L’immunofenotipo leucocitario: utilità diagnostica
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L’immunofenotipo leucocitario: utilità diagnostica. Roberto Caporale. Pistoia, 29 ottobre 2011. Bernard Shoor & Leonard Herzenberg at Stanford with one of the original BD Flow Cytometers. 1974 - Becton & Dickson, using FACS technology, introduced 1st commercial Flow (FACS-1).

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L’immunofenotipo leucocitario: utilità diagnostica

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Presentation Transcript


L’immunofenotipo leucocitario: utilità diagnostica

Roberto Caporale

Pistoia, 29 ottobre 2011


Bernard Shoor & Leonard Herzenberg

at Stanford with one of the original BD Flow Cytometers

1974 - Becton & Dickson, using FACS technology, introduced 1st commercial Flow (FACS-1)


Sistema FACSCanto II

BD Biosciences


Microscopia Citometria in fluorescenza


Citometria a Flusso (CFM)

La CFM consente l’analisi automatica di sospensioni cellulari monodisperse, misurandone le caratteristiche fisiche e/o biochimiche all’interno di un flusso laminare che interseca unasorgente di eccitazione


FOCALIZZAZIONEIDRODINAMICA

LASER

sheath fluid

campione


Rifrazione & Riflessione:proporzionale alla granularità cellulare e alla complessità rilevate a 90° rispetto la luce incidente.

Generazione dei segnali di “scatter”

SSC

GRANULOCITI

MONOCITI

FSC

Diffrazione:

proporzionale alle dimensioni

della cellula rilevata lungo

l’asse della luce incidente 0°

LINFOCITI


La combinazione dei due tipi di segnali permette di ottenere un particolare diagramma di dispersione denominatoCITOGRAMMAnel quale si possono evidenziare fino a 5 o 6 differenti popolazioni cellulari, in base alle sole caratteristiche fisiche


EOSINOFILI

EOSINOFILI

NEUTROFILI

NEUTROFILI

NEUTROFILI

MONOCITI

MONOCITI

MONOCITI

MONOCITI

LINFOCITI

LINFOCITI

LINFOCITI

LINFOCITI

LINFOCITI

BASOFILI

Sottopopolazioni leucocitarie in sangue periferico

-Citogramma -

COMPLESSITA’ 

VOLUME 


Immunofenotipizzazionecellulare

- definizione -

Insieme di metodi diretti al riconoscimento, alla quantificazione ed alla localizzazione di strutture cellulari per mezzo di reagenti immunologici (anticorpi monoclonali).


1st

Pubblicazioni

123328 references

(2010)

Crescita delle applicazioni diagnostiche in citometria a flusso


Requisiti per una buona

analisi citometrica

  • Esperienza dell’operatore

  • Valutazione delle prestazioni e della stabilità della strumentazione

  • Controlli di qualità (IQC, VEQ, EQAS)


Riproducibilità dei parametri di fluorescenza

Linfoma Follicolare - diagnosi

Linfoma Follicolare - MMR


Materiali idonei per indagini in CFM

  • Liquidi:

  • Sangue periferico

  • Aspirati Midollari

  • Leucaferesi

  • Liquor

  • Liquidi cavitari

  • Solidi:

  • Linfonodi

  • Biopsie

  • Agoaspirati


Regole per una corretta analisi citometrica in onco-ematologia

  • Quesito diagnostico (dialogo con i clinici)

  • Caratteristiche del campione da analizzare

  • Scelta di adeguate combinazioni di anticorpi monoclonali

  • Regolazione dello strumento e “compensazione” delle fluorescenze

  • Strategie di “gating” per il riconoscimento delle popolazioni cellulari da analizzare

  • Integrazione con i laboratori di morfologia, citogenetica e biologia molecolare

  • Formulazione di una risposta adeguata e conclusiva


Metodo di studio in citometria

  • Valutazione delle normali componenti cellulari del sangue midollare

  • Valutazione dello stadio maturativo di tali componenti

  • Dimostrazione della presenza nel campione di cellule anormali

  • Eventuale dimostrazione della loro clonalità

  • Evidenziazione di fenotipi peculiari allo scopo di identificare una determinata entità nosografica e/o utili per lasciare una traccia in corso di follow-up (MMR)


