1 / 50

FORENZIČNE GENETSKE PREISKAVE

FORENZIČNE GENETSKE PREISKAVE. doc.dr. Katja Drobnič. Center za forenzične preiskave MNZ. FKKT december 2005. RAZJASNITEV POJMOV. KRIMINALISTIKA (Hans Gross - 1889)

lyn
Download Presentation

FORENZIČNE GENETSKE PREISKAVE

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. FORENZIČNE GENETSKE PREISKAVE doc.dr. Katja Drobnič Center za forenzične preiskave MNZ FKKT december 2005

  2. RAZJASNITEV POJMOV • KRIMINALISTIKA (Hans Gross - 1889) Znanost, ki uporablja spoznanja različnih družbenih, naravoslovnih in tehničnih znanosti in praktične izkušnje za odkrivanje, preiskovanje in dokazovanje kaznivih dejanj in njihovih storilcev! • KRIMINALISTIČNA TEHNIKA Zavarovanje materialnih dokazov in preiskovanje le-teh z uporabo različnih znanj, metod in tehnik v kazenskih zadevah! • FORENZIČNA ZNANOST (lat.forum) Uporaba znanosti v pravnih zadevah - tako v civilnih kot kazenskih! • KRIMINOLOGIJA Znanost, ki proučuje kriminaliteto kot družben pojav, raziskuje njene oblike in vzroke nastajanja, zakonitosti njenega gibanja!

  3. UPORABNOST GENETSKIH IDENTIFIKACIJSKIH TESTOV • KAZENSKE ZADEVE • identifikacija storilca • SPORNA OČETOVSTVA • IDENTIFIKACIJA SORODNIKOV • pogrešani • množične nesreče (letalske itd) • ANTROPOLOŠKE ŠTUDIJE • MEDICINSKE NAMENE (transplantacije)

  4. STRUKTURA CELICE • Najmanjša enota organizma • Vsebuje vse za svoj obstoj in razmnoževanje • DNK v dveh razdelkih: • jedru • mitohondrijih NUCLEUS MITOHONDRIJ

  5. JEDRNA DNK • DNK je zgoščena v kromosome • običajno X oblika • Y kromosom pri moških • Človeški genom - 23 parov kromosomov • ENEGA OD MATERE IN DRUGEGA OD OČETA • IZJEMA SPOLNE CELICE • Vsak posameznik edinstven genom • IZJEMA ENOJAJČNI DVOJČKI

  6. STRUKTURA DNK PONAVLJAJOČA SE DNK ZAPOREDJA (20 - 30 % humanega genoma) NEKODOGENI DELI DNK ZAPOREDNO PONAVLJAJOČA ZAPOREDJA (5-10%) RAZTRESENA ZAPOREDJA SINES LINES SATELITI MINISATELITI MIKROSATELITI Lokusi variabilnega števila ponovitev (Variable Number Tandem Repeat - VNTR) Male tandemske ponovitve (Short Tandem Repeat - STR)

  7. Mini in mikrosatelitna DNK • Kratka nukleotidna zaporedja • Tandemsko (zaporedno) ponavljajo • Naključno razporejeni po genomu • Biološka funkcija in nastanek nista znana • Polimorfni in hipervariabilni lokusi • Minisateliti - na vsakih 6 kb • osnovni motiv: 9 - 100 bp • dolžina alelov: 200 - več 1000 bp • Mikrosateliti - na vsakih 30 do 50 kb • osnovni motiv: 2 - 7 bp • dolžina alelov: do 400 bp

  8. očetov materin očetov materin homologna kromosoma homologna kromosoma 7 ponovitev (alel 7) 8 ponovitev (alel 8) Mini in mikrosatelitna DNK OSEBA 1 OSNOVNI MOTIV 5 ponovitev (alel 5) 3 ponovitve (alel 3) OSEBA 2 • Polimorfizem temelji na variacijah v številu ponovitev osnovnega motiva (VNTR: dolžina 9-100 bp, STR: dolžina 2-7 bp) • Aleli dedujejo neodvisno, kodominantno in po Mendlovih zakonih • Mehanizmi variabilnosti: genska konverzija in replikacijski zdrs

  9. HVI HVII 16024 16365 1 73 340 16,5 kb MITOHONDRIJSKA DNK - mtDNK • KROŽNE OBLIKE • DEDUJE PO MATERI • BRATJE IN SESTRE ENAKO mtDNK • DO VEČ 1000 kopij/celico • NI REKOMBINACIJE • ENO NEKODOGENO PODROČJE - 1100 bp • HVI IN HVII • POLIMORFIZEM ZAPOREDJA

