TESTI UTILI GENETICA MOLECOLARE Strachan T., Read A.P Genetica Umana Molecolare (UTET)

1. TESTI UTILI • GENETICA MOLECOLARE • Strachan T., Read A.P • Genetica Umana Molecolare (UTET) • (Human Molecular Genetics 3, Gardland Science) • GENETICA STATISTICA • Ott J (1999) Analysis of human genetic linkage. Johns Hopkins University Press, Baltimore • Sham P (1997) Statistics in human genetics. Arnold; Wiley, London, New York

2. VARIABILITA’ DEL GENOMA E MUTAZIONI • Replicazione del DNA -> errori -> meccanismi di riparo (non effic. al 100%) • Tasso di mutazione per nucleotide nell’ordine di 1/109 • Agenti esterni (mutageni, radiazioni etc) • MUTAZIONI • cambiamenti stabili (ereditabili) nella sequenza del DNA • Se una mutazione insorge in una porzione del DNA codificante o funzionalmente importante può avere un effetto sul fenotipo. • variabilità -> evoluzione • Mutazioni patogeniche -> malattie genetiche • Possono insorgere a livello di: • cellule somatiche (-> cancro, invecchiamento) • cellule germinali • POLIMORFISMI • presenza nella popolazione di 2 o piú varianti alleliche, • con una frequenza significativamente alta (> 1%)

3. MUTAZIONI SEMPLICI (puntiformi) causate per lo più da errori spontanei nella replicazione del DNA e riparo • EFFETTI PATOGENI DELLE MUTAZIONI PUNTIFORMI • Nella regione codificante di un gene • Sostituzioni sinonime (silenti) La > parte sono neutrali. Talvolta possono creare degli errori di splicing • Sostituzioni non sinonime (missense) Spesso deleterie. • Nonsense: quasi sempre deleterie. • proteina troncata • mRNA instabile (nonsense-mediated mRNA decay) • exon skipping (raro) • Inserzioni/delezioni -> Framshift -> in genere introducono un codone di stop • Introni • mutazioni di splicing • assenza di splicing dell’introne • uso di un sito di splicing illegittimo (criptico) • exon skipping • Mutaz nel 5’ o 3’ non tradotto • es: nel segnale di poliadenilazione AAUAA • siti target di microRNA • Mutazioni in regioni regolatorie

4. Riarrangiamenti mediati dalla presenza di SEQUENZE RIPETUTE • Slipped strand mispairing • Crossing-over ineguale

5. SEQUENZE RIPETUTE • DNA CODIFICANTE: • Famiglie multigeniche • Motivi strutturali conservati • Ripetizioni in tandem di geni per rRNA e istoni • DNA NON CODIFICANTE • In tandem • Sequenze ripetute intersperse

6. 1) Famiglie geniche • duplicazione e divergenza da un gene ancestrale • es. geni globinici • Famiglie di geni con regioni conservate che codificano per domini funzionali • Es fattori di trascrizione (Homeobox, Zinc-finger etc) • PSEUDOGENI copie non funzionali • Non-processati (espressi/non espressi) • Processati

7. 2) Sequenze ripetute extrageniche • Ripetizioni in tandem • 1)Altamente ripetuto -> DNA satellite • 2) Polimorfiche: • minisatelliti • microsatelliti • Seq ripetute intersperse DNA SATELLITE Alu

9. LINEs (L1) • LINEs • > 5 kb • 104 • Kpn o L1- 6.1kb, molte sono forme troncate al 5’ • 2 ORF, ORF1 = RNA binding prot, ORF2 = RT e endonucleasi • SINEs • <500 bp • 105 • Alu - 2 ripetizioni di una seq di ~120 bp • ~ ogni 4 kb • omologia con 7SL RNA-> propagate tramite retrotrasposizione

10. Propagazione delle LINEs e SINEs tramite retrotrasposizione

11. 1)SLIPPED STRAND MISPAIRING Appaiamento sfasato di corte sequenze ripetute in tandem Causa piccole delezioni/inserzioni (che possono essere patogene o generare polimorfismi STR )

12. Crossing-over ineguale (NAHR: non-allelic homologous recombination)

13. Direct repeats : deletion and/or duplication Inverted repeats : inversion

14. Segmental duplications • LCR (low copy repeat) • Sequenziamento del genoma -> presenza di duplicazioni di sequenze 10-400Kb, con alta similarità (>95-97%). • Rappresentano almeno il 5% genoma • Inter-cromosomiche (soprattutto in reg pericentrom e subtelomeriche • Intra-cromosomiche (cromosoma specifiche) • Causa di riarrangiamenti genomici associati a malattie genetiche • Smith Magenis Syndrome, Charcot-Marie-Tooth (crom 17) Prader-Willi/Angelman Syndrome (crom 15). • Regioni pericentromeriche e subtelomeriche contengono alto num di segmental duplications

