Promoottorien etsintä

1. Promoottorien etsintä Jenni Hulkkonen 23.3.2005

2. Don King

3. Motivaatio • uusien geenien etsinnässä • transkription aloituskohdan ja promoottorin löytäminen vaikeata • geenien säätely • ihmisellä on kaikissa soluissaan kaikki geenit, mutta vain osa geeneistä ilmentyy joissakin soluissa • jotkin geenit toiminnassa oletusarvoisesti • sairauksien tutkiminen

5. Prokarioottien transkription aloitus • sigma tekijä kiinnittyy RNA polymeraasiin • kompleksi löytää transkription aloituskohdan

7. Eukarioottien transkription aloitus • monimutkaisempi kuin prokarioottien, koska eukarioottien perimä ja systeemit monimutkaisempia • geenit pakkautuneina • tarvitsee saada aloituskohta esille ennen kuin voidaan aloittaa koodaus • eukariooteilla tiukemmin säädelty • useita säätely tekijöitä

8. Transcription factorit, TF • basal factors • minimi promoottori • TATAA, RNA polymeraasi II, TFIIB,… • upstream factors • vahvistajat ja hiljentäjät • variaatiot • jotkut kirjaimet voivat olla erilaisia, esimerkiksi viereinen proteiini voi antaa tämän mahdollisuuden • sensitiivisyys ja spesifisyys • voidaan kuvailla matemaattisin mallein: • matriisipohjaiset ovat spesifisempiä kuin IUPAC • painomatriisit voivat ennustaa sitoutumisaffiniteettia • matriisiperheet sisältävät TF:ien biologisen vaihtelevuuden

9. TFBS =transcription factor binding site • lyhyt pätkä DNA:ta (5-25nukleotidiä) • sitoutunut yksi tai useita transcription factoreita • hyvin konservoituneita • säätelykohtia: • jopa 50 000nukleotidin päässä • otettava huomioon myös toinen juoste • voi olla myös geenin sisällä

10. DNA:han sitoutuvat domainit • Zinc finger • Leucine Zipper • Homeodomain • tärkeitä kehitysbiologiassa • TATA- sitoutuva proteiini

12. CpG islands • Ihmisen genomissa CpG dinukleotidit ovat harvinaisia • CpG parit käyvät läpi metylaation, joka muuttaa C nukleotidia • Metyloitu C voi mutatoitua hyvin suurella todennäköisyydellä T:ksi • Promoottori alueet ovat CpG rikkaita • Alueita ei ole metyloitu ja täten mutatoituvat harvemmin (evolutionäärisesti tärkeitä) • Näitä kutsutaan CpG islandeiksi

14. Mikrosirut • Promoottorienennustamisessakäytetään hyväksi mikrosiruja • sirujen avulla etsitään samalla tavalla ekspressoituvia geenejä • tällä hetkellä käytännössä ainoa keino etsiä uusia transcriptio factoreita

15. Ohjelmat • pelkästään sekvenssiin pohjautuvia • TATA box • CpG islands • tulevaisuudessa 3-uloitteisuus huomioon

16. Promoottori alueen etsintä • promoottori analyysi tarvitsee promoottorin sekvenssin • saaminen voi olla triviaalia! • meneekö vastavirta sekvenssi toisen promoottorin päälle? • ohjelmia: • UCSC • tarvitsee RefSeq mRNA accession koodit • tarjoaa valmiiksi tehdyn kokoelman vastavirta sekvensseistä • LocusLink • tärkeä UCSC:n käyttöön jos ei RefSeq koodeja • EnsMART

17. Promoottori alueiden analyysi • etsitään jo tiedossa olevia TFBS vastavirrasta • The TRANSFAC database ver. 6.0 • eukarioottien transkriptio tekijöiden, niiden genomiin sitoutuvien osien ja DNA sitoutumisprofiilin tietokanta • Gene Regulation • Match • potentiaalisten transkriptio tekijöiden sitoutumiskohtien etsimiseen • käyttää TRANFAC 6.0:n kirjastoa mononukleotidi painomatriiseista

18. Uusien transkriptio tekijöiden etsintä • MEME • Työkalu motifien etsintään DNA:sta • Motif on pala sekvenssiä joka toistuu sukulais DNA sekvenssien ryhmässä • Kuvaa motifeja paikkariippuvaisilla kirjaintodennäköisyys matriiseilla, jotka kertovat kuinka todennäköisiä jokainen mahdollinen kirjain on kussakin kohtaa sekvenssi pätkää • Yksittäinen MEME motif ei sisällä aukkoja • Aukkoja sisältävät MEME jaetaan kahteen tai useampaan erilliseen motifiin • Antaa ulos yhtä monta motifia kuin on pyydetty • AlignACE • Käyttää Gibbs sampling algoritmiä

