Meditsiiniline Keemia Analüütiline keemia, Instrumentaalanalüüs

1. Meditsiiniline KeemiaAnalüütiline keemia, Instrumentaalanalüüs Elektroforees ja massispektromeetria 8. Detsember 2008 Eva-Ingrid Rõõm

2. Elektroforees (EP) • Foreestuleneb kreeka verbist phorēsis < phorein, mis tähendab (pidevalt, jätkuvalt) tassima, kandma. • Seega elektroforees on lihtsustatult “elektri poolt kandmine”. • Elektroforees eraldab aineid nende liikumiskiiruse järgi elektriväljas. • Lahutatavad ained peavad esinema ioonidena. • Ioone liigutatakse vastavalt vastasmärgiliste laengute tõmbumise põhimõttele.

3. Elektroforees (EP) • Iooni liikumiskiirus elektriväljas n: n= meE = meV/L me – elektroforeetiline liikuvus, ainele iseloomulik suurus, mille absoluutväärtus kasvab proportsionaalselt osakese summaarse laenguga z ja kahaneb proportsiaonaalselt osakesele keskkonna poolt avaladatava takistusega (tugevalt sõltuvuses osakese suurusest ja massist m). Summaarselt negatiivse laenguga ioonide korral on väärtus negatiivne. E – elektrivälja tugevus V - elektrivälja potentsiaal, elektroodide vaheline potentsiaal (V, voltides) L – elektroodide vaheline kaugus

4. Elektroosmoos • Vedeliku liikumist elektriväljas nimetatakse elektroosmootseks voolamiseks. Liikumiskiirus: n= meoE meo – elektroosmootne liikuvus, sõltub selles sisalduvate ioonide suunatud liikumisest ühelt elektroodilt teiseni ja ka EP anuma kujust. Mõjutama hakkab EO tulemusi kapillaar-elektroforeesis. E – elektrivälja tugevus • Seega summaarne iooni liikumiskiirus elektriväljas ja LAHUSES: n= (meo + me)E • Negatiivselt laetud iooni korral onmenegatiivse väärtusega. • Seega võib iooni summaarne liikumine toimuda nii katoodi kui anoodi suunas.

5. Elektroforeesi liigid • Elektroforees jaotatakse • Planaarseks elektroforeesiks (Slab electrophpresis, SEP) • Kapillaarelektroforeesiks (Capillary electrphoresis, CEP) • Planaarelektroforeesi läbiviimiseks kasutatakse peamiselt õhukesi geelikihte, kuid mõnikord ka paberit. • Kapillaarelektroforeesi korral kasutatakse ülipeeneid (läbimõõt mm-tes), vajaliku täidisega torusid, mida nimetatakse kapillaarideks.

6. Planaarelektroforees • PE plaat võib olla asetatud nii püsti kui pikali • Plaadi vastasservad on ühendatud elektroodi-dega, mis tekitavad plaadis proovi lahuta-miseks vajaliku elektrivälja • Plaadi ühe elektroodi (harilikult katoodi) poolses otsas on proovi-lahuse jaoks süvikud • Peale proovi sisestamist lülitatakse sisse alalisvool ja proov lahutub vastavalt selle komponentide liikumiskiirusele • Peale proovi lahutamist saab proovi ilmutada tindiga või vaadata eeltöödeldud proovi UV-lambi abil • Harilikult võrreldakse proovi teadaolevate näidistega või uuritakse andmebaase • Proovi saab vajadusel välja lõigata ja edasi uurida/töödelda

7. Kapillaarelektroforees Kapillaar aeg Detektor Proovilahus • Kapilaarkolonn on mõlemat otsa pidi puhveralhustes, mis sisaldavad ka elektroode • Ühest ostast sisestatakse proovilahus kas rõhu muutuse abil või elektivälja toimel • Proov lahutatakse kapillaris vastavalt komponentide liikumiskiirusele elektriväljas - + + Kõrgepinge allikas Kogumisanum puhverlahusega Lähteanum puhverlahusega • Kapillari väljundotsa lähedale on paigal-datud detektor, mis mõõdab kapillari läbivad ained • Tulemusena saadakse elektrofero-gramm, milles iga piigi pindala on võrdeline antud aine kogusega proovis

