介质是一层油（其折射率与玻片的相近），则几乎不发生折射，增加了视野的进光量，从而使物象更加清晰。 • 根据公式D=λ/2n·sin(α/2 )，增大分母，使得D值减小，分辨率增大。

显微镜保养和使用中的注意事项 1.不准擅自拆卸显微镜的任何部件,以免损坏。 2.镜面只能用擦镜纸擦，不能用手指或粗布，以保证光洁度 3.观察标本时，必须依次用低、中、高倍镜，最后用油镜。当目视接目镜时，特别在使用油镜时，切不可使用粗调节器，以免压碎玻片或损伤镜面。 4.拿显微镜时，一定要右手拿镜臂，左手托镜座，不可单手拿，更不可倾斜拿。 5.显微镜应存放在阴凉干燥处，以免镜片滋生霉菌而腐蚀镜片。

油镜的使用 • 待后边演示

二、实验原理2 • 细菌的单染色细菌细胞微小，透明，不易观察，需染上颜色。利用单一染料对细菌进行染色，使经染色后的菌体与背景形成明显的色差，从而能更清楚地观察到其形态和结构。染色前必须固定细菌，其目的是：一是杀死细菌并使菌体粘附于玻片上。二是增加其对染料的亲和力。常用的有加热和化学固定两种方法。固定时尽量维持细胞原有的形态。

三、实验材料 • 奥林巴斯双筒普通光学显微镜 • 沙黄染色液。 • 培养24h的大肠杆菌（E.coli) • 载玻片、接种环、酒精灯、香柏油、二甲苯、擦镜纸、吸水纸等。

涂片干燥固定染色水洗干燥镜检 无菌操作四、实验步骤一、制作大肠杆菌观察片现场演示

三、口腔微生物的观察 1.在洁净无油腻的载片中央滴一小滴无菌水，用牙签取牙垢少许与水滴充分混匀，涂成薄膜。 2.将涂片于室温中自然干燥后，按单染色法的步骤，进行固定、染色、水洗，干燥后镜检。现场演示 1.低倍镜观察：粗调、细调。依次再进行中倍、高倍观察 2.油镜观察：高倍镜下找到清晰的物象后，提升聚光镜，在标本中央滴一滴香柏油，使油镜镜头浸入香柏油中，细调至看清物象为止。 3.换片：另换新片，必须从第三条开始操作。 4.用后复原：观察完毕，上悬镜筒，先用擦镜纸擦去镜头上的油，然后再用擦镜纸沾取少量二甲苯擦去残留的油，最后用擦镜纸擦去残留的二甲苯，后将镜体全部复原。注意：油镜使用完毕后一定要用二甲苯擦拭镜头二、显微操作

五、实验结果 • 用油镜观察大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和口腔微生物的染色标本，并绘图。

六、问题与讨论 1.涂片为何要固定？固定加热时间过长会怎样？ 2.使用油镜时，为什么必须用香柏油？ 3.镜检标本时，为什么先用低倍镜观察，而不是直接用高倍镜或油镜观察？

内容回顾 一、原理显微成像原理油镜使用原理单染色原理二、技术和方法无菌操作技术制片和单染色方法显微镜使用方法

本次实验课结束请确保油镜头擦拭干净！请第一排同学留下值日下周再见！本次实验课结束请确保油镜头擦拭干净！请第一排同学留下值日下周再见！

实验二细菌染色法及微生物的观察 用于生物染色的染料主要有碱性染料、酸性染料和中性染料三大类。碱性染料的离子带正电荷，能和带负电荷的物质结合。因细菌蛋电质等电点较低，当它生长于中性、碱性或弱酸性的溶液中时常带负电荷，所以通常采用碱性染料(如美蓝、结晶紫、碱性复红或孔雀绿等)使其着色。酸性染料的离子带负电荷，能与带正电荷的物质结合。当细菌分解糖类产酸使培养基pH值下降时，细菌所带正电荷增加，因此易被伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料着色。中性染料是前两者的结合物又称复合染料．如伊红美蓝、伊红天青等。

简单染色法是只用一种染料使细菌着色以显示其形态的方法难于辨别细菌细胞的构造。简单染色法是只用一种染料使细菌着色以显示其形态的方法难于辨别细菌细胞的构造。

革兰氏染色法法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌(G－)和革兰氏阴性菌(G＋)两大类，是细菌学上是常用的鉴别染色法。该染色法所以能将细菌分为G－菌和G＋菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。G－菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经番红复染后就成红色。G＋菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色。革兰氏染色法法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌(G－)和革兰氏阴性菌(G＋)两大类，是细菌学上是常用的鉴别染色法。该染色法所以能将细菌分为G－菌和G＋菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。G－菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经番红复染后就成红色。G＋菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色。