  10. POLIMORFIZEM DNK • DOLŽINSKI POLIMORFIZEM 1 2 3 4 1 2 3 AATGAATGAATGAATG AATGAATGAATG TTACTTACTTACTTAC TTACTTACTTAC • POLIMORFIZEM ZAPOREDJA AGACTAGACATT AGATTAGGCATT TCTGATCTGTAA TCTAATCCGTAA

  11. VRSTE PREISKAV DNK • RFLP(Restriction Fragment Lenght Polymorphism, polimorfizem dolžin restrikcijskih fragmentov) • večlokusni VNTR • enolokusni VNTR • AmpFLP(AmplificationFragment Lenght Polymorphism, polimorfizem dolžin pomnoženih fragmentov) • enolokusni VNTR • lokusi STR • Določanje zaporedja • HVI in HVII mtDNK • SNP(Single Nucleotide Polymorphism, polimorfizem enega nukleotida)

  12. SOUTHEREN PRENOS O1 O2 03 Elektroforeza O1 O2 03 RESTRIKCIJSKA MESTA METODA RFLP (Polimorfizem dolžin restrikcijskih fragmentov) • Izolirano DNK razrežemo z restrikcijskimi endonukleazami (modre točke) • Tisoče restrikcijskih fragmentov - v nekaterih minisateliti (rdeče črte) • Southernova tehnika z radioaktivno označeno enolokusno sondo VNTR (črne črte)

  13. 3’ 5’ VEČLOKUSNI PREISKAVA POLIMORFIZMOV VNTR Z METODO RFLP - 1 • Večlokusni VNTR - veže na več mest v genomu - razmeroma slaba ločljivost - ne ve se, od kje fragment izvira - ni mogoče izračunati populacijskih alelnih frekvenc - daje fenotipsko informacijo - posledica velikega števila fragmentov - sporna očetovstva in manj uporabna za kriminalistične primere

  14. SONDA 33.15 SONDA 33.6 1 2 3 4 5 6 2 3 4 56 1 - nesorodna oseba, 2 - domnevna mati 3 - domnevni sin v preiskavi 4, 5, 6 - domnevni bratje in sestre Metoda DNA fingerprinting - določanje prstnih odtisov DNK • Alec Jeffreys, Univerza v Leicesteru, VB • nastali vzorec: DNA Finger Print - prstni odtis DNK • prva aplikacija - 1985 problem priseljevanja • prvi kriminalističen • primer - 1986 , zadeva Enderby

  15. PREISKAVA POLIMORFIZMOV VNTR Z METODO RFLP - 2 • Enolokusni VNTR - VNTR ponovi enkrat na haploidni genom - posameznik homo ali heterozigot - izračunati populacijske alelne frekvence - ni individualno specifična VNTR D2S44 3’ 5’ • osnovni motiv - 17 bp, • ponovi 70 - 450 krat • 30 alelov; 200 - 400 genotipov ENOLOKUSNI

  16. KRIMINALISTIČNA ZADEVA SPORNO OČETOVSTVO PRIKAZ DVEH PREISKAV

  17. PRIMER LEWINSKY - CLINTON • modra obleka Monice Lewinsky v preiskavo v FBI lab • RFLP preiskava madeža sperme (7 enolokusnih sond) • 3. avgusta 1998 odvzem krvi predsedniku Clintonu • verjetnost, da sperma izvira od predsednika je 1:7,8 x1012

  18. OMEJITVE PREISKAV Z RFLP • Dolžina preiskav: 7-10 DNI • Zahteva veliko količino kvalitetne DNK • nerazgrajeno DNK • Southernova metoda ima omejeno moč razločevanja • razdelitev alelov v velikostne razrede

  19. METODA AmpFLP(Polimorfizem dolžin pomnoženih fragmentov) • Pomnoževanje lokusov z metodo PCR • NI VEČ UPORABE RADIOAKTIVNOSTI • NIZKA KOLIČINA DNK V VZORCU • Preiskava dveh vrst polimorfizmov - • minisatelitni - enolokusni VNTR (le nekaj) • mikrosateliti - STR • Profiliranje DNK - določanje genetskih profilov • Ločevanje - • poliakrilamidni gel • kapilara (POP4) • Analiza zelo hitra 1- 2 dni

  20. VERIŽNA REAKCIJA S POLIMERAZO - PCR

  21. kromosom jedro celice dvojna vijačnica molekula DNK tarčno področje za PCR BAZNI PARI DNK v celici