8. Elektroforeesi meetodid • Erinevate lahutusmeetodite järgi jaotatakse elektroforees • Tsoonelektroforees (ZE) • Geelelektroforees (GE) • Isoelektriline fokusseerimine (IEP) • Isotahhoforees (ITP) • Kõiki meetodeid on võimalik kasutada nii SEP kui CEP korral.

9. Tsoonelektroforees (ZE) Puhver B- A- C- Katood Anood - + • Antud meetodi korral on puhverlahuse koostis kogu lahutusalas ühesugune • Jaotumine toimub nii EP kui EO tulemusel • Meetod on eelkõige sobilik väiksemate ioonide lahutamiseks: atomaarsed ioonid (Cl-, Mg+), väiksemad anorgaanilised (NO3-, NH4+) ja orgaanilised (suhkrud, aminohapped) molekulaarioonid.

10. Isotahhoforees (ITP) Kõrge liikuvusega puhver Madala liikuvusega puhver B- A- C- Katood Anood - + • Antud meetodis valitakse kaks erinevat puhver-lahust nii, et lähtepuhverlahuse ioonide liikuvus oleks väiksem kui lõpp-puhverlahuse ioonide liikuvus ning kõigi uuritavas aines sisalduvate ioonide liikuvuste väärtused on nende kahe vahel. • Rakendades elektrivälja hakkavad kõik ioonid liikuma vastavalt nende liikumiskiirusele (n= meoE). • Lahuses tekkiva potentsiaalivälja tõttu järjestuvad selles olevad ioonid vastavalt nende liikuvustele. • Peale järjestumist on kõigi ainete liikumiskiirus antud meedodi korral sama.

11. Isoelektriline fokusseerimine (IEF) Pidev pH gradient Kõrge pH Madal pH B- A- C- Katood Anood OH- - H+ + • Antud meetodi korral koosneb lähtepuhverlahus lahustist ja erinevatest ainetest – amfolüütidest – millel on nii katioonsed kui anioonsed omadused. • Ka proovid on amfolüüdid, tavaliselt valgud või DNA, RNA • Elektrivälja mõjul tekib puhverlahusest erinevate pH väärtustega gradient • Proovi komponendid liiguvad sellise pH juurde, kus nende summarne ioonne laeng on neutraalne (oma pI ehk isoelektrilise punkti pH väärtuse juurde)

12. Geelelektroforees (GE) • Antud meetodi korral on lahutuskeskkonnaks geel • Geeli poorse struktuuri moodustavad polümeersed ühendid (näiteks polüakrüülamiid või agaroos). • Poorimaatriksis olevas puhverlahuses toimub EF. • Antud meetodi korral on ainete lahutamise peamiseks mõjutajaks nende massi ja laengu suhe m/z, kuna peamine takistus liikumisel on poorimaatriks. • Kui ainele ja puhvrile lisatakse SDSi (naatrium-dodetsüülsulfaati) muudab see ainete laengu korreleeruvaks nende suurusega ja denatureerib uuritava aine. Tulemuseks on otseselt massist sõltuv ainete järjestumineelektroforeesi tulemu-sena. SDS PAGE on kõige laiemalt bioloogiliste proovide jaoks kasutatav EF meetod.

