第七章 白细胞血型
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第七章 白细胞血型. 【 目的要求 】 1. 掌握 HLA 的基因定位及 HLA 区的结构、 HLA 遗传特征、 HLA 命名原则 2. 熟悉 HLA 的分型方法及判型、 HLA 抗原的结 构 3. 了解 HLA 抗原分子的组织分布特征. 第一节 概 述. MHC 是表达于脊椎动物有核细胞表面的一类高度多态、紧密连锁的基因群,因其编码的蛋白质产物 —— 主要组织相容性抗原在组织相容性的决定中起主要作用而得名。小鼠的 MHC 称为 H-2 系统,.

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第七章 白细胞血型

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第七章 白细胞血型

【目的要求】

1.掌握 HLA的基因定位及HLA区的结构、HLA

遗传特征、HLA命名原则

2.熟悉 HLA的分型方法及判型、HLA抗原的结

3.了解 HLA抗原分子的组织分布特征


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第一节 概 述

MHC是表达于脊椎动物有核细胞表面的一类高度多态、紧密连锁的基因群,因其编码的蛋白质产物——主要组织相容性抗原在组织相容性的决定中起主要作用而得名。小鼠的MHC称为H-2系统,


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人的MHC称为人类白细胞抗原系统 (HLA系统),是人类基因组中最复杂、多态性最高的遗传体系。其主要功能为参与自我识别、调节免疫反应和对异体移植的排斥作用。


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定位于动物与人某对染色体的特定区域,呈高度多态性。MHC的编码产物即MHC分子或MHC抗原,其表达于不同细胞表面,主要功能是参与抗原递呈、制约细胞间相互识别及诱导免疫应答。

“组织相容性抗原”:诱发移植排斥反应的抗原被称为移植抗原或组织相容性抗原,其中可诱导迅速而强烈排斥反应者被称为主要组织相容性抗原。


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HLA研究简史

1958年 Dausset发现HLA-A2抗原,标志着

HLA研究的开始

1962年 Van Rood发现了4a,4b双等位基因

开辟了白细胞分型的道路

1964年 召开第一届国际组织相容性研讨会

揭开了HLA研究国际大协作的序幕

1965年 确定了HLA是人类主要组织相容性

抗原

1974年 证实了HLA系统位于人类第6号染色

体上

1999年 人类基因组计划将HLA编码基因全

部解密


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HLA系统的结构与组成

1999年10月,HLA的全基因组DNA序列被测定公布。

HLA系统位于人类第6染色体短臂(6p21.31),全长3600kb,包含128个功能基因和96个假基因,等位基因总数超过500多个。HLA复合体代表一组密切连锁的基因群,所有基因均为共显性。HLA复合体分为三个区域


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从着丝点一侧起依次为Ⅱ类基因、Ⅲ类基因和Ⅰ类基因区域所在


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H LA系统的基因座位(1997)

HLA I类区域 HLAⅡ类区域 HLAⅢ类区域

HLA-A HLA-DRA C2

HLA-B HLA-DRB1~ HLA-DRB9 Bf

HLA-C HLA-DQA1~HLA-DRA2 C4A

HLA-E HLA-DQB1~HLA-DQB3 C4B

HLA-F HLA-DPA1~HLA-DPA2 TNF

HLA-G HLA-DPB1~HLA-DPB2 LTA

HLA-H HLA-TAP1~HLA-TAP2 LTB

HLA-J HLA-DMB HLA-LMP2 HSP

HLA-K HLA-DMA HLA-LMP7

HLA-L HLA-DOB HLA-DOA


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HLA可分为三类:

I 类:

HLA-A、HLA-B、HLA-C经典基因

HLA-E、HLA-G、 HLA-F非经典基因

存在部位:I 类分子存在于几乎所有的有核细胞表面。

II 类:

基因包括3个亚区: HLA-DR、HLA-DQ和HLA-DP

HLA-DOB

HLA-DMA等基因

存在部位:II类分子主要存在于抗原呈递细胞如B细胞和巨噬细胞,树突状细胞和活化T细胞也表达II类分子。


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III类

基因位于II类基因和I类基因之间,

主要是与补体有关的C4A、C4B、Bf、C2等基因以及21-羟化酶(CYP21)基因、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)基因、热休克蛋白(heat shock protein,HSP70)基因和转录物基因B144、BAT1-T9、G1、G4、G6、G7、G8等。


Hla i

HLA-I类与Ⅱ类抗原结构及细胞分 布

(一) HLA-I抗原的结构

HLA-A、B、C抗原是由第6号染色体相应Ⅰ类基因编码的α链(44kD)与第15号染色体编码的β2微球蛋白(β2 microglobulin,β2m,12kD)非共价结合的糖蛋白。α链由胞外区、跨膜区和胞内区组成。胞外区可进一步分为α1、α2和α3 三个功能区。


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 跨膜区含疏水性氨基酸,排列成α螺旋,跨越脂质双分子层。胞内的氨基酸被磷酰化后有利于细胞外信息向胞内传递。β2m无同种特异性,与α3功能区连接,其功能为有助于Ⅰ类抗原的表达和稳定性


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Ⅰ类抗原分子顶部α1和α2区组成的抗原肽结合区呈沟槽状结构,α1和α2区各含4股β片层和1个α螺旋,可容纳8~12个氨基酸残基组成的短肽。

沟槽内氨基酸变化大,是Ⅰ类抗原多态性的基础。α3与β2m具有Ig恒定区样结构。α3为T细胞CD8分子的识别部位。


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(二)HLAⅡ类抗原的结构

HLA-DP、DQ、DR等Ⅱ类抗原是由Ⅱ类基因编码的α链(34kD)和β链(29kD)非共价连接的糖蛋白。α链和β链,均由胞外区、跨膜区和胞内区组成。胞外区各含两个功能区α1、α2和β1、β2 。


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α1和β1区各自盘绕成一个α螺旋和β片层构成沟槽的一个侧壁和半个底面。沟槽与多肽结合的特点基本上与Ⅰ类抗原相似,但被结合的多肽一般来自外源性抗原经加工处理降解的产物。α2、β2区靠近细胞膜,具有Ig样结构


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(三) HLA -Ⅰ、 II类分子的分布

HLA -Ⅰ类分子主要分布于机体所有有核细胞表面(包括血小板和网织红细胞),以淋巴细胞表面Ⅰ类分子的密度最大,其次为肾、肝及心脏,密度最低的为肌肉和神经组织。

HLA -Ⅱ类分子仅表达于专职抗原递呈细胞(B细胞、巨噬细胞、树突状细胞、郎格汉斯细胞)以及活化的T细胞和胸腺上皮细胞等表面 。


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第二节 HLA命名

命名原则:

1.每一种因子前冠以HLA,后用英文大写字母表示基因座,如HLA-A,B

2.用阿拉伯数字代表特异性,如HLA-A1,HLA-B8

3.凡数字前加“W”符号的表示未确定的抗原,经WHO认可后即可取消“W”符号

4.HLA基因以4位数字表示,前2位数字表示最相近的特异性,后2位数字表示亚型特异性。如编码A1抗原的两个等位基因分别是A※0101与A※0102


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5. 第五位数字代表核苷酸的碱基取代,称为“沉默取代”,不影响其编码的氨基酸序列。

如A※31011与A※31012的DNA序列虽然不同,但A31抗原氨基酸序列不受影响

6. 第6、7位数字代表相应启动子序列的多态性

7. 数字末尾加N表示无效基因


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第三节:HLA遗传

一.HLA基因定位与基因结构

HLA结构十分复杂,其多样性由多基因性和多态性两方面构成.

多基因性指复合体由多个位置相邻的基因座位所组成,编码产物具有相同或相似的功能.

