L’immunofenotipo leucocitario: utilità diagnostica
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L’immunofenotipo leucocitario: utilità diagnostica. Roberto Caporale. Pistoia, 29 ottobre 2011. Bernard Shoor & Leonard Herzenberg at Stanford with one of the original BD Flow Cytometers. 1974 - Becton & Dickson, using FACS technology, introduced 1st commercial Flow (FACS-1).

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L’immunofenotipo leucocitario: utilità diagnostica

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Presentation Transcript


L immunofenotipo leucocitario utilit diagnostica

L’immunofenotipo leucocitario: utilità diagnostica

Roberto Caporale

Pistoia, 29 ottobre 2011


L immunofenotipo leucocitario utilit diagnostica

Bernard Shoor & Leonard Herzenberg

at Stanford with one of the original BD Flow Cytometers

1974 - Becton & Dickson, using FACS technology, introduced 1st commercial Flow (FACS-1)


L immunofenotipo leucocitario utilit diagnostica

Sistema FACSCanto II

BD Biosciences


Microscopia citometria in fluorescenza

Microscopia Citometria in fluorescenza


Citometria a flusso cfm

Citometria a Flusso (CFM)

La CFM consente l’analisi automatica di sospensioni cellulari monodisperse, misurandone le caratteristiche fisiche e/o biochimiche all’interno di un flusso laminare che interseca unasorgente di eccitazione


L immunofenotipo leucocitario utilit diagnostica

FOCALIZZAZIONEIDRODINAMICA

LASER

sheath fluid

campione


L immunofenotipo leucocitario utilit diagnostica

Rifrazione & Riflessione:proporzionale alla granularità cellulare e alla complessità rilevate a 90° rispetto la luce incidente.

Generazione dei segnali di “scatter”

SSC

GRANULOCITI

MONOCITI

FSC

Diffrazione:

proporzionale alle dimensioni

della cellula rilevata lungo

l’asse della luce incidente 0°

LINFOCITI


L immunofenotipo leucocitario utilit diagnostica

La combinazione dei due tipi di segnali permette di ottenere un particolare diagramma di dispersione denominatoCITOGRAMMAnel quale si possono evidenziare fino a 5 o 6 differenti popolazioni cellulari, in base alle sole caratteristiche fisiche


L immunofenotipo leucocitario utilit diagnostica

EOSINOFILI

EOSINOFILI

NEUTROFILI

NEUTROFILI

NEUTROFILI

MONOCITI

MONOCITI

MONOCITI

MONOCITI

LINFOCITI

LINFOCITI

LINFOCITI

LINFOCITI

LINFOCITI

BASOFILI

Sottopopolazioni leucocitarie in sangue periferico

-Citogramma -

COMPLESSITA’ 

VOLUME 


L immunofenotipo leucocitario utilit diagnostica

Immunofenotipizzazionecellulare

- definizione -

Insieme di metodi diretti al riconoscimento, alla quantificazione ed alla localizzazione di strutture cellulari per mezzo di reagenti immunologici (anticorpi monoclonali).


L immunofenotipo leucocitario utilit diagnostica

1st

Pubblicazioni

123328 references

(2010)

Crescita delle applicazioni diagnostiche in citometria a flusso


L immunofenotipo leucocitario utilit diagnostica

Requisiti per una buona

analisi citometrica

  • Esperienza dell’operatore

  • Valutazione delle prestazioni e della stabilità della strumentazione

  • Controlli di qualità (IQC, VEQ, EQAS)


L immunofenotipo leucocitario utilit diagnostica

Riproducibilità dei parametri di fluorescenza

Linfoma Follicolare - diagnosi

Linfoma Follicolare - MMR


L immunofenotipo leucocitario utilit diagnostica

Materiali idonei per indagini in CFM

  • Liquidi:

  • Sangue periferico

  • Aspirati Midollari

  • Leucaferesi

  • Liquor

  • Liquidi cavitari

  • Solidi:

  • Linfonodi

  • Biopsie

  • Agoaspirati


L immunofenotipo leucocitario utilit diagnostica

Regole per una corretta analisi citometrica in onco-ematologia

  • Quesito diagnostico (dialogo con i clinici)

  • Caratteristiche del campione da analizzare

  • Scelta di adeguate combinazioni di anticorpi monoclonali

  • Regolazione dello strumento e “compensazione” delle fluorescenze

  • Strategie di “gating” per il riconoscimento delle popolazioni cellulari da analizzare

  • Integrazione con i laboratori di morfologia, citogenetica e biologia molecolare

  • Formulazione di una risposta adeguata e conclusiva


L immunofenotipo leucocitario utilit diagnostica

Metodo di studio in citometria

  • Valutazione delle normali componenti cellulari del sangue midollare

  • Valutazione dello stadio maturativo di tali componenti

  • Dimostrazione della presenza nel campione di cellule anormali

  • Eventuale dimostrazione della loro clonalità

  • Evidenziazione di fenotipi peculiari allo scopo di identificare una determinata entità nosografica e/o utili per lasciare una traccia in corso di follow-up (MMR)