13. GE ja IEF 1. IEF • Bioloogiliste proovide korral kasutataakse SDS PAGE tihti koos järgneva või eelenva IEFga (mis on samuti geelis läbi viidud). • Esimese mõõtmise tulemusel geelis tekkinud aineterida asetatakse teise geeliplaadi algusesse esialgse lahutusega ristiolevas suunas • Sellisel juhul saadakse lahutus nii ainete massi kui pI järgi. 2. GE pI M

14. Detektorid • Planaarse elektroforeesi korral tavaliselt proov ilmutatakse erinevate tintidega või markeeritakse (eelenevalt) fluorestseeruvate markeritega UV-lambi all vaatamiseks • Teiste võimalustena on kasutusel • Spektroskoopilised meetodid • Massispektromeetria • Elektrokeemilised meetodid • Radiomeetria • Määramispiirid on väga madalad: määratav kogus on vahemikus 10-13...10-20 mooli.

15. Kasutusvaldkonnad • Tänapäeval on elektroforees väga levinud just suuremate proovimolekulide analüüsimeetodina bioloogias, meditsiinis ja farmakoloogias. • Tüüpiline on valkude ja DNA ning RNA analüüs. • Eelkõige on kasutusel planaarne GE (eriti SDS PAGE) ja (geel)ITP kombineerituna erinevate eel- ja järeltöötlustega ning omavahel. • EP abil saab eristada ka näiteks omavahel ainult ühe aminohappe või nukleotiidi võrra erinevaid valke või polünukleotiide

16. Massispektromeetria (MS) • Ainete määramine nende molekulidest tekitatud ioonide m/z väärtuste abil • m – iooni mass • z – iooni laeng • Spektromeetria on tulnud sõnadest specere (L) – vaatama, nägema ja metrum (L), metron (K) – mõõtma. Algselt mõeldi sp. all nähtava valguse spektri mõõtmist. Tänapäeval on spektromeetria mõiste laienenud kogu elektromagnetlainete skaala ulatusele ning hõlmab endas ka teisi skaalasid, nagu näiteks helilained ja massi-laengu suhed.

17. Massispektromeetria lihtsustatud põhimõte • Analüüsimeetod, mille puhul: • Uuritavad molekulid (molekulmassiga M) aurustatakse • Need molekulid/aatomid ioniseeritakse • Tekivad ioonid M+, MH+ vms (molekulaarioonid) • Tekkinud ioonid on tihti kõrge energiaga ning fragmenteeruvad osaliselt, tekivad mitmesugused väiksema massiga ioonid (ja neutraalsed fragmendid) • Kõik ioonid suunatakse massianalüsaatorisse, mis registreerib nende masside ja laengute suhted m/z • Massispektromeeter registreerib ainult laetud osakesi.

18. Massispektromeeter Proovisisestussüsteem • Massispektromeetria etapid: • Gaasifaasiliste ioonide genereerimine ja nende kiirendamine elektriväljas. • Ioonide eraldamine nende massi ja laengu suhte alusel elektri- ja/või magnetväljas. • Kindla massi ja laengu suhtega ioonide detekteerimine seadmega, mis on võimeline registreerima selleni jõudnud osakeste arvu. • Tulemus: massispekter. Ionisatsiooniallikas Ioonid Massianalüsaator(id) Ioonid Vaakum Detektor Massispekter

19. Ioonide tekitamine • Gaasifaasist • EI (electron ionization) – levinuim gaasikromatograafi MS detektorite (GC-MS) korral. • CI (chemical ionization) • Vedelast faasist • ESI (electrospray ionization) – levinuim vedelikkromatograafi MS detektorite (LC-MS) korral. • APCI (atmospheric pressure chemical ionization) • Tahkest faasist • MALDI (matrix assisted laser desorption/ionization) – põhiliselt biokeemia rakendustes.