根据结构和功能,组成HLA的基因

传统分为三类: HLA-I 、II、Ⅲ类

新分类:经典的HLA I类和II类基因

免疫功能相关基因


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1.经典的HLA-Ⅰ类基因 包括HLA-B、-C、-A,它们具有多态性, 编码HLA-Ⅰ类分子,主要生物学功能是参与递呈内源性抗原

2. 经典的HLA-Ⅱ类基因 包括HLA-DP、-DQ和-DR,它们也具有高度多态性,编码HLA- Ⅱ类分子,主要生物学功能是递呈外源性抗原


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HLA复合体Ⅰ类和Ⅱ类基因区内的基 因 名 称


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二.HLA遗传特征

(一)单倍型遗传

连锁在一条染色体上的HLA各位点的基因组合称为HLA单倍型(HLA haplotype)。

两个同源单倍型构成HLA的基因型(HLA genotype)。由于一条染色体上HLA各位点之间距离非常近,很少发生同源染色体间的交换。


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当亲代的遗传信息传给子代时,HLA单倍型作为一个单位遗传给下一代。因此,子女的HLA基因型中,一个单倍型与父亲相同,另一个与母亲相同。


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例如

父亲的HLA单倍型为a和b,母亲的是c和d,则其子女可出现ac、bc、ad和bd 4种单倍型组合。这样,亲代与子代间有一个单倍型是相同的。

同胞间,HLA单倍型完全相同的机率为25%,完全不相同的机率亦为25%,一个单倍型相同的机率为50%。


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 因此,从家庭内寻找器官移植的供者,其供、受者HLA抗原型别相同的机率比在无血缘关系的供、受者中高得多。


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(二)共显性遗传

HLA复合体为共显性遗传,即每对等位基因都能编码抗原,共同表达于细胞膜上,而不形成ABO血型系统中的隐性基因及免疫球蛋白基因中的等位基因排斥现象,这就大大增加了HLA抗原系统的复杂性和多态性。


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(三)HLA的多态性

多态性:指一个基因座位上存在多个等位基因。

对同一个体而言,染色体上任一基因座位只能有两个等位基因,分别来自父、母的同源染色体。

HLA的多态性是一个群体概念,指群体中不同个体在等位基因拥有状态上存在差别 。


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HLA多态性的产生机制:

1.复等位基因 (multiple allele) 在群体中,位于同一基因座的不同基因系列即为复等位基因。 HLA复合体的多数基因座均有复等位基因。

2.共显性(co-dominant)表达 共显性即两条染色体同一基因座每一等位基因均为显性基因,均能编码特异性抗原。


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HLA多态性的意义:

1.赋予种群适应多变的环境条件

2.实现对机体免疫应答的遗传控制

3.使HLA成为个体的终身遗传标志

4.增加了寻找合适同种器官移植供者的难


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(四)连锁不平衡

单倍型基因非随机分布的现象称为连锁不平衡(linkage disequilibrium)。如某些基因(A1与B8)经常在一起出现,其单倍型频率比理论值高,而另一些基因又较少出现。连锁不平衡产生原因尚不清楚。有人认为,连锁不平衡与某些疾病的发生有关。


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第四节.HLA的交叉反应

交叉反应:HLA抗体不仅针对刺激其产生的抗

原,有时也针对相关的抗原,这种

现象称为交叉反应。

表 现:一种抗血清可以与多种抗原反应,

或一种特异性抗原可以与多种抗

体反应。


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原因:

1.HLA抗血清是多价抗血清,含有多种抗体

2.HLA由同一分子上一定数量高度相关的抗原因子组成,这些抗原因子具有不同的抗原性或免疫原性。

3.HLA的交叉反应可能是由复合抗原或复合抗体引起


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第五节 HLA分型

传统的血清学分型和细胞学分型技术主要侧重于HLA抗原特异性的分型,80年代建立的DNA分型技术则侧重于基因分析。


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(一)血清学分型技术

1. HLAⅠ类抗原的检测

HLA-A、B、C抗原型别鉴定均使用补体依赖的细胞毒试验(complement dependent cytotoxicity,CDC)。


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基本原理:

  标准分型血清中含有针对某种抗原特异性的细胞毒抗体,可与待测细胞表面相应HLA抗原结合,可以激活加入的补体,使细胞损伤或死亡。利用染料排斥试验判断受检细胞,受损或死亡细胞被染色为细胞毒阳性。细胞毒阳性细胞的HLA抗原型别与标准分型血清所针对的抗原相当。


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2. HLA-DQ、DR抗原的检测

该两抗原的检测方法同HLAⅠ类抗原,但所用的抗血清必须经过吸收(通常用多个个体的血小板来吸收)以除去其中的抗Ⅰ类抗原的抗体,待测细胞须用经过纯化的B细胞。


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标准分型血清多取自经产妇、计划免疫志愿者,或制备的HLA单克隆抗体。血清学分型是一项古老的技术,尽管近年来已建立许多新的技术,但它仍是目前HLA分型的基本方法。


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(二)细胞学分型技术

HLA-DP抗原特异性可应用纯合子分型细胞(homozygous typing cell,HTC)和预致敏淋巴细胞试验(primed lymphocyte test,PLT)检测。

两种方法的原理均是通过混合淋巴细胞培

养试验判断淋巴细胞在识别非己HLA抗原

后发生的增殖反应。由于分型细胞来源困

难以及实验方法繁琐,细胞学分型技术正

逐渐被淘汰。


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(三)DNA分型技术

1. RFLP技术

即限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism,RFLP)分析技术,其基本原理是,个体间抗原特异性来自氨基酸顺序的差别,后者由编码基因的碱基顺序不同所决定。

此种碱基顺序的差别造成限制性内切酶识别位置及酶切位点数目的不同,从而产生数量和长度不一的DNA酶切片段。经电泳、转膜后,用标记的特异cDNA探针与之杂交,经放射自显影显示出不同长度的杂交条带。根据杂交条带的格局来判定HLA的型别


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将聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)与RFLP结合起来,可明显提高其灵敏度。由于本法仅能反映某限制性内切酶位点的改变,故有一定的局限性。


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94℃变性

50-65℃退火

XX℃延伸


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标准的PCR反应体系

4种dNTP混合物 各200umol/L

引物        各10~100pmol

模板DNA 0.1~2ug

Taq DNA聚合酶 2.5u

Mg2+ 1.5mmol/L

PCR的基本原理

  • PCR反应条件

  • PCR过程

  • PCR的特点


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1

2

3

高温变性

低温退火

适温延伸

94

温度

(℃)

72

55

22

1

2

3

4

5

时间(min)

  • PCR反应条件

  • PCR过程

  • PCR的特点

PCR的基本原理

重复1~3步

25~30轮

DNA变性

形成2条单链

目的DNA片段

扩增100万倍以上

子链延伸

DNA加倍

DNA单链

与引物复性

DNA双螺旋


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95℃

1

2

3

高温变性

低温退火

适温延伸

重复1~3步

25~30轮

94

温度

DNA变性

形成2条单链

目的DNA片段

扩增100万倍以上

(℃)

72

子链延伸

DNA加倍

55

DNA单链

与引物复性

22

DNA双螺旋

1

2

3

4

5

时间(min)