Espressione del CD45 nei leucociti


Sangue

periferico

Sangue

midollare

Sangue Periferico vs Sangue Midollare


Maturazione Mieloide: SIDE SCATTER


CD34

CD13

CD33

CD66c

CD66b

CD11c

CD11b

CD11a

CD16

CD64

CD15

MATURAZIONE MIELOIDE:granulocitopoiesi

stem cell

Blasto mieloide

promielocita

Mielo cita

Meta mielocita

granulo cita


CD34

CD13

CD33

CD36

CD64

CD11b

CD14

MATURAZIONE MIELOIDE

monocitopoiesi

stem cell

Blasto mieloide

promonocita

Mono cita


CD11b

CD13

CD16

CD10

CD64

MATURAZIONE MIELOIDE: variabili di espressione

100

0

PROMIELO

MIELO

METAMIELO

GRAN


Maturazione

Interpretazione suCD66b/CD11b


Maturazione Mieloide

blocco maturativo

blasti

Interpretazione su CD66b/CD11b

BM normale

Sindrome mielodisplastica

+ mature

immature


Maturazione mieloide in BM normale

CD13

CD11b

CD16

CD16

CD10

CD11b

CD64

CD15


Maturazione mieloide in BM con MDS

CD13

CD11b

CD16

CD16

CD11b

CD10

CD64

CD15


Maturazione mieloide in BM con MDS


Maturazione monocitaria in BM con LMMC


Mean values of bone marrow leucocyte populations

Cell count34.5 x 106 cell/ml (SD 28.0)

Erythroid10.8% (SD 5.7)

Lymphocytes12.4% (SD 5.9)

CD361.4% (SD 15.1)CD429.3% (SD 11.3)

CD830.8% (SD 13.1)NK11.2% (SD 9.2)

CD1918.9% (SD 14.0)

CD19+10+ 43.10% (SD28.6) CD19+20+ 45% (SD28.9)

Monocytes (CD14)3.2% (SD 1.5)

CD34+ cells0.9% (SD 0.7)

Whole myeloid serie72.2% (SD 8.7)

Immature/blast3.6% (SD 2.1)

Promyelocytes12.3% (SD 6.3)

Myelo and metamyelo28.4% (SD 11.4)

band and mature48.9% (SD 15.5)

Eosinophils1.9% (SD 1.5)

Plasmacells0.4% (SD 0.3)