20. Elektronionisatsioon • Kõige levinum ioonide tekitamise meetod on elektronionisatsioon (EI), mille puhul uuritavaid molekule pommitatakse elektronidega. • Elektronid “löövad molekulist välja” ühe elektroni ja seeläbi omandab molekul positiivse laengu. M + e– M•+ + 2e– • Tekkinud radikaaliooni nimetatakse molekulaariooniks. • Osakese liigse energia või ebapüsivuse tõttu võib see laguneda – fragmenteeruda: M•+  E+ + R• M•+  O•+ + N

21. Pihustus-gaas N2 HPLC sisend Pihusti Pinge ~3500V + + Massi-spektro-meetrisse + + + + + + + + + + + + + kuum N2 Jäägid Elektropihustus-ionisatsioon (ESI) • Ioonid tekivad vahetult lahuses elektrivälja toimel ja “aurustuvad” sealt välja • Enamasti protoneerumine: M + H+ MH+ • Aurustumine tagatakse lahuse pihustamisega peeneteks tilkadeks • Ioonid juhitakse massi-spektromeetri sisendisse elektrivälja abil • ESI-MS on levinud detektor LC jaoks

22. ESI Massispekter EI massispekter Molekulaarioon • Ionisatsioon on väga pehme – ei tekita fragmente. • Iseloomulik onlisandioonide ja mitmelaenguliste ioonide teke. • Ionisatsioon tekitab fragmente. • Iseloomulik on ühelaenguliste ioonide teke.

23. MALDI • Matrix-assisted laser desorption/ionization. • Analüüsitav proov segatakse maatriksiga ja aurutataksekuivaks. • Kui sellisele proovile suunata laserkiir (Nd:YAG), siis maatriks aurustub koos analüüdiga. Tekivad analüüdi ioonid. • Maatriks peab neelama (elektromagnetkiirgust) kasutatava laseri sagedusel ja analüüt ei tohi sellel sagedusel kiirgust neelata. • Väga pehme – väga vähe fragmente. • Põhiliselt annab ühelaengulisi ioone.

24. Molekul-mass 106 ESI 105 104 MALDI 103 EI 102 Polaarsus Apolaarne Keskm. polaarne Polaarne Iooniline EI, ESI ja MALDI

25. Massianalüsaatorid • Kõik massianalüsaatorid lahutavad ioone kas elektrivälja ja/või magnetvälja mõjul muutes nende liikumise suunda (ja kiirust). • Ioone liigutatakse vastavalt • vastasmärgiliste laengute tõmbumise põhimõttele • liikuvale laetud osakesele mõjuva magnetvälja toimele • Mida väiksem on iooni mass, seda suurem on sama tugevusega välja mõju antud iooni kiirusele sama laengu korral. • Kindla elektri- ja/või magnetvälja tugevuse korral jõuavad detektorisse ainult kindla m/z-ga ioonid (v.a. TOF). • Kõik massianalüsaatorid töötavad sügava vaakumi tingimustes (10-6...-7 atm).

26. Massianalüsaatorid • Magnetiline ja elektrostaatiline sektor • Enamasti mõlemad koos – topeltfokusseeriv MS • Klassikaline MS, põhimõtted küllalt lihtsad. • Kõrge lahutusvõimega. • Kvadrupool ja ioonlõks • Kasutatakse kromatograafias detektoritena. • Lennuaja (TOF) MS ja Orbitrap • Põhiliselt proteoomika rakendused. • Ioontsüklotronresonants-MS • Kõige kõrgema lahutusvõimega.

27. Massianalüsaatorid Katood, U = 1...10 kV Anood, U = 0 V 2 Proovi kiirendatakse elektrivälja impulsi abil • Lennuaja MS (time-of-flight, TOF) Lahutusala Detektor Signaal 3 proov lahutub saadud kiirenduse mõjul vastavalt m/z suhtele: mida väiksem mass, seeda suurem on saavutatud kiirus (antud laengu korral) 4 Ühesuguse massiga ioonid jõuavad detektorini üheaegselt ja nende hulk on vastavuses mõõdetava signaali intensiivusega 1 Proov ioniseeritakse, saadakse M+ ioonid MALDI-TOF on kõige levinum MS meetod bioloogiliste proovide uurimisel