PCR的基本原理

  • PCR反应条件

  • PCR过程

  • PCR的特点

模板DNA


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95℃

DNA引物

50℃

PCR的基本原理

  • PCR反应条件

  • PCR过程

  • PCR的特点

引物1

引物2


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DNA引物

50℃

72℃

PCR的基本原理

  • PCR反应条件

  • PCR过程

  • PCR的特点

Taq酶

引物1

引物2

Taq酶


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95℃

72℃

PCR的基本原理

  • PCR反应条件

  • PCR过程

  • PCR的特点

第1轮结束

第2轮开始


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95℃

50℃

72℃

PCR的基本原理

Taq

  • PCR反应条件

  • PCR过程

  • PCR的特点

Taq

Taq

Taq


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95℃

50℃

72℃

PCR的基本原理

Taq

  • PCR反应条件

  • PCR过程

  • PCR的特点

Taq

Taq

Taq


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模板DNA

PCR的基本原理

第1轮扩增

第2轮扩增

  • PCR反应条件

  • PCR过程

  • PCR的特点

第3轮扩增

第4轮扩增

第5轮扩增

第6轮扩增


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恶性肿瘤(癌基因或抑癌基因)

PCR-RFLP法:

Ras基因

限制性内切酶


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突变

限制性内切酶


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正常

突变

电泳


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2. PCR/SSO技术

用人工合成的HLA型别特异的寡核苷酸序列作为探针,与待检细胞经PCR扩增的HLA基因片段杂交,从而确定HLA型别,PCR技术可将HLA复合体上指定基因片段特异性地扩增5~6个数量级;而专门设计的SSO(序列特异的寡核苷酸sequencedpecific oligonucleotide)探针又能探测出等位基因间1~2个核苷酸的差异,故PCR/SSO技术具有灵敏度高、特异性强、需样本量少等优点。


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3. PCR/SSP技术

该法的特点是设计一组顺序特异性引物(sequence specific primer SSP),经PCR 扩增获得不同型别的HLA特异扩增产物,可通过电泳法直接分析带型来判定HLA型别

目前,DNA分型法主要用于HLAⅡ类基因的分型,并有可能在不久的将来取代血清学方法。


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PCR-SSP

引物特异性

1 2 3 4 5 6 7 8

PCR

1 2 3 4 5 6 7 8


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4、PCR/SSCP技术

即聚合酶链式反应-单链构象多态性技术。

原理:在不含变性剂的中性聚丙烯酰胺凝

胶中,单链DNA形成一定空间结

构,具有一定的构象。相同长度的

单链DNA因其序列不同,甚至单个

碱基不同,所形成的构象不同,电

泳时泳动速度不同。PCR扩增产物

经变性后进行非变性凝胶电泳,靶

DNA中碱基序列的差异出现泳动速

度的差别,通过放射自显影或银染

色来进行分析


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第六节 HLA的群体分布

不同人种与同一人种不同群体间HLA的分布

有差异。A34、A36、B42抗原多见于黑种人,

被称为“黑种人抗原”;B41主要见于白种人;

B45、B54主要见于东方人,被成为“黄种人抗

原”


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第七节 HLA在医学上的意义

一.亲子鉴定

人类白细胞血型系统被用于亲子鉴定的原因

是:

1.高度多态性;

2.抗原频率很低;

3.出生时抗原已完全发育,且终身不变

4.按孟德尔定律遗传


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案例一:被控父亲不能给必需单倍型被否定为生

母亲的 孩子的 被控父亲的

表现型 表现型 表现型

A1,A2 A1,A32A 1,A24

B5,B17 B15,B17 B8,B35


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案例二:被控父亲能给必需单倍型不能否定

为生父

母亲的 孩子的 被控父亲的

表现型 表现型 表现型

A1,A3 A1,A11A2,A11

B7,B35 B7,B27 B7,B27


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父’ 父 子 母


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二.个体识别

应用于血痕及体液的个人识别。用的是淋巴细胞抑制试验,这种方法比较麻烦,还

不能用于检测陈旧及微量生物斑痕。


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现 嫌1 嫌2 嫌3


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三、HLA与疾病的关联

很多自身免疫性疾病的发生都与遗传有关。

迄今已发现70多种疾病与HLA基因多态性相关联,其中大多数的自身免疫性疾病与HLA II类基因关联,

1、 携带HLA-DR4的人罹患类风湿关节炎的风险比正常人高6倍;

2、I型糖尿病(胰岛素依赖性糖尿病)携带HLA-DR3和-DR4基因的白人发病率是正常人的20倍。


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HLA与疾病的关联

疾病 HLA抗原 相对风险比

强直性脊柱炎 B27 87.4 Reiter病 B27 37.0急性前葡萄膜炎 B27 10.4亚急性甲状腺炎 B35 13.7寻常牛皮癣 Cw6 13.3疱疹样皮炎 DR3 15.4乳糜尿 DR3 10.8特发性膜性肾病 DR3 12.0


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三、HLA配型与器官移植

人体遗传差异并非都对导致组织不相容性有同等重要的作用,最有意义的是ABO血型抗原和HLA抗原。主要组织相容性抗原不合是引起排斥反应的主要抗原。

通过组织配型(tissue matching),可以尽可能降低供者与受者间组织不相容性。组织配型的原则是使供者与受者的ABO血型抗原和HLA抗原相同,或者供者没有受者所缺的抗原,此时受者的免疫系统并无“非己”抗原所识别,构成了组织相容性移植物即可存活。


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HLA配型:

在同一条染色体上HLA诸座位等位基因的组成称为单体型(haplotype)。由于各位点紧密连锁,所以在遗传时,单体型总是作为一个“单位”传给下一代。


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进行HLA配型时应使供者和受者有尽可能多的HLA抗原相同。子女总是得到一条父亲的单体型和一条母亲的单体型。所以父子(女),或母子(女)之间必有一条相同的单体型,即HLA半相同。同胞之间可分为HLA相同、HLA半相同和HLA不相同三种情况。

在肾移植中,HLA各基因座配合的重要性依次为:

HLA-DR、HLA-B、HLA-A。


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亲属活体肾移植

同卵双生同胞间移植→ HLA相同的同胞→ 次选HLA半相同的同胞或亲代。

对于移植器官应选择有尽可能多的相同抗原的供者。

在骨髓移植时,不仅受者免疫系统会识别骨髓移植物为“非己”,骨髓移植物也会识别受者细胞为“非己”,只有供者、受者间HLA完全相同的情况下才容易获得成功。

因此,为了精确快速地进行组织配型,保证器官移植的成功,首先必须对供者和候选受者进行HLA基因分型。


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第七章 白细胞血型

【目的要求】

1.掌握 HLA的基因定位及HLA区的结构、HLA

遗传特征、HLA命名原则

2.熟悉 HLA的分型方法及判型、HLA抗原的结

3.了解 HLA抗原分子的组织分布特征


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第一节 概 述

MHC是表达于脊椎动物有核细胞表面的一类高度多态、紧密连锁的基因群,因其编码的蛋白质产物——主要组织相容性抗原在组织相容性的决定中起主要作用而得名。小鼠的MHC称为H-2系统,


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人的MHC称为人类白细胞抗原系统 (HLA系统),是人类基因组中最复杂、多态性最高的遗传体系。其主要功能为参与自我识别、调节免疫反应和对异体移植的排斥作用。


5143616

定位于动物与人某对染色体的特定区域,呈高度多态性。MHC的编码产物即MHC分子或MHC抗原,其表达于不同细胞表面,主要功能是参与抗原递呈、制约细胞间相互识别及诱导免疫应答。

“组织相容性抗原”:诱发移植排斥反应的抗原被称为移植抗原或组织相容性抗原,其中可诱导迅速而强烈排斥反应者被称为主要组织相容性抗原。


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HLA研究简史

1958年 Dausset发现HLA-A2抗原,标志着

HLA研究的开始

1962年 Van Rood发现了4a,4b双等位基因

开辟了白细胞分型的道路

1964年 召开第一届国际组织相容性研讨会

揭开了HLA研究国际大协作的序幕

1965年 确定了HLA是人类主要组织相容性

抗原

1974年 证实了HLA系统位于人类第6号染色

体上

1999年 人类基因组计划将HLA编码基因全

部解密


5143616

HLA系统的结构与组成

1999年10月,HLA的全基因组DNA序列被测定公布。

HLA系统位于人类第6染色体短臂(6p21.31),全长3600kb,包含128个功能基因和96个假基因,等位基因总数超过500多个。HLA复合体代表一组密切连锁的基因群,所有基因均为共显性。HLA复合体分为三个区域