A. Santagostino


CD16 FITC/CD13 PE/CD34 PerCP-Cy5.5/

CD11b PE-Cy7/CD117 APC/CD45 APC-Cy7


Maturazione Mieloide: SIDE SCATTER

NORMALE

MDS


MDS ABNORMALITIES BY FCM

  • Hypogranulation of PMN84%

  • CD11b/CD16 abnormal70%

  • CD13/CD16 abnormal78%

  • CD64+ granulocytes66%

  • CD10- granulocytes11%

  • CD45-dim blasts53%

  • CD56+ granulocytes21%

  • CD56+ monocytes33%

  • My-cells expressing non-My Ags38%

Stetler-Stevenson, Blood 2001


CD16 FITC/CD13 PE/CD34 PerCP-Cy5.5/

CD11b PE-Cy7/CD56 APC/CD45 APC-Cy7


CD34

TdT

nucleare

CD79a

citoplasmatico

CD19

CD10

CD20

CD22

citoplasmatico

SmIg

PROFILO ANTIGENCO

Maturazione linfoide B

stem cell

Cellula pre-pre B

Cellula pre B

Cellula B


CD20 FITC/CD10 PE/CD34 PerCP-Cy5.5/

CD38 PE-Cy7/CD19 APC/CD45 APC-Cy7

Maturazione linfoide B


CD22 FITC/CD200 PE/ CD19 PerCP-Cy5.5 / CD5 PE-Cy7/ CD23 APC /CD45 APC-Cy7

Intensità di espressione nelle M. Linfoproliferative

MCL

CLL


Kappa FITC/Lambda PE/ CD20 PerCP-Cy5.5 / CD38 PE-Cy7/ CD19 APC /CD45 APC-Cy7

Intensità di espressione nelle M. Linfoproliferative

MCL

CLL


Presenza o assenza di marcatori nelle

M. Linfoproliferative

MCL

CLL


Espressione di ZAP-70 nelle CLL


VALUTAZIONE HCL

CD103 FITC/CD11c PE/ CD20 PerCP-Cy5.5 / CD25 PE-Cy7/ CD19 APC /CD45 APC-Cy7


VALUTAZIONE T-LDGL

CD57 FITC/CD5 PE/ CD3 PerCP-Cy5.5 / HLA-DR PE-Cy7/ CD8 APC /CD45 APC-Cy7


ANALISI BIVARIATA DELLA DISTRIBUZIONE DI CD158a E CD158b SULLE CELLULE NKpattern atteso in una popolazione policlonale

CD158b

CD158a


ANALISI BIVARIATA DELLA DISTRIBUZIONE DI CD158a E CD158b SU CELLULE KIR+ pattern compatibili con l’ipotesi di clonalità

CD158b

CD158b

CD158a

CD158a

CD158b

CD158b

CD158a

CD158a


ANALISI BIVARIATA DELLA DISTRIBUZIONE DI CD158a E CD158b SULLE CELLULE NK pattern atteso in una popolazione policlonale

pattern compatibili con l’ipotesi di clonalità


VALUTAZIONE PLASMACELLULE


Immunofenotipo plasmacellule normali


Immunofenotipo plasmacellule trasformate


Immunofenotipo plasmacellule trasformate

  • CD19-CD56-

  • CD19-CD56+


MGUS

Myeloma

CD38

+++/++

CD38

++

CD138

++

CD138

++

k &/or l

(monoclonal in a proportion of PCs)

k or l

(monoclonal)

CD56-/+

CD56++

CD19-/+

CD19-

CD20-

CD20-

CD45+/-

CD45-

CD117-

CD117-/+

CD38

++

CD38

+++

CD138

++

CD138

++

k or l

(monoclonal)

k & l

(polyclonal)

CD56++

CD56-

CD19+

CD19-

CD20-

CD20-

CD45+

CD45-

CD117-

CD117-/+

Plasma cells: normal vs clonal

Normal & reactive

CD38

+++

CD138

++

k & l

(polyclonal)

CD56-

CD19+

CD20-

CD45+

CD117-

Clonal

Ocqueteau et al, AJP 152,1655,1998


MM: dimostrazione di monoclonalità


Immunofenotipi plasmacellulari

IF1

IF2

% PC=15%

IF3

% PC=19%

IF4

% PC=5%


fattori prognostici in CFM

CD45

CD20

CD117

CD56

CD38


Nuovi targets per la terapia contro il MM


SANGUE PERIFERICO NORMALE

Presenza di PC-MM su Sangue periferico:

SANGUE MIDOLLARE MM

SANGUE PERIFERICO MM


DIAGNOSI

MMR

Malattia Minima Residua

A

B

Sensibilità strumentale = 1/10000


Conclusioni (I)

  • Utilità della citofluorimetria nel paziente affetto da MM:

  • distingue tra plasmacellule normali, reattive e patologiche

  • determina eventuali fattori prognostici

  • identificare nuovi targets per la terapia contro il mieloma

  • un’elevata sensibilità nel valutare la MMR

  • possibilità di evidenziare PC-MM anche su sangue periferico


Conclusioni (II)

  • L’analisi multiparametrica multicolore consente una maggiore opportunità di discriminare sottopopolazioni cellulari.

  • E’ necessario applicare buone procedure di validazione strumentale e ottimizzare la scelta delle combinazioni dei reagenti.

  • L’elettronica digitale ha decisamente aiutato nella esecuzione di analisi complesse fino a poco tempo fa impensabili.


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