  22. oligonukleotidni začetniki LESTVICA ALEL VZOREC VNTR BARVANJE S SREBROM PROFILIRANJE DNK - določanje profilov DNK • Ni več uporabe radioaktivnosti • Nizka količina DNK • Le nekateri lokusi VNTR so primerni • D1S80 • apoB • D17S5 homologna kromosoma Elektroforeza

  23. TCTA AATG PRIMERNOST LOKUSOV STR TETRANUKLEOTIDI • Velikost lokusov - 400 bp • Majhna količina vzorca • Zelo razgrajena DNK • Pomnoženi aleli diskretni • Analiza mešanih sledi • Fluorescentno označeni produkti PCR - sočasna pomnožitev več lokusov STR • Avtomatizacija preiskav

  24. STR1 STR2 STR3 PROFILIRANJE lokusov STR

  25. INŠTRUMENT ZA DOLOČEVANJE ZAPOREDJA - GELSKA ELEKTROFOREZA ABI PRISM 377

  26. INŠTRUMENT ZA DOLOČEVANJE ZAPOREDJA - KAPILARNA ELEKTROZOREZA ABI PRISM 310

  27. ZAZNAVA DNK CCD KAMERA Ar+ LASER (488 nm) Razklon barv Območje zaznave Fluorescenca ABI Prism spektrograf LOČEVANJE IN ZAZNAVA DNK Označeni produkti PCR Kapilara ali žepek na gelu

  28. GEL IN ELEKTROFEROGRAM A A B B

  29. Določevanje profila DNK • Določitev alelov v forenzičnem vzorcu temelji na primerjavi z alelno lestvico • Analiza poteka avtomatsko z računalniškim programom

  30. 6FAM (blue) VIC (green) NED (yellow) PET (red) LIZ (orange) D8S1179 D7S820 D21S11 CSF1PO TH01 D3S1358 D13S317 D16S539 D2S1338 TPOX D18S51 D19S433 VWA AMEL D5S818 FGA GS500 LIZ size standard Določevanje profila DNK AmpFlSTR® Identifiler™

  31. VELIKOST PCR (bp) D3S1358 vWA FGA Moč diskriminacije Blue 1:5000 1:410 1:3.6 x 109 1:9.6 x 1010 1:8.4 x 105 1:3.3 x 1012 TH01 CSF1PO TPOX Amel Green I TH01 D13S317 D3S1358 CSF1PO vWA TPOX FGA Amel D5S818 D7S820 Profiler D8S1179 D13S317 Amel vWA D7S820 D3S1358 D5S818 D21S11 FGA Profiler Plus D18S51 TH01 D7S820 D3S1358 TPOX CSF1PO Amel COfiler D16S539 D3S1358 vWA Amel D8S1179 D18S51 TH01 D16S539 D21S11 D19S433 D2S1338 SGM Plus FGA RAZVOJ KOMERCIALNIH KITOV

  32. KVANTI. DNK PCR-pomnoževanje številnih STR-markerjev IZOLACIJA DNK ločevanje in detekcija PCR produktov (STR-aleli) določanje profila vzorcev DNK primerjava profila vzorca z ostalimi vzorci mnenje se poda s stopnjo ujemanja ujemanje profilov, primerjava s podatki iz nacionalne zbirke podatkov POSAMEZNI KORAKI V PREISKAVI DNK Vzorci iz kazenskih zadev ali spornih očetovstev BIOLOGIJA TEHNOLOGIJA GENETIKA

  33. TPOX TH01 CSF D7 D16 D3 D5 D13 Penta D D8 D18 FGA VWA D21 AMEL Penta E Pomnoževanje s fluorescentno označenimi začetnimi oligonukleotidi; ločevanje poteka z elektroforezo. Kvantifikacija DNK PROFILIRANJE DNK BIOLOŠKE SLEDI

  34. FORENZIČENA GENETSKA PREISKAVA AmpFlSTR® SGM Plus™ kit D3 TH01 amelogenin D8 VWA D16 D19 D21 D18 D2 FGA Verjetnost naključnega ujemanja: ~1 / 3 trilijone. Rezultat v petih urah iz krvnega madeža velikosti bucikine glavice. D3 amelogenin D19 D8 D16 VWA D21 D18 D2 FGA TH01 Sočasna analiza 10 področij STR in področja za spol. velikost DNK (bazni pari) SLED OSEUMLJENEC