28. MS: Võtmeaspektid • Meetodi avastamispiir on väga madal • Selektiivsus: erinev kõrge lahutusega (HR) ja madala lahutusega (LR) MS korral • LR-MS • sama nominaalse m/z väärtusega ioonide jooned on täielikult kattunud • Seetõttu on LR massispektromeetria enamasti kasutusel nii, et segudest on puhtad ained eelnevalt eraldatud: enamasti gaasikromatograafiliselt või vedelik-kromatograafiliselt • HR-MS • Sama nominaalse m/z väärtusega ioonide jooned on eristatavad

29. HR Massispekter • Kõigi spektrilõigul nähtavate ioonide nominaalne m/z on 279!

30. Brutovalem täpsest massist • Kui massispektromeeter on piisavalt suure lahutusega, siis võib täpne m/z anda peaaegu ühese brutovalemi. • Näide: nominaalsele massile 60 vastavad järgmised brutovalemid: C2H4O2, CH4N2O, C3H8O, C2H8N2. Kui oleks teada täpne mass 60.02, siis sellele vastab C2H4O2 • NB! Aine ei pruugi olla identifitseeritud isegi kui brutovalem on üheselt teada! Samale brutovalemile võib vastata palju ühendeid.

31. Võtmeaspektid • Massispektri annavad põhimõtteliselt kõik ained • Puhaste ainete massispektrid on sageli küllaltki karakteristlikud ja sobivad seetõttu hästi ainete identifitseerimiseks • Ainete massispektritest on koostatud suuri andmebaase, mis on lisatud analüüsiaparaatide tarkvarale, ning millest tarkvara abil saab tundmatuid aineid otsida • Mõned ained siiski ei anna (elektron-ionisatsiooniga) karakteristlikke massispektreid, kuna fragmenteeruvad väga ulatuslikult

32. Võtmeaspektid • Meetodi puudused: • Aparatuur on kallis • Aparatuur on õrn ja kapriisne, oskamatul käsitsemisel võib kergesti rikki minna • Aparatuur vajab asjatundlikku hooldust

33. Massispektromeeter kromatograafias • Detektorina kromatograafilises süsteemis omab massispektromeeter eeliseid: • Kvalitatiivne info • identifitseerimine (andmebaasid) • kinnitus, et piik kuulub analüüdile • Kvantitatiivne • analüüs ainult ühe kindla massi alusel (SIC, EIC) • Selektiivne detektor – võimaldab analüüsi teostada ka siis kui ainete piigid on kromatograafiliselt lahutumata. • Mass-kromatogramm sisaldab kolmemõõtmelist informatsiooni: aeg, m/z ja intensiivsus.

34. Massispektromeeter kromatograafias • GC-MS – gaasikromatograafia detektorina on massispektromeeter juba ammu rutiinkasutuses. • Kandegaasi hulk on väike, kuna kasutatakse kapillaarkolonne. • LC-MS – uus meetod. • Analüüsitavate ainete eraldamine eluendist on probleem, sest vedel keskkond ei sobi vaakumisse • Liides (ESI, APCI), mis tagab analüüdi jõudmise massispektromeetrisse ilma eluendita, on jõudnud piisavale tehnilisele tasemele alles viimase 15 aasta jooksul.

35. Kirjandus • PRINCIPLES OF INSTRUMENTAL ANALYSIS Skoog D.A., Leary J.J. Fourth edition, Saunders College 1992 Skoog D.A., Holler F.J., Nieman T.A. Fifth edition, Harcourt Brace 1998 • PRINCIPLES OF BIOCHEMISTRY Lehinger A.L., Nelson D.L., Cox M.M. Second edition, Worth Publishers 1993 • Analüütilise keemia loengumaterjalid: http://tera.chem.ut.ee/~ivo/ak1/ak1_ms.pdf http://tera.chem.ut.ee/~ivo/ak2/ak2_ms.pdf