15. Genomic Disorders Patologie che derivano da riarrangiamenti di una regione di DNA, causati da ricombinazione omologa ineguale tra LCR -> delezione o duplicazione di 1 o + geni sensibili al dosaggio, o inattivazione di uno specifico gene • 1) Membri di famiglie geniche/peudogeni ripetuti in tandem • Es: Talassemia alfa-globina • Daltonismo pigmenti rosso/verde dei coni 2) Sequenze ripetute che fiancheggiano geni Charcot Marie Tooth (CMT-1A) PMP22 Ittiosi X-linked STS Smith Magenis Williams Syndrome 3) Sequenze ripetute inverse Emofilia A Fattore VIII

16. Polimorfismi • Presenza nella popolazione di 2 o piú varianti alleliche di un gene o una determinata sequenza di DNA • Allele più raro frequenza maggiore 1% • La > parte di polimorfismi sono neutrali, non hanno un effetto sul fenotipo • TIPI DI POLIMORFISMI PIU’ COMUNI • Cambiamenti di una singola base (SNPs) • Inserzioni o delezioni di piccole dimensioni • Variazione nel numero di sequenze ripetute in tandem • microsatelliti (Short Tandem Repeats) • minisatelliti (VNTR)

17. Predisposizione a malattie Caratteristiche fisiche Risposta a influenze ambientali Risposta a farmaci Varianti Seq DNA Variabilità fenotipica • SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms) • Differenze di singola base • Biallelici • Più frequenti varianti di DNA (circa 1/300 bp) • Sviluppo di tecniche di genotyping automatizzate e in larga scala • Basso tasso di mutazione in confronto ai microsatelliti DbSNPhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/

18. SNP variation in humans Number of SNPs in dbSNP total non-redundant SNPs ~ 10 million common SNPs in the human genome double hit validated by genotyping Nature 437:1299 (2005)

19. Microsatelliti (STR Short Tandem Repeats) • Classe di sequenze ripetute, costituite da ripetizioni in tandem di 2-3-4 pb • Fiancheggiate da sequenze uniche • Es: Ripetiz di dinucleotidi CA/GT CT/AG • Molto polimorfici e uniformemente distribuiti nel genoma (1/50-100 Kb) • -> utili come marcatori genetici • Minisatelliti • ripetizioni in tandem di una corta sequenza (10-100 bp) • distribuzione non omogenea (vicino ai telomeri) • sequenza comune (core) GGGCAGGAXG + seq specifiche • Molto polimorfici : utili come marcatori per mappe genetiche ma distribuz non omogenea • Utilizzati in passato per DNA FINGERPRINTING • (descritti da Jeffreys)

20. Genetic variation in the human genome

21. Tecniche citogenetiche -> anomalie cromosomiche (> 3 Mb) • Tecniche molecolari (sequenziamento) -> varianti del DNA di piccole dimensioni (< 1-10 Kb) • Nuove tecnologie hanno recentemente permesso di individuare varianti del DNA di dimensioni intermedie: • Varianti strutturali submicroscopiche • Copy Number Variants (CNVs) (inserzioni, duplicazioni, delezioni) • Inversioni

22. ARRAY CGH (Comparative Genome Hybridization) Rivela le differenze tra 2 genomi Arrays: BAC Oligonucleotidi (60-100 bp)

23. ROMA (representational oligonuclotide microarray analysis)

24. Affymetrix SNP arrays AA BB AB Allele A AGTGGGTCGAGCTGATCGATCGGTCG PM-A MM-A PM-B MM-B Allele B AGTGGGTCGAGCCGATCGATCGGTCG AGTGGGTCGAGCAGATCGATCGGTCG mismatch AGTGGGTCGAGCGGATCGATCGGTCG mismatch

27. 1400 CNVs 12% (360 Mb) genoma analisi su 270 individui

28. Effetti delle varianti strutturali sul fenotipo: • dosaggio genico • position effect

29. 285 geni in OMIM morbid map -> overlap con CNVs • Alta densità di CNVs vicino ai breakpoint di genomic disorders • Difficoltà nel risolvere le correlazioni genotipo-fenotipo Database of genomic variants http://projects.tcag.ca/variation