  35. Kraj dejanja - dva osumljenca

  36. HVI HVII 16024 16365 1 73 340 MtDNK 267 341 • Visoka variabilnost področij HVI in HVII • AFRIŠKA P.- 14 MEST • KAVKAŠKE P. - 8 MEST • 604 Američanov/ 451 haplotipov mtDNK • Deduje se po materi - stopnja identifikacije nizka • Ugotavljanje oddaljenih sorodstvenih povezav

  37. A C G T DOLOČANJE ZAPOREDJA mtDNK • Analiza na podlagi primerjave z Andersonovim referenčnim zaporedjem (Nature 1981; CRS) • Označijo se le razlike npr. 16325 C

  38. DRUŽINA ROMANOV • Nikolaj II in Aleksandra Fjodorovna • Olga • Tatjana • Marija • Anastazija • Aleksej • Aprila 1918 so jih boljševiki odpeljali v Jekaterinburg • Ubiti 17. julija 1918 skupaj z zdravnikom in tremi služabniki • Julija 1991 Jelcin dovoli izkop trupel

  39. 8,8 7,10 8,10 7,8 8,10 PREISKAVA LOKUSOV STR 3 otroci ženskega spola 2 odrasli ženski 4 odrasli moški THO 1 IZLOČENI 9,10 6,10 6, 9 6, 6

  40. DRUŽINSKO DEBLO DRUŽINE ROMANOV - PREISKAVA mtDNK Louise Hesse Cassel 16169T/C 16169T/C Albert Victoria Georgij Romanov car Nikolaj carica Aleksandra 16111T 16357C 263G 315.1C Princ Filip Edinburški vojvoda 16169T Xenia Cheremeteff - Sfiri

  41. - DYS393 - DYS19 - DYS391 - DYS389 - DYS390 AMEL PREISKAVA LOKUSOV STR KROMOSOMA Y Thomas Jefferson II T. JEFFERSON Predsednik ZDA 1801 1790 1808 6 generacij X

  42. World Trade Center ProjectExtracting Information from Kinships and Limited Profiles • 2,795 people were killed in the World Trade Center attacks on September 11, 2001. • 20,000 remains were recovered, the vast majority of which would require DNA matching for identification. • Existing software tools for DNA identification proved wholly inadequate for the scope and magnitude of this project. Jonathan Hoyle Gene Codes Corporation 2/17/03

  43. Timeline • September 17: Armed Forces DNA Identification Lab [AFDIL] asks Gene Codes to update Sequencher™ for the Pentagon and Shanksville crashes. • September 28: Office of the Chief Medical Examiner [OCME] in New York City contacts us for new software. • October 15: Using the Extreme Programming [XP] methodology, software development is underway. • December 13: M-FISys (Mass-Fatality Identification System) has its first release to the OCME. • Since: Weekly releases personally delivered to the OCME, to accommodate rapidly changing requirements.

  44. Identification Technologies • Technologies used for Identification • STR • mtDNA • SNP • Methods used: • Direct Match to a Personal Effect • Kinship Analysis

  45. STR Frequency • In 1997, the FBI standardized on 13 STR loci used in the national database, CoDIS. • Frequency data for each locus/allele value is available for various races. For example: Locus: D16S539 TPOX D3S1358 FGA D7S820 vWA D13S317 TH01 Allele: 11/13 8 15.2 21/13.2 10/11 15.2 11/12 9.3 Freq: 8.55% 39.4% 0.099% 0.796% 14.6% 0.099% 18.2% 9.21% • Since STR loci are independent, these frequencies can be multiplied: 5.6  10-13 • Likelihood = 1 / Frequency = 1.8  1012

  46. STR Profiles • M-FISys STR profile contains 16 elements: • Amelogenin (Gender) • 13 CoDIS Core Loci • 2 PowerPlex Loci: • Penta D • Penta E • Minimum Likelihood: 7.6  1015

  47. Direct STR Identification • A victim remain (called a disaster sample) can be identified by direct match if its profile is either: • complete and matches Personal Effects (2 modalities) • partial with no mismatches, with a likelihood ≥ 1010 amongst common loci • A sample was further investigated if its STR profile likelihood  1010 and with either: • a single mismatch only, supported by Kinship • mismatches due only to allelic dropout

  48. Partial Profiles • All STR profiles containing at least 11 CoDIS markers or more will have likelihoods ≥ 1010 • 70% of the victim samples yielded partial profiles (missing at least one CoDIS marker) • 25% of these partial profiles had likelihood values ≥ 1010 • Leaving half of victim samples which cannot be identified through STR means alone (using these parameters). • Identification of 1500 victims –june 2003

  49. Identifikacija Sadama Huseina

  50. Identifikacija Sadama Huseina

More Related