细菌荚膜染色的原理是因为荚膜和染料间的亲和力弱，不易着色，通常采用负染色法染荚膜，即设法使菌体和背景着色而荚膜不着色，从而使荚膜在菌体周围呈一透明圈。由于荚细菌荚膜染色的原理是因为荚膜和染料间的亲和力弱，不易着色，通常采用负染色法染荚膜，即设法使菌体和背景着色而荚膜不着色，从而使荚膜在菌体周围呈一透明圈。由于荚膜的含水量在90％以上，固染色时一般不加热固定，以免荚膜皱缩变形。细菌的芽胞具有厚而致密的壁，透性低，不易着色，若用一般染色法只能使菌体着色而芽胞不着色(芽胞呈无色透明状)。芽胞染色法就是根据芽胞既难以染色而一旦染上色后又难以脱色这一特点而设计的。所有的芽胞染色法都基于同一个原则：除了用着色力强的染料外，还需要加热，以促进芽胞着色。当染芽胞时，菌体也会着色，然后水洗，芽胞染上的颜色难以渗出，而菌体会脱色。然后用对比度强的染料对菌体复染，使菌体和芽胞呈现出不同的颜色，因而能更明显地衬托出芽胞，便于观察。

细菌的鞭毛极细，直径一般为10～20nm，只有用电子显微镜才能观察到。但是，如采用特殊的染色法，则在普通光学显微镜下也能看到它。鞭毛染色的方法很多．但其基本原理相同，即在染色前充用媒染剂处理，让它沉积在鞭毛上．使鞭毛直径加粗。然后再进行染色。细菌的鞭毛极细，直径一般为10～20nm，只有用电子显微镜才能观察到。但是，如采用特殊的染色法，则在普通光学显微镜下也能看到它。鞭毛染色的方法很多．但其基本原理相同，即在染色前充用媒染剂处理，让它沉积在鞭毛上．使鞭毛直径加粗。然后再进行染色。

一、实验目的和内容 目的：巩固无菌操作技求，掌握细菌及其结构的染色技术。内容： 1、学习细菌单染色操作技术。 2、学习革兰氏染色技术。 3、学习细菌的荚膜、芽孢及鞭毛染色方法。

二、实验材料和用具 1、单染色法：（1）大肠杆菌(E.coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的斜面菌种。（2）吕氏美蓝染色液、石炭酸复红染色液、黑色素液或碳素墨水、香柏油、二甲苯、无菌水（3）显微镜、擦镜纸、接种环、酒精灯、载玻片、吸水纸、无菌牙签。

2、革兰氏染色： （1）黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大肠杆菌（E.coli）菌液，待测菌菌液l～2种；（2）革兰氏染色液(结晶紫染液、卢戈氏碘液、95％乙醇、石炭酸复红液等)、（3）香柏油、二甲苯；显微镜、擦镜纸、接种环、载玻片、吸水纸、试管、小滴管、酒精灯。

3、荚膜染色： (l)在阿须贝(Ashby)无氮培养基上培养3—5天的团褐固氮菌(Azotobacter chroococcum)或者培养2—3天的硅酸盐细菌(Bacillus mucilaginosus subsp silicus) (2)李夫森氏染色液、硼酸钠美兰染色液、石炭酸复红染色液、黑色液。 (3)载玻片、接种环、洗瓶。 (4)显微镜。

4、鞭毛染色： (1) 在牛内膏蛋白胨斜面上培养19—24小时的假单孢菌(Pseudomonas.sp)，此培养体在取用前经过每日移植—代，连续移植5～7代。 (2)新配制的费氏及康氏鞭毛染色液A和B。 (3)无菌水、无菌空试管、凹玻片。盖玻片、洁净载玻片、接种环、洗瓶。 (4)显微镜．

5、芽孢染色： (1)在牛肉膏蛋白胨斜面上培养24～36小时的枯草杆菌或者苏云金杆菌。 (2)载玻片、接种环、酒精灯、洗瓶、镊子。 (3)显微镜。 (4)香柏油、二甲苯、擦镜纸． (5)孔雀绿染色液、蕃红染色液。

三、操作步骤 1、单染色法（1）涂片在洁净无脂的载玻片中央滴一小滴无菌水（图4－10a），用无菌操作方法从菌种斜面挑取少量菌体与水滴充分混匀，涂成薄膜，涂布面积约1～1.5cm2（图4－10b）。（2）干燥将涂片于室温中自然干燥。（3）固定手执载片—端，使涂菌的一面向上，将载片通过微火2～3次。在火上固定时，用手摸涂片反面，以不烫手为宜。不能将载片在火上烤，否则细菌形态毁坏(图4—10c)。

（4）染色将涂片置于水平位置，滴加染色液覆盖于涂菌处，染色约2min(图4—10d)。（4）染色将涂片置于水平位置，滴加染色液覆盖于涂菌处，染色约2min(图4—10d)。（5）水洗倾去染色液，斜置载片，用自来水的细水流由载片上端流下，不得直接冲在涂菌处，直洗至从载片上流下的水中无染色液的颜色为止(图4—10e)。（6）干燥自然晾干或用吸水纸轻轻地吸干，注意不要擦掉菌体(图4—10f)。（7）待标本完全干燥后，先用低倍镜和高倍镜观察，将典型部位移至视野中央，再用油镜观察。