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从着丝点一侧起依次为Ⅱ类基因、Ⅲ类基因和Ⅰ类基因区域所在


5143616

H LA系统的基因座位(1997)

HLA I类区域 HLAⅡ类区域 HLAⅢ类区域

HLA-A HLA-DRA C2

HLA-B HLA-DRB1~ HLA-DRB9 Bf

HLA-C HLA-DQA1~HLA-DRA2 C4A

HLA-E HLA-DQB1~HLA-DQB3 C4B

HLA-F HLA-DPA1~HLA-DPA2 TNF

HLA-G HLA-DPB1~HLA-DPB2 LTA

HLA-H HLA-TAP1~HLA-TAP2 LTB

HLA-J HLA-DMB HLA-LMP2 HSP

HLA-K HLA-DMA HLA-LMP7

HLA-L HLA-DOB HLA-DOA


5143616

HLA可分为三类:

I 类:

HLA-A、HLA-B、HLA-C经典基因

HLA-E、HLA-G、 HLA-F非经典基因

存在部位:I 类分子存在于几乎所有的有核细胞表面。

II 类:

基因包括3个亚区: HLA-DR、HLA-DQ和HLA-DP

HLA-DOB

HLA-DMA等基因

存在部位:II类分子主要存在于抗原呈递细胞如B细胞和巨噬细胞,树突状细胞和活化T细胞也表达II类分子。


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III类

基因位于II类基因和I类基因之间,

主要是与补体有关的C4A、C4B、Bf、C2等基因以及21-羟化酶(CYP21)基因、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)基因、热休克蛋白(heat shock protein,HSP70)基因和转录物基因B144、BAT1-T9、G1、G4、G6、G7、G8等。


Hla i1

HLA-I类与Ⅱ类抗原结构及细胞分 布

(一) HLA-I抗原的结构

HLA-A、B、C抗原是由第6号染色体相应Ⅰ类基因编码的α链(44kD)与第15号染色体编码的β2微球蛋白(β2 microglobulin,β2m,12kD)非共价结合的糖蛋白。α链由胞外区、跨膜区和胞内区组成。胞外区可进一步分为α1、α2和α3 三个功能区。


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 跨膜区含疏水性氨基酸,排列成α螺旋,跨越脂质双分子层。胞内的氨基酸被磷酰化后有利于细胞外信息向胞内传递。β2m无同种特异性,与α3功能区连接,其功能为有助于Ⅰ类抗原的表达和稳定性


5143616

Ⅰ类抗原分子顶部α1和α2区组成的抗原肽结合区呈沟槽状结构,α1和α2区各含4股β片层和1个α螺旋,可容纳8~12个氨基酸残基组成的短肽。

沟槽内氨基酸变化大,是Ⅰ类抗原多态性的基础。α3与β2m具有Ig恒定区样结构。α3为T细胞CD8分子的识别部位。


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(二)HLAⅡ类抗原的结构

HLA-DP、DQ、DR等Ⅱ类抗原是由Ⅱ类基因编码的α链(34kD)和β链(29kD)非共价连接的糖蛋白。α链和β链,均由胞外区、跨膜区和胞内区组成。胞外区各含两个功能区α1、α2和β1、β2 。


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α1和β1区各自盘绕成一个α螺旋和β片层构成沟槽的一个侧壁和半个底面。沟槽与多肽结合的特点基本上与Ⅰ类抗原相似,但被结合的多肽一般来自外源性抗原经加工处理降解的产物。α2、β2区靠近细胞膜,具有Ig样结构


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(三) HLA -Ⅰ、 II类分子的分布

HLA -Ⅰ类分子主要分布于机体所有有核细胞表面(包括血小板和网织红细胞),以淋巴细胞表面Ⅰ类分子的密度最大,其次为肾、肝及心脏,密度最低的为肌肉和神经组织。

HLA -Ⅱ类分子仅表达于专职抗原递呈细胞(B细胞、巨噬细胞、树突状细胞、郎格汉斯细胞)以及活化的T细胞和胸腺上皮细胞等表面 。


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第二节 HLA命名

命名原则:

1.每一种因子前冠以HLA,后用英文大写字母表示基因座,如HLA-A,B

2.用阿拉伯数字代表特异性,如HLA-A1,HLA-B8

3.凡数字前加“W”符号的表示未确定的抗原,经WHO认可后即可取消“W”符号

4.HLA基因以4位数字表示,前2位数字表示最相近的特异性,后2位数字表示亚型特异性。如编码A1抗原的两个等位基因分别是A※0101与A※0102


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5. 第五位数字代表核苷酸的碱基取代,称为“沉默取代”,不影响其编码的氨基酸序列。

如A※31011与A※31012的DNA序列虽然不同,但A31抗原氨基酸序列不受影响

6. 第6、7位数字代表相应启动子序列的多态性

7. 数字末尾加N表示无效基因


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第三节:HLA遗传

一.HLA基因定位与基因结构

HLA结构十分复杂,其多样性由多基因性和多态性两方面构成.

多基因性指复合体由多个位置相邻的基因座位所组成,编码产物具有相同或相似的功能.

根据结构和功能,组成HLA的基因

传统分为三类: HLA-I 、II、Ⅲ类

新分类:经典的HLA I类和II类基因

免疫功能相关基因


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1.经典的HLA-Ⅰ类基因 包括HLA-B、-C、-A,它们具有多态性, 编码HLA-Ⅰ类分子,主要生物学功能是参与递呈内源性抗原

2. 经典的HLA-Ⅱ类基因 包括HLA-DP、-DQ和-DR,它们也具有高度多态性,编码HLA- Ⅱ类分子,主要生物学功能是递呈外源性抗原


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HLA复合体Ⅰ类和Ⅱ类基因区内的基 因 名 称


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二.HLA遗传特征

(一)单倍型遗传

连锁在一条染色体上的HLA各位点的基因组合称为HLA单倍型(HLA haplotype)。

两个同源单倍型构成HLA的基因型(HLA genotype)。由于一条染色体上HLA各位点之间距离非常近,很少发生同源染色体间的交换。


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当亲代的遗传信息传给子代时,HLA单倍型作为一个单位遗传给下一代。因此,子女的HLA基因型中,一个单倍型与父亲相同,另一个与母亲相同。


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例如

父亲的HLA单倍型为a和b,母亲的是c和d,则其子女可出现ac、bc、ad和bd 4种单倍型组合。这样,亲代与子代间有一个单倍型是相同的。

同胞间,HLA单倍型完全相同的机率为25%,完全不相同的机率亦为25%,一个单倍型相同的机率为50%。


5143616

 因此,从家庭内寻找器官移植的供者,其供、受者HLA抗原型别相同的机率比在无血缘关系的供、受者中高得多。


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(二)共显性遗传

HLA复合体为共显性遗传,即每对等位基因都能编码抗原,共同表达于细胞膜上,而不形成ABO血型系统中的隐性基因及免疫球蛋白基因中的等位基因排斥现象,这就大大增加了HLA抗原系统的复杂性和多态性。


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(三)HLA的多态性

多态性:指一个基因座位上存在多个等位基因。

对同一个体而言,染色体上任一基因座位只能有两个等位基因,分别来自父、母的同源染色体。

HLA的多态性是一个群体概念,指群体中不同个体在等位基因拥有状态上存在差别 。


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HLA多态性的产生机制:

1.复等位基因 (multiple allele) 在群体中,位于同一基因座的不同基因系列即为复等位基因。 HLA复合体的多数基因座均有复等位基因。

2.共显性(co-dominant)表达 共显性即两条染色体同一基因座每一等位基因均为显性基因,均能编码特异性抗原。


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HLA多态性的意义:

1.赋予种群适应多变的环境条件

2.实现对机体免疫应答的遗传控制

3.使HLA成为个体的终身遗传标志

4.增加了寻找合适同种器官移植供者的难


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(四)连锁不平衡

单倍型基因非随机分布的现象称为连锁不平衡(linkage disequilibrium)。如某些基因(A1与B8)经常在一起出现,其单倍型频率比理论值高,而另一些基因又较少出现。连锁不平衡产生原因尚不清楚。有人认为,连锁不平衡与某些疾病的发生有关。


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第四节.HLA的交叉反应

交叉反应:HLA抗体不仅针对刺激其产生的抗

原,有时也针对相关的抗原,这种

现象称为交叉反应。

表 现:一种抗血清可以与多种抗原反应,

或一种特异性抗原可以与多种抗

体反应。


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原因:

1.HLA抗血清是多价抗血清,含有多种抗体

2.HLA由同一分子上一定数量高度相关的抗原因子组成,这些抗原因子具有不同的抗原性或免疫原性。

3.HLA的交叉反应可能是由复合抗原或复合抗体引起


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第五节 HLA分型

传统的血清学分型和细胞学分型技术主要侧重于HLA抗原特异性的分型,80年代建立的DNA分型技术则侧重于基因分析。


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(一)血清学分型技术

1. HLAⅠ类抗原的检测

HLA-A、B、C抗原型别鉴定均使用补体依赖的细胞毒试验(complement dependent cytotoxicity,CDC)。


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基本原理:

  标准分型血清中含有针对某种抗原特异性的细胞毒抗体,可与待测细胞表面相应HLA抗原结合,可以激活加入的补体,使细胞损伤或死亡。利用染料排斥试验判断受检细胞,受损或死亡细胞被染色为细胞毒阳性。细胞毒阳性细胞的HLA抗原型别与标准分型血清所针对的抗原相当。


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2. HLA-DQ、DR抗原的检测

该两抗原的检测方法同HLAⅠ类抗原,但所用的抗血清必须经过吸收(通常用多个个体的血小板来吸收)以除去其中的抗Ⅰ类抗原的抗体,待测细胞须用经过纯化的B细胞。


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标准分型血清多取自经产妇、计划免疫志愿者,或制备的HLA单克隆抗体。血清学分型是一项古老的技术,尽管近年来已建立许多新的技术,但它仍是目前HLA分型的基本方法。


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(二)细胞学分型技术

HLA-DP抗原特异性可应用纯合子分型细胞(homozygous typing cell,HTC)和预致敏淋巴细胞试验(primed lymphocyte test,PLT)检测。

两种方法的原理均是通过混合淋巴细胞培

养试验判断淋巴细胞在识别非己HLA抗原

后发生的增殖反应。由于分型细胞来源困

难以及实验方法繁琐,细胞学分型技术正

逐渐被淘汰。


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(三)DNA分型技术

1. RFLP技术

即限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism,RFLP)分析技术,其基本原理是,个体间抗原特异性来自氨基酸顺序的差别,后者由编码基因的碱基顺序不同所决定。

此种碱基顺序的差别造成限制性内切酶识别位置及酶切位点数目的不同,从而产生数量和长度不一的DNA酶切片段。经电泳、转膜后,用标记的特异cDNA探针与之杂交,经放射自显影显示出不同长度的杂交条带。根据杂交条带的格局来判定HLA的型别


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将聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)与RFLP结合起来,可明显提高其灵敏度。由于本法仅能反映某限制性内切酶位点的改变,故有一定的局限性。


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94℃变性

50-65℃退火

XX℃延伸


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标准的PCR反应体系

4种dNTP混合物 各200umol/L

引物        各10~100pmol

模板DNA 0.1~2ug

Taq DNA聚合酶 2.5u

Mg2+ 1.5mmol/L

PCR的基本原理

  • PCR反应条件

  • PCR过程

  • PCR的特点


5143616

1

2

3

高温变性

低温退火

适温延伸

94

温度

(℃)

72

55

22

1

2

3

4

5

时间(min)

  • PCR反应条件

  • PCR过程

  • PCR的特点

PCR的基本原理

重复1~3步

25~30轮

DNA变性

形成2条单链

目的DNA片段

扩增100万倍以上

子链延伸

DNA加倍

DNA单链

与引物复性

DNA双螺旋


5143616

95℃

1

2

3

高温变性

低温退火

适温延伸

重复1~3步

25~30轮

94

温度

DNA变性

形成2条单链

目的DNA片段

扩增100万倍以上

(℃)

72

子链延伸

DNA加倍

55

DNA单链

与引物复性

22

DNA双螺旋

1

2

3

4

5

时间(min)

PCR的基本原理

  • PCR反应条件

  • PCR过程

  • PCR的特点

模板DNA


5143616

95℃

DNA引物

50℃

PCR的基本原理

  • PCR反应条件

  • PCR过程

  • PCR的特点

引物1

引物2


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DNA引物

50℃

72℃

PCR的基本原理

Taq酶

  • PCR反应条件

  • PCR过程

  • PCR的特点

引物1

引物2

Taq酶


5143616

95℃

72℃

PCR的基本原理

  • PCR反应条件

  • PCR过程

  • PCR的特点

第1轮结束

第2轮开始


5143616

95℃

50℃

72℃

PCR的基本原理

Taq

  • PCR反应条件

  • PCR过程

  • PCR的特点

Taq

Taq

Taq


5143616

95℃

50℃

72℃

PCR的基本原理

Taq

  • PCR反应条件

  • PCR过程

  • PCR的特点

Taq

Taq

Taq


5143616

模板DNA

PCR的基本原理

第1轮扩增

第2轮扩增

第3轮扩增

  • PCR反应条件

  • PCR过程

  • PCR的特点

第4轮扩增

第5轮扩增

第6轮扩增


5143616

恶性肿瘤(癌基因或抑癌基因)

PCR-RFLP法:

Ras基因

限制性内切酶


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突变

限制性内切酶


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正常

突变

电泳


5143616

用人工合成的HLA型别特异的寡核苷酸序列作为探针,与待检细胞经PCR扩增的HLA基因片段杂交,从而确定HLA型别,PCR技术可将HLA复合体上指定基因片段特异性地扩增5~6个数量级;而专门设计的SSO(序列特异的寡核苷酸sequencedpecific oligonucleotide)探针又能探测出等位基因间1~2个核苷酸的差异,故PCR/SSO技术具有灵敏度高、特异性强、需样本量少等优点。

2. PCR/SSO技术


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3. PCR/SSP技术

该法的特点是设计一组顺序特异性引物(sequence specific primer SSP),经PCR 扩增获得不同型别的HLA特异扩增产物,可通过电泳法直接分析带型来判定HLA型别

目前,DNA分型法主要用于HLAⅡ类基因的分型,并有可能在不久的将来取代血清学方法。


5143616

PCR-SSP

引物特异性

1 2 3 4 5 6 7 8

PCR

1 2 3 4 5 6 7 8


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4、PCR/SSCP技术

即聚合酶链式反应-单链构象多态性技术。

原理:在不含变性剂的中性聚丙烯酰胺凝

胶中,单链DNA形成一定空间结

构,具有一定的构象。相同长度的

单链DNA因其序列不同,甚至单个

碱基不同,所形成的构象不同,电

泳时泳动速度不同。PCR扩增产物

经变性后进行非变性凝胶电泳,靶

DNA中碱基序列的差异出现泳动速

度的差别,通过放射自显影或银染

色来进行分析


5143616

第六节 HLA的群体分布

不同人种与同一人种不同群体间HLA的分布

有差异。A34、A36、B42抗原多见于黑种人,

被称为“黑种人抗原”;B41主要见于白种人;

