INTRODUCCIN A LOS BIOPROCESOS
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Ingenier

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Presentation Transcript


Ingenier

INTRODUCCIN A LOS BIOPROCESOS

Parte II

Ingeniera Bioqumica I

  • . Evolucin y caractersticas de los bioprocesos

  • . Introduccin a las operaciones de un proceso biotecnolgico

  • . Seleccin de un proceso

Alejandra Bosch


Ingenier

SELECCIN DE UN PROCESO BIOTECNOLGICO

ASPECTOS QUE INTERVIEN

EN LA SELECCIN DE UN PROCESO

A) ECONMICO

Relacionados con el mercado y especificaciones del producto

Evaluar el potencial econmico del producto

B) TCNICO

Relacionados con el diseo del proceso

Desarrollar y evaluar varios esquemas de operacin para obtener el Diseo ptimo

DESARROLLAR UN DISEO COMPLETO DEL BIOPROCESO

Secuencia de operaciones de separacin

El equipamiento requerido


Ingenier

Cules podran ser los productos de inters?

  • Productos

  • insulina, antibiticos,

  • hormonas, enzimas

    • Procesos y servicios que emplean microorganismos

    • cervezas, vinos, vacunas,

    • organismos para biorremediacin


Ingenier

Material biolgico de partida

Clulas animales

Clulas vegetales

bacterias


Ingenier

Protenas

  • Son las macromolculas biolgicas ms abundantes

  • Se encuentran en todas las clulas y en todas partes dentro de las clulas

  • Existen miles de diferentes tipos y tamaos de protenas

  • Exhiben una gran cantidad de diversidad de funciones


Ingenier

Funcin biolgica de las protenas en bacterias


Ingenier

SELECCIN DE UN PROCESO BIOTECNOLGICO

ASPECTOS QUE INTERVIEN

EN LA SELECCIN DE UN PROCESO

A) ECONMICO

Relacionados con el mercado y especificaciones del producto

Evaluar el potencial econmico del producto

B) TCNICO

Relacionados con el diseo del proceso

Desarrollar y evaluar varios esquemas de operacin para obtener el Diseo ptimo

DESARROLLAR UN DISEO COMPLETO DEL BIOPROCESO

Secuencia de operaciones de separacin

El equipamiento requerido


Ingenier

Especificaciones del material de partida y producto

  • 1)ESPECIFIACIN DEL PRODUCTO: DEFINIR EL OBJETIVO FINAL

  • (Start at the end) Definir el producto y su utilizacin:

  • - producto final (cual es?, Cmo se usa?)

    • pureza requerida

    • rangos de concentracin de impurezas permitidas

    • alguna impureza que deba ser eliminada

    • Tioxicidad, estabilidad,

2)CARACTERSTICAS DEL MATERIAL DE PARTIDA

-fuente:bacteria (E. coli) fermentacin

cultivo de clulas (presencia albmina, suero , restos de membranas-

levaduras (producto intracelular o extracelular?)

-Caractersticas fisicoqumicas del material de partida ( viscosidad, tamao de partculas) y del producto final (pI, PM, estabilidad,)


Ingenier

SELECCIN DE UN PROCESO BIOTECNOLGICO

ASPECTOS QUE INTERVIEN

EN LA SELECCIN DE UN PROCESO

A) ECONMICO

Relacionados con el mercado y especificaciones del producto

Evaluar el potencial econmico del producto

B) TCNICO

Relacionados con el diseo del proceso

Desarrollar y evaluar varios esquemas de operacin para obtener el Diseo ptimo

DESARROLLAR UN DISEO COMPLETO DEL BIOPROCESO

Secuencia de operaciones de separacin

El equipamiento requerido


Ingenier

  • B) ASPECTOS TCNICOS DEFINIR EL PROCESO

  • Definir las operaciones y secuencia de separacin

  • Etapas o tiempo por operacin

  • Escala

  • Costo

Una vez definido

El producto

La pureza deseada

La concentracin deseada

A) ASPECTOS ECONOMICOS

PRODUCTO


Ingenier

PROCESO DE SNTESIS Y OPTIMIZACIN

  • Definir las operaciones y secuencia de separacin

Objetivo de este paso es explotar al mximo las propiedades fisicoqumicasque diferencian al producto deseado del resto de los productos contaminantes de la manera ms econmica

  • i) elegir entre OPERACIONES alternativas

  • ii) diseo de una SECUENCIA PTIMA para obtener mximo rendimiento con el menor nmero de pasos

  • - Existen muchas alternativas y en diferente orden

  • (es un problema de combinatoria)


Ingenier

Cules son las OPERACIONES alternativas?