图4－10 单染色方法

（二）革兰氏染色法 1、制片（1 ）涂菌用无菌操作方法从试管中沾取菌液一环，用接种环在洁净无脂的载玻片上做一薄而均匀、直径约1cm的菌膜。涂菌后将接种环火焰灭菌。（2）干燥于空气中自然干燥。亦可把玻片置于火焰上部略加温加速干燥(温度不宜过高)。（3）固定目的是杀死细菌并使细菌粘附在玻片上，便于染料着色，常用加热法，即将细菌涂片面向上，通过火焰3次，以热而不烫为宜，防止菌体烧焦、变形。此制片可用于染色。

2、染色 （1）初染：于制片上滴加结晶紫染液，染1min后，用水洗去剩余染料。（2）滴加卢戈氏碘液，1min后水洗：（3）滴加95％乙醇脱色，摇动玻片至紫色不再为乙醇脱退为止(根据涂片之厚薄需时30s至1min)。（4）复染滴加石炭酸复红液复染1min，水洗。（5）用滤纸吸干，油镜镜检。

3、结果 革兰氏阳性菌染成篮紫色，革兰氏阴性菌染成淡红色。 4、检测未知菌用以上方法对未知面进行革兰氏染色，并绘图、记录染色结果。

（三）荚膜染色法 1．石炭酸复红染色 (1)取培养了72h的褐球固氮菌制成涂片，自然干燥(荚膜是多糖类物质，不可用火焰烘干)。 (2)滴入1～2滴95％乙醇固定(不可加热固定)。 (3)加石炭酸复红染液染色1～2min，水洗，自然干燥。 (4)在载玻片一端加一滴墨汁，另取一块边缘光滑的载玻片与墨汁接触，在以匀速推向另一端，涂成均匀的一薄层，自然干燥。 (5)干燥后用油镜观察。菌体红色，荚膜无色，背景黑色。

2．背景染色 (1)先加1滴墨水于洁净的玻片上，并挑少量褐球固氮菌与之充分混合均匀。 (2)放一清洁盖玻片于混合液上，然后在盖玻片上放一张滤纸，向下轻压，吸收多余的菌液。 (3)干燥后用油镜观察。背景灰色，菌体较暗．在其周围呈现一明亮的透明圈即荚膜。

3．李夫森氏－硼酸钠美兰染色 （1）取在阿须贝氏无氮培养基上培养3天的硅酸盐细菌少许，制成干燥涂片(不要加热固定)。（2）加李夫森氏染色液染色l0min，倾之染液(勿用水洗)。（3）加硼酸钠美兰染色液染色5min，水洗，晾干。（4）油镜视察可见荚膜被染成红色，菌体处成蓝色。

（四）鞭毛染色法 1．方法一：（1）用接种环由培养18～20h的斜面上取假单胞菌菌体少许，用菌滴制片法检查细菌的运动性。如果菌体的运动性很强，则可作鞭毛染色。（2）用3～4mL无菌水，将培养体洗下，移入另一无菌试管中，适温培养10min，再检查运动性。

（3）用无菌吸管由悬液上部取一小滴，置于一清洁载玻片的一端，将玻片倾斜。使菌液由一端流向另外一端。于是在玻片上做成2～3条菌液带。待水膜自然干燥（切勿用火焰烘）。（3）用无菌吸管由悬液上部取一小滴，置于一清洁载玻片的一端，将玻片倾斜。使菌液由一端流向另外一端。于是在玻片上做成2～3条菌液带。待水膜自然干燥（切勿用火焰烘）。（4）用刚刚过滤的鞭毛染色液A染色5min(不要加热)。（5）倾去A液，加鞭毛染色液B染色10min。用蒸馏水轻轻冲洗，晾干。（6）用齐氏石炭酸复红染色2～3min。轻轻冲洗，晾干(不能用吸水纸吸干)。（7）先用低倍镜，再用高倍镜，最后用油镜检查。

2．方法二： （1）制涂片：先加少量无菌蒸馏水于凹载玻片的凹窝中．再从培养10h左右的斜面菌苔上取菌一环，轻放在凹窝水面上(不要搅动)，放30度温箱静置5～10min．取出，从凹窝水面上轻轻取菌液一环，轻放在干净的载玻片上(不要涂抹)，放回温箱，让其自然干燥(不要加热固定)。（2）染色：在自然干燥的涂片上，滴加含石炭酸的鞭毛染色液一滴，染色5min，用水轻轻冲洗，让其自然干燥。（3）镜检：用油镜观察。

五）芽孢染色法 1．方法一： (1)取37℃培养18～24h的枯草芽孢杆菌作涂片，并干燥，固定。 (2)于载片上滴人3～5滴5％孔雀绿水溶液。 (3)用试管夹夹住载玻片在火焰上用微火加热，自载玻片上出现蒸汽时，开始计算时间约4～5min。加热过程中切勿使染料蒸干，必要时可添加少许染料。 (4)倾去染液，待玻片冷却后，用自来水冲洗至孔雀绿不再褪色为止。 (5)用0.5％沙黄水溶液(或0.05％碱性复红)复染1min，水洗。 (6)制片干燥后用油镜观察。芽孢呈绿色，菌体红色。

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