B45、B54主要见于东方人,被成为“黄种人抗

原”


5143616

第七节 HLA在医学上的意义

一.亲子鉴定

人类白细胞血型系统被用于亲子鉴定的原因

是:

1.高度多态性;

2.抗原频率很低;

3.出生时抗原已完全发育,且终身不变

4.按孟德尔定律遗传


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案例一:被控父亲不能给必需单倍型被否定为生

母亲的 孩子的 被控父亲的

表现型 表现型 表现型

A1,A2 A1,A32A 1,A24

B5,B17 B15,B17 B8,B35


5143616

案例二:被控父亲能给必需单倍型不能否定

为生父

母亲的 孩子的 被控父亲的

表现型 表现型 表现型

A1,A3 A1,A11A2,A11

B7,B35 B7,B27 B7,B27


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父’ 父 子 母


5143616

二.个体识别

应用于血痕及体液的个人识别。用的是淋巴细胞抑制试验,这种方法比较麻烦,还

不能用于检测陈旧及微量生物斑痕。


5143616

现 嫌1 嫌2 嫌3


5143616

三、HLA与疾病的关联

很多自身免疫性疾病的发生都与遗传有关。

迄今已发现70多种疾病与HLA基因多态性相关联,其中大多数的自身免疫性疾病与HLA II类基因关联,

1、 携带HLA-DR4的人罹患类风湿关节炎的风险比正常人高6倍;

2、I型糖尿病(胰岛素依赖性糖尿病)携带HLA-DR3和-DR4基因的白人发病率是正常人的20倍。


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HLA与疾病的关联

疾病 HLA抗原 相对风险比

强直性脊柱炎 B27 87.4 Reiter病 B27 37.0急性前葡萄膜炎 B27 10.4亚急性甲状腺炎 B35 13.7寻常牛皮癣 Cw6 13.3疱疹样皮炎 DR3 15.4乳糜尿 DR3 10.8特发性膜性肾病 DR3 12.0


5143616

三、HLA配型与器官移植

人体遗传差异并非都对导致组织不相容性有同等重要的作用,最有意义的是ABO血型抗原和HLA抗原。主要组织相容性抗原不合是引起排斥反应的主要抗原。

通过组织配型(tissue matching),可以尽可能降低供者与受者间组织不相容性。组织配型的原则是使供者与受者的ABO血型抗原和HLA抗原相同,或者供者没有受者所缺的抗原,此时受者的免疫系统并无“非己”抗原所识别,构成了组织相容性移植物即可存活。


5143616

HLA配型:

在同一条染色体上HLA诸座位等位基因的组成称为单体型(haplotype)。由于各位点紧密连锁,所以在遗传时,单体型总是作为一个“单位”传给下一代。


5143616

进行HLA配型时应使供者和受者有尽可能多的HLA抗原相同。子女总是得到一条父亲的单体型和一条母亲的单体型。所以父子(女),或母子(女)之间必有一条相同的单体型,即HLA半相同。同胞之间可分为HLA相同、HLA半相同和HLA不相同三种情况。

在肾移植中,HLA各基因座配合的重要性依次为:

HLA-DR、HLA-B、HLA-A。


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亲属活体肾移植

同卵双生同胞间移植→ HLA相同的同胞→ 次选HLA半相同的同胞或亲代。

对于移植器官应选择有尽可能多的相同抗原的供者。

在骨髓移植时,不仅受者免疫系统会识别骨髓移植物为“非己”,骨髓移植物也会识别受者细胞为“非己”,只有供者、受者间HLA完全相同的情况下才容易获得成功。

因此,为了精确快速地进行组织配型,保证器官移植的成功,首先必须对供者和候选受者进行HLA基因分型。


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第七章 白细胞血型

【目的要求】

1.掌握 HLA的基因定位及HLA区的结构、HLA

遗传特征、HLA命名原则

2.熟悉 HLA的分型方法及判型、HLA抗原的结

3.了解 HLA抗原分子的组织分布特征


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第一节 概 述

MHC是表达于脊椎动物有核细胞表面的一类高度多态、紧密连锁的基因群,因其编码的蛋白质产物——主要组织相容性抗原在组织相容性的决定中起主要作用而得名。小鼠的MHC称为H-2系统,


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人的MHC称为人类白细胞抗原系统 (HLA系统),是人类基因组中最复杂、多态性最高的遗传体系。其主要功能为参与自我识别、调节免疫反应和对异体移植的排斥作用。


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定位于动物与人某对染色体的特定区域,呈高度多态性。MHC的编码产物即MHC分子或MHC抗原,其表达于不同细胞表面,主要功能是参与抗原递呈、制约细胞间相互识别及诱导免疫应答。

“组织相容性抗原”:诱发移植排斥反应的抗原被称为移植抗原或组织相容性抗原,其中可诱导迅速而强烈排斥反应者被称为主要组织相容性抗原。


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HLA研究简史

1958年 Dausset发现HLA-A2抗原,标志着

HLA研究的开始

1962年 Van Rood发现了4a,4b双等位基因

开辟了白细胞分型的道路

1964年 召开第一届国际组织相容性研讨会

揭开了HLA研究国际大协作的序幕

1965年 确定了HLA是人类主要组织相容性

抗原

1974年 证实了HLA系统位于人类第6号染色

体上

1999年 人类基因组计划将HLA编码基因全

部解密


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HLA系统的结构与组成

1999年10月,HLA的全基因组DNA序列被测定公布。

HLA系统位于人类第6染色体短臂(6p21.31),全长3600kb,包含128个功能基因和96个假基因,等位基因总数超过500多个。HLA复合体代表一组密切连锁的基因群,所有基因均为共显性。HLA复合体分为三个区域


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从着丝点一侧起依次为Ⅱ类基因、Ⅲ类基因和Ⅰ类基因区域所在


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H LA系统的基因座位(1997)

HLA I类区域 HLAⅡ类区域 HLAⅢ类区域

HLA-A HLA-DRA C2

HLA-B HLA-DRB1~ HLA-DRB9 Bf

HLA-C HLA-DQA1~HLA-DRA2 C4A

HLA-E HLA-DQB1~HLA-DQB3 C4B

HLA-F HLA-DPA1~HLA-DPA2 TNF

HLA-G HLA-DPB1~HLA-DPB2 LTA

HLA-H HLA-TAP1~HLA-TAP2 LTB

HLA-J HLA-DMB HLA-LMP2 HSP

HLA-K HLA-DMA HLA-LMP7

HLA-L HLA-DOB HLA-DOA


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HLA可分为三类:

I 类:

HLA-A、HLA-B、HLA-C经典基因

HLA-E、HLA-G、 HLA-F非经典基因

存在部位:I 类分子存在于几乎所有的有核细胞表面。

II 类:

基因包括3个亚区: HLA-DR、HLA-DQ和HLA-DP

HLA-DOB

HLA-DMA等基因

存在部位:II类分子主要存在于抗原呈递细胞如B细胞和巨噬细胞,树突状细胞和活化T细胞也表达II类分子。


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III类

基因位于II类基因和I类基因之间,

主要是与补体有关的C4A、C4B、Bf、C2等基因以及21-羟化酶(CYP21)基因、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)基因、热休克蛋白(heat shock protein,HSP70)基因和转录物基因B144、BAT1-T9、G1、G4、G6、G7、G8等。