19. Genomatix • Sovelluksella kuukausittaiset rajat • Matinspector • Etsii transcriptio tekijöiden sitoutumiskohtia • Käyttää matriiseja sekä IUPAC kirjastoja • Sisältää noin 400 sitoutumiskohtaa • ElDorado • Näyttää saatavilla olevan annotaation genomi alueesta • Gene2Promoter • Etsii ja analysoi promoottoreita • Promoottoreiden suoraan hakemiseen • PromoterInspector • Promoottorien hyvin specifinen ennustaminen nisäkkäille • Promoottori alueiden etsimiseen • Suunniteltu paikantamaan potentiaalisia promoottori alueita DNAn kohdista, joita ei ole vielä annotoitu • Ihmisen korkealaatuisiin promoottoreihin käytä elDoradoa tai Gene2Promoteria

20. Lähteet • www.csc.fi/molbio/opetus/promoottorianalyysi • luentokalvoja • Molecular Biology of the Cell

21. Kiitoksia! Kysymyksiä?

22. http://www.bio.com/pics/nucleosomes_chromatin.jpg

23. http://www.mdx.ac.uk/www/lifesciences/alex/images/0905_2.gif

24. http://images.google.fi/imgres?imgurl=http://fajerpc.magnet.fsu.edu/Education/2010/Lectures/24_DNA_files/image014.jpg&imgrefurl=http://fajerpc.magnet.fsu.edu/Education/2010/Lectures/24_dna.htm&h=259&w=594&sz=28&tbnid=fAnLCofwn_IJ:&tbnh=57&tbnw=131&start=103&prev=/images%3Fq%3Dnucleosomes%26start%3D100%26hl%3Dfi%26lr%3D%26sa%3DNhttp://images.google.fi/imgres?imgurl=http://fajerpc.magnet.fsu.edu/Education/2010/Lectures/24_DNA_files/image014.jpg&imgrefurl=http://fajerpc.magnet.fsu.edu/Education/2010/Lectures/24_dna.htm&h=259&w=594&sz=28&tbnid=fAnLCofwn_IJ:&tbnh=57&tbnw=131&start=103&prev=/images%3Fq%3Dnucleosomes%26start%3D100%26hl%3Dfi%26lr%3D%26sa%3DN • Prokaryotic DNA •       The main DNA in prokaryotes is a circular molecule attached to the plasma membrane. •       Some DNA is organized in smaller circles called plasmids. • 90% of the genome consists of functional genes, i.e. genes coding for proteins. •       Genes coding for a metabolic pathway are lumped together into an operon. • Eukaryotic DNA: •       Prokaryotic DNA is a relatively simple circular molecule.  In eukaryotes, DNA is associated with proteins to form a complex called chromatin. • Chromatin •       A variety of proteins form part of this complex: • Histones are small, basic, structural proteins that bind to negatively charged phosphate groups.  They show a highly conserved structure (homology) between higher and lower organisms. •       Nonhistones are regulatory proteins(leucine zippers;  zinc fingers).

25. Promoottori • Ennen geenin transkription alkamista tarvitaan useita prosesseja ennen kuin varsinainen luenta voidaan aloittaa

26. Nucleosomes •       DNA is tightly wrapped around a protein core made of basic protein (histones). •       Each repeating unit (nucleosome) consists of 200 base pairs, which shortens the length of DNA by about 10-fold. •       The space between nucleosomes is a site for binding of regulatory proteins that initiate DNA replication or transcription. •       DNA appearing as a string of beads (nucleosomes) is an active form of DNA and is called euchromatin. • Coiled nucleosomes •       In order to shorten DNA further (the shorter the strand the less likely it is to get entangled with other •       strands), nucleosomes are supercoiled like rope.  •       In this form, DNA is inactive, proteins reading DNA are sterically hindered by the dense further packing of chromatin.  The inactive state of DNA is referred to as heterochromatin. • Extended chromatin •       That’s not enough. The “rope” of coiled nucleosomes folds over in pleats, forming an extended chromatin.  The folds are held by nonhistone binding proteins. • Condensed chromatin •       The folded fiber can be folded again, generating condensed chromatin. • Chromosome •       Finally, condensed chromatin folds again to form a chromosome. •       This most condensed form of a single DNA molecule occurs only during cell division.

27. Kolme perusmekanismia