L immunofenotipo leucocitario utilit diagnostica

Espressione del CD45 nei leucociti


L immunofenotipo leucocitario utilit diagnostica

Sangue

periferico

Sangue

midollare

Sangue Periferico vs Sangue Midollare


L immunofenotipo leucocitario utilit diagnostica

Maturazione Mieloide: SIDE SCATTER


L immunofenotipo leucocitario utilit diagnostica

CD34

CD13

CD33

CD66c

CD66b

CD11c

CD11b

CD11a

CD16

CD64

CD15

MATURAZIONE MIELOIDE:granulocitopoiesi

stem cell

Blasto mieloide

promielocita

Mielo cita

Meta mielocita

granulo cita


L immunofenotipo leucocitario utilit diagnostica

CD34

CD13

CD33

CD36

CD64

CD11b

CD14

MATURAZIONE MIELOIDE

monocitopoiesi

stem cell

Blasto mieloide

promonocita

Mono cita


L immunofenotipo leucocitario utilit diagnostica

CD11b

CD13

CD16

CD10

CD64

MATURAZIONE MIELOIDE: variabili di espressione

100

0

PROMIELO

MIELO

METAMIELO

GRAN


L immunofenotipo leucocitario utilit diagnostica

Maturazione

Interpretazione suCD66b/CD11b


L immunofenotipo leucocitario utilit diagnostica

Maturazione Mieloide

blocco maturativo

blasti

Interpretazione su CD66b/CD11b

BM normale

Sindrome mielodisplastica

+ mature

immature


L immunofenotipo leucocitario utilit diagnostica

Maturazione mieloide in BM normale

CD13

CD11b

CD16

CD16

CD10

CD11b

CD64

CD15


L immunofenotipo leucocitario utilit diagnostica

Maturazione mieloide in BM con MDS

CD13

CD11b

CD16

CD16

CD11b

CD10

CD64

CD15


L immunofenotipo leucocitario utilit diagnostica

Maturazione mieloide in BM con MDS


L immunofenotipo leucocitario utilit diagnostica

Maturazione monocitaria in BM con LMMC


L immunofenotipo leucocitario utilit diagnostica

Mean values of bone marrow leucocyte populations

Cell count34.5 x 106 cell/ml (SD 28.0)

Erythroid10.8% (SD 5.7)

Lymphocytes12.4% (SD 5.9)

CD361.4% (SD 15.1)CD429.3% (SD 11.3)

CD830.8% (SD 13.1)NK11.2% (SD 9.2)

CD1918.9% (SD 14.0)

CD19+10+ 43.10% (SD28.6) CD19+20+ 45% (SD28.9)

Monocytes (CD14)3.2% (SD 1.5)

CD34+ cells0.9% (SD 0.7)

Whole myeloid serie72.2% (SD 8.7)

Immature/blast3.6% (SD 2.1)

Promyelocytes12.3% (SD 6.3)

Myelo and metamyelo28.4% (SD 11.4)

band and mature48.9% (SD 15.5)

Eosinophils1.9% (SD 1.5)

Plasmacells0.4% (SD 0.3)