Hla i2

HLA-I类与Ⅱ类抗原结构及细胞分 布

(一) HLA-I抗原的结构

HLA-A、B、C抗原是由第6号染色体相应Ⅰ类基因编码的α链(44kD)与第15号染色体编码的β2微球蛋白(β2 microglobulin,β2m,12kD)非共价结合的糖蛋白。α链由胞外区、跨膜区和胞内区组成。胞外区可进一步分为α1、α2和α3 三个功能区。


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 跨膜区含疏水性氨基酸,排列成α螺旋,跨越脂质双分子层。胞内的氨基酸被磷酰化后有利于细胞外信息向胞内传递。β2m无同种特异性,与α3功能区连接,其功能为有助于Ⅰ类抗原的表达和稳定性


5143616

Ⅰ类抗原分子顶部α1和α2区组成的抗原肽结合区呈沟槽状结构,α1和α2区各含4股β片层和1个α螺旋,可容纳8~12个氨基酸残基组成的短肽。

沟槽内氨基酸变化大,是Ⅰ类抗原多态性的基础。α3与β2m具有Ig恒定区样结构。α3为T细胞CD8分子的识别部位。


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(二)HLAⅡ类抗原的结构

HLA-DP、DQ、DR等Ⅱ类抗原是由Ⅱ类基因编码的α链(34kD)和β链(29kD)非共价连接的糖蛋白。α链和β链,均由胞外区、跨膜区和胞内区组成。胞外区各含两个功能区α1、α2和β1、β2 。


5143616

α1和β1区各自盘绕成一个α螺旋和β片层构成沟槽的一个侧壁和半个底面。沟槽与多肽结合的特点基本上与Ⅰ类抗原相似,但被结合的多肽一般来自外源性抗原经加工处理降解的产物。α2、β2区靠近细胞膜,具有Ig样结构


5143616

(三) HLA -Ⅰ、 II类分子的分布

HLA -Ⅰ类分子主要分布于机体所有有核细胞表面(包括血小板和网织红细胞),以淋巴细胞表面Ⅰ类分子的密度最大,其次为肾、肝及心脏,密度最低的为肌肉和神经组织。

HLA -Ⅱ类分子仅表达于专职抗原递呈细胞(B细胞、巨噬细胞、树突状细胞、郎格汉斯细胞)以及活化的T细胞和胸腺上皮细胞等表面 。


5143616

第二节 HLA命名

命名原则:

1.每一种因子前冠以HLA,后用英文大写字母表示基因座,如HLA-A,B

2.用阿拉伯数字代表特异性,如HLA-A1,HLA-B8

3.凡数字前加“W”符号的表示未确定的抗原,经WHO认可后即可取消“W”符号

4.HLA基因以4位数字表示,前2位数字表示最相近的特异性,后2位数字表示亚型特异性。如编码A1抗原的两个等位基因分别是A※0101与A※0102


5143616

5. 第五位数字代表核苷酸的碱基取代,称为“沉默取代”,不影响其编码的氨基酸序列。

如A※31011与A※31012的DNA序列虽然不同,但A31抗原氨基酸序列不受影响

6. 第6、7位数字代表相应启动子序列的多态性

7. 数字末尾加N表示无效基因


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第三节:HLA遗传

一.HLA基因定位与基因结构

HLA结构十分复杂,其多样性由多基因性和多态性两方面构成.

多基因性指复合体由多个位置相邻的基因座位所组成,编码产物具有相同或相似的功能.

根据结构和功能,组成HLA的基因

传统分为三类: HLA-I 、II、Ⅲ类

新分类:经典的HLA I类和II类基因

免疫功能相关基因


5143616

1.经典的HLA-Ⅰ类基因 包括HLA-B、-C、-A,它们具有多态性, 编码HLA-Ⅰ类分子,主要生物学功能是参与递呈内源性抗原

2. 经典的HLA-Ⅱ类基因 包括HLA-DP、-DQ和-DR,它们也具有高度多态性,编码HLA- Ⅱ类分子,主要生物学功能是递呈外源性抗原


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HLA复合体Ⅰ类和Ⅱ类基因区内的基 因 名 称


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二.HLA遗传特征

(一)单倍型遗传

连锁在一条染色体上的HLA各位点的基因组合称为HLA单倍型(HLA haplotype)。

两个同源单倍型构成HLA的基因型(HLA genotype)。由于一条染色体上HLA各位点之间距离非常近,很少发生同源染色体间的交换。


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当亲代的遗传信息传给子代时,HLA单倍型作为一个单位遗传给下一代。因此,子女的HLA基因型中,一个单倍型与父亲相同,另一个与母亲相同。


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例如

父亲的HLA单倍型为a和b,母亲的是c和d,则其子女可出现ac、bc、ad和bd 4种单倍型组合。这样,亲代与子代间有一个单倍型是相同的。

同胞间,HLA单倍型完全相同的机率为25%,完全不相同的机率亦为25%,一个单倍型相同的机率为50%。


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 因此,从家庭内寻找器官移植的供者,其供、受者HLA抗原型别相同的机率比在无血缘关系的供、受者中高得多。


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(二)共显性遗传

HLA复合体为共显性遗传,即每对等位基因都能编码抗原,共同表达于细胞膜上,而不形成ABO血型系统中的隐性基因及免疫球蛋白基因中的等位基因排斥现象,这就大大增加了HLA抗原系统的复杂性和多态性。


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(三)HLA的多态性

多态性:指一个基因座位上存在多个等位基因。

对同一个体而言,染色体上任一基因座位只能有两个等位基因,分别来自父、母的同源染色体。

HLA的多态性是一个群体概念,指群体中不同个体在等位基因拥有状态上存在差别 。


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HLA多态性的产生机制:

1.复等位基因 (multiple allele) 在群体中,位于同一基因座的不同基因系列即为复等位基因。 HLA复合体的多数基因座均有复等位基因。

2.共显性(co-dominant)表达 共显性即两条染色体同一基因座每一等位基因均为显性基因,均能编码特异性抗原。


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HLA多态性的意义:

1.赋予种群适应多变的环境条件

2.实现对机体免疫应答的遗传控制

3.使HLA成为个体的终身遗传标志

4.增加了寻找合适同种器官移植供者的难


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(四)连锁不平衡

单倍型基因非随机分布的现象称为连锁不平衡(linkage disequilibrium)。如某些基因(A1与B8)经常在一起出现,其单倍型频率比理论值高,而另一些基因又较少出现。连锁不平衡产生原因尚不清楚。有人认为,连锁不平衡与某些疾病的发生有关。


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第四节.HLA的交叉反应

交叉反应:HLA抗体不仅针对刺激其产生的抗

原,有时也针对相关的抗原,这种

现象称为交叉反应。

表 现:一种抗血清可以与多种抗原反应,

或一种特异性抗原可以与多种抗

体反应。


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原因:

1.HLA抗血清是多价抗血清,含有多种抗体

2.HLA由同一分子上一定数量高度相关的抗原因子组成,这些抗原因子具有不同的抗原性或免疫原性。

3.HLA的交叉反应可能是由复合抗原或复合抗体引起


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第五节 HLA分型

传统的血清学分型和细胞学分型技术主要侧重于HLA抗原特异性的分型,80年代建立的DNA分型技术则侧重于基因分析。


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(一)血清学分型技术

1. HLAⅠ类抗原的检测

HLA-A、B、C抗原型别鉴定均使用补体依赖的细胞毒试验(complement dependent cytotoxicity,CDC)。


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基本原理:

  标准分型血清中含有针对某种抗原特异性的细胞毒抗体,可与待测细胞表面相应HLA抗原结合,可以激活加入的补体,使细胞损伤或死亡。利用染料排斥试验判断受检细胞,受损或死亡细胞被染色为细胞毒阳性。细胞毒阳性细胞的HLA抗原型别与标准分型血清所针对的抗原相当。