1.-

2.-

3.-

5.-


Ingenier

1.- Remocin celular:Centrifugacin - filtracin

2. DISRUPCIN CELULAR Y SEPARACIN DE RESTOS CELULARES

La tcnica ms recomendada para alta escala son los homogeinizadores (Gaulin homogenizer)

- Homogeinizacin: - suspensiones celulares 15-20% (peso seco)

- concentracin celular no afecta la eficiencia

- es necesario refrigerar (4-5C)

- Modelos ms grandes 6,000 L/h (levaduras y bacterias)

  • Molinos de perlas

  • pequeas perlas de vidrio (0.3-0.4mm )

  • - diferentes diseos de agitadores

  • - concentracin de clulas afecta la eficiencia

  • concentracin ptima 30-60% peso hmedo

  • modelos mas grandes 2000 L/h

  • Ruptura qumica o enzimtica

  • limitado a baja escala (Lysozyme, Triton, otras)


Ingenier

  • Separacin de restos celulares

    • centrifugacin (no adecuada)

    • ultrafiltracin (300,000 500,000 o mayor)

    • Microfiltracin (0.1 m.)

    • particin en dos fases acuosas

    • (clulas rotas y restos quedan en la fase inferior)

    • CDR (cell Debris Remover: Whatman)

  • 3. CONCENTRACIN

  • Los productos deben concentrarse hasta 10-50 veces.

  • Tcnica preferida : Ultrafiltracin

  • - particin lquido-lquido. Extraccin con solventes

  • - Precipitacin (sulfato de NH4)

  • -Evaporacin

  • - Destilacin


  • Ingenier

    • 4.- PRETRATAMIETNO O EXTRACCIN DEL PRODUCTO

      • Adsorcin

      • Intercambio inico

      • Cromoatografa de intercambio hidrofbico

    • 5.-PURIFICACIN DE ALTA RESOLUCIN

      • - Cromatografa de interaccin hidrofbica (HIC)

      • -Cromatografa de intercambio inico de alta resolucin

      • - Cromatografa de afinidad

      • - Cromatografa metal quelante (IMAC)

      • . Otras cromatografas: dye-ligand chromatography

      • (triazine-colorante)

    6. ACABADO

    esterilizacin y estabilizacin del producto

    deshidratacin, liofilizado, estabilizacin (sales)


    Ingenier

    PROCESO DE SNTESIS Y OPTIMIZACIN

    • i) elegir entre OPERACIONES alternativas

    • ii) diseo de una SECUENCIA PTIMA para obtener mximo rendimiento con el menor nmero de pasos

    • - Existen muchas alternativas y en diferente orden

    • (es un probelma de combinatoria)

    Cmo elegimos las operaciones y secuencias?


    Ingenier

    • Solucin rigurosa o solucin algortmica

    • Resuelve qu operaciones son apropiadas pero NO SECUENCIA

    • Utilizacin de las reglas de oro de la purificacin - Mtodo Heurstico.

    • Resuelve las OPERACIONES y la SECUENCIA

    • 3. Uso de TECNICAS DE INTELIGENCIA ARTIFICIAL:

    • SISTEMAS EXPERTOS (SE)

    • - utilizan el conocimiento emprico

    • escanean toda la informacin acerca de las propiedades de la muestra y las operaciones

    • toma en cuenta las reglas de oro de la purificacin

    • utilizan correlaciones matemticas y bases de datos

    • Encuentran una solucin ptima al problema del proceso de purificacin y la secuencia


    Ingenier

    1.- Solucin rigurosa o solucin algortmica

    Utilizacin de mtodos numricos clsicos, ecuaciones de diseo.

    Resuelve el punto de OPERACIONES permitiendo elegir entre operaciones alternativas.

    Emplea tcnicas de programacin matemtica. Crean un diagrama de flujo que contiene todas las posibles alternativas de diseo


    Ingenier

    • Utilizacin de las reglas de oro de la purificacin - Mtodo Heurstico.

    • Resuelve OPERECIONES Y SECUENCIAS

    • Emplea reglas desarrolladas a travs

    • Diseos previos y experiencia exitosas de otros procesos

    • Antecedentes del mismo proceso

    • Sentido comn


    Ingenier

    2. Utilizacin de las reglas de oro de la purificacin

    REGLA 1Elegir procesos de separacin basados en diferentes propiedades fsicas, qumicas o bioqumicas

    REGLA 2Separar las impurezas ms abundantes primero

    Es importante eliminar el agua en las primeras etapas del proceso. Tratar de reducir el material de trabajo hasta un 90% del volumen inicial

    REGLA 3 Seleccionar un procesos que permita aprovechar al mximo las diferencia entre las propiedades fisicoqumicas del producto y los contaminantes.

    - Se deben conocer las propiedades del producto y de las principales impurezas

    REGLA 4 Realizar las separaciones ms caras y difciles al final

    KEEP IT SIMPLE!