A. Santagostino


L immunofenotipo leucocitario utilit diagnostica

CD16 FITC/CD13 PE/CD34 PerCP-Cy5.5/

CD11b PE-Cy7/CD117 APC/CD45 APC-Cy7


L immunofenotipo leucocitario utilit diagnostica

Maturazione Mieloide: SIDE SCATTER

NORMALE

MDS


L immunofenotipo leucocitario utilit diagnostica

MDS ABNORMALITIES BY FCM

  • Hypogranulation of PMN84%

  • CD11b/CD16 abnormal70%

  • CD13/CD16 abnormal78%

  • CD64+ granulocytes66%

  • CD10- granulocytes11%

  • CD45-dim blasts53%

  • CD56+ granulocytes21%

  • CD56+ monocytes33%

  • My-cells expressing non-My Ags38%

Stetler-Stevenson, Blood 2001


L immunofenotipo leucocitario utilit diagnostica

CD16 FITC/CD13 PE/CD34 PerCP-Cy5.5/

CD11b PE-Cy7/CD56 APC/CD45 APC-Cy7


L immunofenotipo leucocitario utilit diagnostica

CD34

TdT

nucleare

CD79a

citoplasmatico

CD19

CD10

CD20

CD22

citoplasmatico

SmIg

PROFILO ANTIGENCO

Maturazione linfoide B

stem cell

Cellula pre-pre B

Cellula pre B

Cellula B


L immunofenotipo leucocitario utilit diagnostica

CD20 FITC/CD10 PE/CD34 PerCP-Cy5.5/

CD38 PE-Cy7/CD19 APC/CD45 APC-Cy7

Maturazione linfoide B


L immunofenotipo leucocitario utilit diagnostica

CD22 FITC/CD200 PE/ CD19 PerCP-Cy5.5 / CD5 PE-Cy7/ CD23 APC /CD45 APC-Cy7

Intensità di espressione nelle M. Linfoproliferative

MCL

CLL


L immunofenotipo leucocitario utilit diagnostica

Kappa FITC/Lambda PE/ CD20 PerCP-Cy5.5 / CD38 PE-Cy7/ CD19 APC /CD45 APC-Cy7

Intensità di espressione nelle M. Linfoproliferative

MCL

CLL


L immunofenotipo leucocitario utilit diagnostica

Presenza o assenza di marcatori nelle

M. Linfoproliferative

MCL

CLL


L immunofenotipo leucocitario utilit diagnostica

Espressione di ZAP-70 nelle CLL


L immunofenotipo leucocitario utilit diagnostica

VALUTAZIONE HCL

CD103 FITC/CD11c PE/ CD20 PerCP-Cy5.5 / CD25 PE-Cy7/ CD19 APC /CD45 APC-Cy7


L immunofenotipo leucocitario utilit diagnostica

VALUTAZIONE T-LDGL

CD57 FITC/CD5 PE/ CD3 PerCP-Cy5.5 / HLA-DR PE-Cy7/ CD8 APC /CD45 APC-Cy7


L immunofenotipo leucocitario utilit diagnostica

ANALISI BIVARIATA DELLA DISTRIBUZIONE DI CD158a E CD158b SULLE CELLULE NKpattern atteso in una popolazione policlonale

CD158b

CD158a


L immunofenotipo leucocitario utilit diagnostica

ANALISI BIVARIATA DELLA DISTRIBUZIONE DI CD158a E CD158b SU CELLULE KIR+ pattern compatibili con l’ipotesi di clonalità

CD158b

CD158b

CD158a

CD158a

CD158b

CD158b

CD158a

CD158a


L immunofenotipo leucocitario utilit diagnostica

ANALISI BIVARIATA DELLA DISTRIBUZIONE DI CD158a E CD158b SULLE CELLULE NK pattern atteso in una popolazione policlonale

pattern compatibili con l’ipotesi di clonalità


L immunofenotipo leucocitario utilit diagnostica

VALUTAZIONE PLASMACELLULE


L immunofenotipo leucocitario utilit diagnostica

Immunofenotipo plasmacellule normali


L immunofenotipo leucocitario utilit diagnostica

Immunofenotipo plasmacellule trasformate


L immunofenotipo leucocitario utilit diagnostica

Immunofenotipo plasmacellule trasformate

  • CD19-CD56-

  • CD19-CD56+


L immunofenotipo leucocitario utilit diagnostica

MGUS

Myeloma

CD38

+++/++

CD38

++

CD138

++

CD138

++

k &/or l

(monoclonal in a proportion of PCs)

k or l

(monoclonal)

CD56-/+

CD56++

CD19-/+

CD19-

CD20-

CD20-

CD45+/-

CD45-

CD117-

CD117-/+

CD38

++

CD38

+++

CD138

++

CD138

++

k or l

(monoclonal)

k & l

(polyclonal)

CD56++

CD56-

CD19+

CD19-

CD20-

CD20-

CD45+

CD45-

CD117-

CD117-/+

Plasma cells: normal vs clonal

Normal & reactive

CD38

+++

CD138

++

k & l

(polyclonal)

CD56-

CD19+

CD20-

CD45+

CD117-

Clonal

Ocqueteau et al, AJP 152,1655,1998


L immunofenotipo leucocitario utilit diagnostica

MM: dimostrazione di monoclonalità


L immunofenotipo leucocitario utilit diagnostica

Immunofenotipi plasmacellulari

IF1

IF2

% PC=15%

IF3

% PC=19%

IF4

% PC=5%


L immunofenotipo leucocitario utilit diagnostica

fattori prognostici in CFM

CD45

CD20

CD117

CD56

CD38


L immunofenotipo leucocitario utilit diagnostica

Nuovi targets per la terapia contro il MM


L immunofenotipo leucocitario utilit diagnostica

SANGUE PERIFERICO NORMALE

Presenza di PC-MM su Sangue periferico:

SANGUE MIDOLLARE MM

SANGUE PERIFERICO MM


L immunofenotipo leucocitario utilit diagnostica

DIAGNOSI

MMR

Malattia Minima Residua

A

B

Sensibilità strumentale = 1/10000


L immunofenotipo leucocitario utilit diagnostica

Conclusioni (I)

  • Utilità della citofluorimetria nel paziente affetto da MM:

  • distingue tra plasmacellule normali, reattive e patologiche

  • determina eventuali fattori prognostici

  • identificare nuovi targets per la terapia contro il mieloma

  • un’elevata sensibilità nel valutare la MMR

  • possibilità di evidenziare PC-MM anche su sangue periferico


L immunofenotipo leucocitario utilit diagnostica

Conclusioni (II)

  • L’analisi multiparametrica multicolore consente una maggiore opportunità di discriminare sottopopolazioni cellulari.

  • E’ necessario applicare buone procedure di validazione strumentale e ottimizzare la scelta delle combinazioni dei reagenti.

  • L’elettronica digitale ha decisamente aiutato nella esecuzione di analisi complesse fino a poco tempo fa impensabili.


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