CROMATOGRAFÍA
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CROMATOGRAFÍA. Fase estacionaria: sólido o líquido fijado a un sólido. Fase móvil: fluído (líquido o gas) que arrastra la muestra a través de la fase estacionaria. Los distintos componentes de la mezcla interaccionan de manera diferente con las dos fases estableciéndose un reparto entre ambas.

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CROMATOGRAFÍA

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Presentation Transcript


Cromatograf a

CROMATOGRAFÍA

Fase estacionaria: sólido o líquido fijado a un sólido

Fase móvil: fluído (líquido o gas) que arrastra la muestra a través de la fase estacionaria

Los distintos componentes de la mezcla interaccionan de manera diferente con las dos fases estableciéndose un reparto entre ambas

Se establece un equilibrio entre partículas adsorbidas y desorbidas

α =[moléculas adsorbidas]

[mol. adsorbidas] + [mol. desorbidas]

coeficiente de reparto


Cromatograf a

FASE MÓVIL

FASE ESTACIONARIA


Cromatograf a

Clasificaciones de cromatografía

1.Según como se encuentre la fase estacionaria

a. columna

b. batch

c. plana cromatografía en papel y en capa fina


Cromatograf a

2. Según el tipo de fase estacionaria y fase móvil

Fase estacionaria

Fase móvil

Sólida

Líquida o gaseosa

Líquido adsorbido

Líquida o gaseosa


Cromatograf a

3.Según el tipo de flujo empleado

a. Gravedad

b. Capilaridad (papel, capa fina)

c. Fluído a presión (HPLC)


Cromatograf a

HPLC (high performance liquid chromatography)

Se basa en los mismos principios que la cromatografía a baja presión

Tiene mejor resolución, tiempos menores, mejor reproducibilidad

El material empacado en las columnas está formado por pequeñas partículas de tamaño muy uniforme y gran rigidez

Permite trabajar con flujos altos para lo que se requiere aplicar presión

Se requiere de columnas especiales construidas en acero inoxidable o vidrio grueso


Cromatograf a

FPLC (fast protein liquid chromatography)

Es una variante del HPLC con columnas y equipamiento especialmente diseñado para separar o purificar proteínas

Las columnas de FPLC soportan menos presión que las de HPLC


Cromatograf a

4.Según la finalidad del experimento

Preparativa

Separación y purificación

Analítica

Separación, cuantificación y caracterización


Cromatograf a

4.Según la interacción entre la fase móvil y el soluto

a. Cromatografía de intercambio iónicocarga-carga

b. Cromatografía de interacción hidrofóbicaefecto hidrofóbico

c. Cromatografía de afinidadvariada pero específica

enlaces covalentes

d. Cromatografía de afinidad por metales inmovilizados (IMAC)

e. Cromatografía de fase normal y reversadipolos


Cromatograf a

Cromatografía de intercambio iónico

La separación se basa en diferencias de carga a un pH dado

Las interacciones son electrostáticas

Dos tipos

Intercambio aniónico: matriz cargada positivamente (DEAE, TEA, QAE)

Intercambio catiónico: matriz cargada negativamente (carboximetilos, sulfonatos, fosfatos)

Elución: puede llevarse a cabo mediante cambios de pH, fuerza iónica o ambos


Cromatograf a

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Condiciones iniciales

Aplicación de la muestra


Cromatograf a

Aumento en la concentración de sales

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Elución de la proteína de interés


Cromatograf a

Cromatografía de afinidad

Se basa en una interacción biológica específica:

Enzima-sustrato

Anticuerpo-antígeno

Enzima-coenzima

Proteína-ligando específico

La elución se puede lograr agregando el ligando (el que está unido a la columna) en solución o mediante cambios en el buffer que sean capaces de debilitar la interacción


Cromatograf a

IMAC (immobilized metal affinity chromatography)

Se basa en la formación de enlaces de coordinación entre iones metálicos inmovilizados y grupos básicos en proteínas (histidinas)

Principalmente a los iones divalentes de metales de transición como Fe, Co, Ni, Cu y Zn

La elución se lleva a cabo adicionando quelantes más fuertes como el imidazol a distintas concentraciones o cambios en el pH


Cromatograf a

Es muy utilizada para la purificación de proteínas recombinantes

Generalmente se adicionan 6 histidinas en el extremo Nt o en el Ct

Cola de (Histidina)6

Ni2+


Cromatograf a

Cromatografía de interacción hidrofóbica

El soporte está sustituído con cadenas alifáticas de 2 a 10 carbonos u otros grupos hidrofóbicos

La interacción es de tipo hidrofóbica

La fase móvil debe tener una alta concentración de sales ((NH4)2SO3 2 – 4 M)

Salting out

Para la elución se disminuye la concentración de sales en la fase móvil


Cromatograf a

Cromatografía de fase reversa

Está muy relacionada con la cromatografía de interacción hidrofóbica pero son diferentes

El soporte está sustituído por alifáticas pero más largas (8 -18 carbonos) y la densidad de sustituyentes es mayor

La unión es más fuerte y por eso requiere mezclas con solventes no polares para la elución

Desnaturaliza proteínas

Se utiliza en HPLC


Cromatograf a

Gel filtración (cromatografía de exclusión molecular)

No es una cromatografía

La separación se da por tamaño


Cromatograf a

El gel debe ser inerte, de tamaño de poro definido y sin carga

Múltiples aplicaciones:

Cambios de buffer

Separación de moléculas de bajo peso molecular de otras de mayor tamaño

Determinación del peso molecular


Cromatograf a

Resultado final: cromatograma

y

y

Velución (mL)

Velución (mL)

y = unidades de absorbancia, unidades de fluorescencia relativa, intensidad del pico (espectrometría de masa), entre otras


Cromatograf a

Concluyendo….

La pregunta más importante…

¿En qué son distintas las sustancias que deseo separar?


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