    Propiedades de las prote nas a tener en cuenta en los proceso de separaci n y purificaci n

    Ejemplo REGLA 1

    REGLA 1Elegir procesos de separacin basados en diferentes propiedades fsicas, qumicas o bioqumicas

    Propiedades de las protenas a tener en cuenta en los proceso de separacin y purificacin

    • Propiedades fsico - qumicas

    • Punto isoelctrico

    • Carga, curva de valoracin

    • Tamao, PM

    • Especificidad por ligandos

    • Propiedades de superficie (hidrofobicidad)

    • Estabilidad


    Distribuci n de pis

    100

    90

    80

    70

    Number of Proteins

    60

    50

    40

    30

    1

    2

    3

    4

    5

    6

    7

    8

    9

    10

    pI

    20

    10

    0

    20 40 60 80 100 120 140 160

    M. W. s (x103)

    Caractersticas fisicoqumicas de las principales protenas de E. Coli

    Distribucin de PIs

    Distribucin de PM

    70

    60

    50

    40

    Number of Proteins

    30

    20

    10


    Ingenier

    Operaciones de Separacin y Purificacin de protenas en gran escalaMtodos de Recuperacin y purificacin y las correspondientes propiedades fsicoqumicas involucradas en la operacin [*]

    Operation

    Physico-chemical property

    Centrifugation

    Sedimentation Velocity

    Filtration

    Particle size

    Microfiltration

    Particle size

    Homogeneization

    Intracellular nature (pressure gradient)

    Bead milling

    Intracellular nature (liquid/solid shear)

    Ultrafiltration

    Mol

    ecular size

    Two phase extraction

    Partition coefficient

    Precipitation

    Solubility (hydrophobic interaction)

    Adsorption

    Van der Waals forces, H bonds, polarities,

    dipole moments

    Ion

    -

    exchange

    Charge (titration curve)

    Hydrophobic interaction

    Surface hydrop

    hobicity

    Affinity chromatography

    Biological affinity

    Gel filtration

    Molecular size

    Reversed phase liquid chromatography

    Hydrophilic and hydrophobic interactions

    [*] Prokopakis and Asenjo (1990)


    Sintesis de un proceso de bioseparaci n aproximaci n heur stica

    SINTESIS DE UN PROCESO DE BIOSEPARACINaproximacin Heurstica

    Intracelular

    remocin del componente ms abundante

    1. SEPARACIN CELULAR

    PASOS

    1. Desarrollar un diagrama de bloques con las principales etapas

    2. Seleccionar para cada etapa las operaciones alternativas tratando de emplear las reglas

    2. DISRUPCIN CELULAR

    REMOCIN DE RESTOS CELULARES Y DESECHOS

    Extracelular

    3. CONCENTRACIN

    4. PRETRATAMIENTO

    Es muy importante la eleccin del PASO INICIAL, ya que es el que debe eliminar la mayora de los contaminantes. Los pasos subsiguientes son empleados para eliminar los contaminantes de menor importancia

    5. PURIFICACIN DE ALTA RESOLUCIN

    6 ACABADO


    Ingenier

    • 3. Uso de TECNICAS DE INTELIGENCIA ARTIFICIAL:

    • SISTEMAS EXPERTOS (SE)

    • - utilizan el conocimiento emprico

    • escanean toda la informacin acerca de las propiedades de la muestra y las operaciones

    • toma en cuenta las reglas de oro de la purificacin

    • utilizan correlaciones matemticas y bases de datos

    • Encuentran una solucin ptima al problema del proceso de operaciones y la secuencia


    Ingenier

    Base de datos. Conocimiento requerido para solucionar el problema especfico. Reglas de purificacin. Conocimiento emprico.

    Motor deductivo. Es el programa que utiliza el conocimiento para tomar decisiones.

    Permite la comunicacin entre el conocimiento y el programa.

    Secuencia de operaciones en un proceso downstream y la comparacin entre varios mtodos de separacin en trminos de costos y eficiencia


    Ingenier

    Muestra la implementacin de dos criterios para seleccionar la mejor secuencia de operaciones para la purificacin de una mezcla simple de protenas y otra compleja (sobrenadante de cultivo)

    selection separation coefficient (SSC criterion)

    final level of purity (Purity criterion)

    ????

    The design of downstream processes for large-scale protein purification


    Ingenier

    ii) Escala de operacin

    Ver la compatibilidad entre la operacin y la escala en la cual se va a disear

    Analizar el lmite que poseen las operaciones elegidas

    iii) Nmero de etapas

    Debe considerarse en el diseo si los procedimientos seleccionados requieren de alguna etapa de regeneracin, elusin del producto deseado, etc

    iii) Costos

    • costos de operacin

    • Costos fijos

    • Gastos de planta

    • administracin (impuestos)

    • Investigacin y desarrollo


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