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2. HLA-DQ、DR抗原的检测

该两抗原的检测方法同HLAⅠ类抗原,但所用的抗血清必须经过吸收(通常用多个个体的血小板来吸收)以除去其中的抗Ⅰ类抗原的抗体,待测细胞须用经过纯化的B细胞。


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标准分型血清多取自经产妇、计划免疫志愿者,或制备的HLA单克隆抗体。血清学分型是一项古老的技术,尽管近年来已建立许多新的技术,但它仍是目前HLA分型的基本方法。


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(二)细胞学分型技术

HLA-DP抗原特异性可应用纯合子分型细胞(homozygous typing cell,HTC)和预致敏淋巴细胞试验(primed lymphocyte test,PLT)检测。

两种方法的原理均是通过混合淋巴细胞培

养试验判断淋巴细胞在识别非己HLA抗原

后发生的增殖反应。由于分型细胞来源困

难以及实验方法繁琐,细胞学分型技术正

逐渐被淘汰。


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(三)DNA分型技术

1. RFLP技术

即限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism,RFLP)分析技术,其基本原理是,个体间抗原特异性来自氨基酸顺序的差别,后者由编码基因的碱基顺序不同所决定。

此种碱基顺序的差别造成限制性内切酶识别位置及酶切位点数目的不同,从而产生数量和长度不一的DNA酶切片段。经电泳、转膜后,用标记的特异cDNA探针与之杂交,经放射自显影显示出不同长度的杂交条带。根据杂交条带的格局来判定HLA的型别


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将聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)与RFLP结合起来,可明显提高其灵敏度。由于本法仅能反映某限制性内切酶位点的改变,故有一定的局限性。


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94℃变性

50-65℃退火

XX℃延伸


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标准的PCR反应体系

4种dNTP混合物 各200umol/L

引物        各10~100pmol

模板DNA 0.1~2ug

Taq DNA聚合酶 2.5u

Mg2+ 1.5mmol/L

PCR的基本原理

  • PCR反应条件

  • PCR过程

  • PCR的特点


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1

2

3

高温变性

低温退火

适温延伸

94

温度

(℃)

72

55

22

1

2

3

4

5

时间(min)

  • PCR反应条件

  • PCR过程

  • PCR的特点

PCR的基本原理

重复1~3步

25~30轮

DNA变性

形成2条单链

目的DNA片段

扩增100万倍以上

子链延伸

DNA加倍

DNA单链

与引物复性

DNA双螺旋


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95℃

1

2

3

高温变性

低温退火

适温延伸

重复1~3步

25~30轮

94

温度

DNA变性

形成2条单链

目的DNA片段

扩增100万倍以上

(℃)

72

子链延伸

DNA加倍

55

DNA单链

与引物复性

22

DNA双螺旋

1

2

3

4

5

时间(min)

PCR的基本原理

  • PCR反应条件

  • PCR过程

  • PCR的特点

模板DNA


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95℃

DNA引物

50℃

PCR的基本原理

  • PCR反应条件

  • PCR过程

  • PCR的特点

引物1

引物2


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DNA引物

50℃

72℃

PCR的基本原理

Taq酶

  • PCR反应条件

  • PCR过程

  • PCR的特点

引物1

引物2

Taq酶


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95℃

72℃

PCR的基本原理

  • PCR反应条件

  • PCR过程

  • PCR的特点

第1轮结束

第2轮开始


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95℃

50℃

72℃

PCR的基本原理

Taq

  • PCR反应条件

  • PCR过程

  • PCR的特点

Taq

Taq

Taq


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95℃

50℃

72℃

PCR的基本原理

Taq

  • PCR反应条件

  • PCR过程

  • PCR的特点

Taq

Taq

Taq


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模板DNA

PCR的基本原理

第1轮扩增

第2轮扩增

第3轮扩增

  • PCR反应条件

  • PCR过程

  • PCR的特点

第4轮扩增

第5轮扩增

第6轮扩增


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恶性肿瘤(癌基因或抑癌基因)

PCR-RFLP法:

Ras基因

限制性内切酶


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突变

限制性内切酶


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正常

突变

电泳


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用人工合成的HLA型别特异的寡核苷酸序列作为探针,与待检细胞经PCR扩增的HLA基因片段杂交,从而确定HLA型别,PCR技术可将HLA复合体上指定基因片段特异性地扩增5~6个数量级;而专门设计的SSO(序列特异的寡核苷酸sequencedpecific oligonucleotide)探针又能探测出等位基因间1~2个核苷酸的差异,故PCR/SSO技术具有灵敏度高、特异性强、需样本量少等优点。

2. PCR/SSO技术


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3. PCR/SSP技术

该法的特点是设计一组顺序特异性引物(sequence specific primer SSP),经PCR 扩增获得不同型别的HLA特异扩增产物,可通过电泳法直接分析带型来判定HLA型别

目前,DNA分型法主要用于HLAⅡ类基因的分型,并有可能在不久的将来取代血清学方法。


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PCR-SSP

引物特异性

1 2 3 4 5 6 7 8

PCR

1 2 3 4 5 6 7 8


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4、PCR/SSCP技术

即聚合酶链式反应-单链构象多态性技术。

原理:在不含变性剂的中性聚丙烯酰胺凝

胶中,单链DNA形成一定空间结

构,具有一定的构象。相同长度的

单链DNA因其序列不同,甚至单个

碱基不同,所形成的构象不同,电

泳时泳动速度不同。PCR扩增产物

经变性后进行非变性凝胶电泳,靶

DNA中碱基序列的差异出现泳动速

度的差别,通过放射自显影或银染

色来进行分析


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第六节 HLA的群体分布

不同人种与同一人种不同群体间HLA的分布

有差异。A34、A36、B42抗原多见于黑种人,

被称为“黑种人抗原”;B41主要见于白种人;

B45、B54主要见于东方人,被成为“黄种人抗

原”


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第七节 HLA在医学上的意义

一.亲子鉴定

人类白细胞血型系统被用于亲子鉴定的原因

是:

1.高度多态性;

2.抗原频率很低;

3.出生时抗原已完全发育,且终身不变

4.按孟德尔定律遗传


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案例一:被控父亲不能给必需单倍型被否定为生

母亲的 孩子的 被控父亲的

表现型 表现型 表现型

A1,A2 A1,A32A 1,A24

B5,B17 B15,B17 B8,B35


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案例二:被控父亲能给必需单倍型不能否定

为生父

母亲的 孩子的 被控父亲的

表现型 表现型 表现型

A1,A3 A1,A11A2,A11

B7,B35 B7,B27 B7,B27


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父’ 父 子 母


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二.个体识别

应用于血痕及体液的个人识别。用的是淋巴细胞抑制试验,这种方法比较麻烦,还

不能用于检测陈旧及微量生物斑痕。


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现 嫌1 嫌2 嫌3


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三、HLA与疾病的关联

很多自身免疫性疾病的发生都与遗传有关。

迄今已发现70多种疾病与HLA基因多态性相关联,其中大多数的自身免疫性疾病与HLA II类基因关联,

1、 携带HLA-DR4的人罹患类风湿关节炎的风险比正常人高6倍;

2、I型糖尿病(胰岛素依赖性糖尿病)携带HLA-DR3和-DR4基因的白人发病率是正常人的20倍。


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HLA与疾病的关联

疾病 HLA抗原 相对风险比

强直性脊柱炎 B27 87.4 Reiter病 B27 37.0急性前葡萄膜炎 B27 10.4亚急性甲状腺炎 B35 13.7寻常牛皮癣 Cw6 13.3疱疹样皮炎 DR3 15.4乳糜尿 DR3 10.8特发性膜性肾病 DR3 12.0


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三、HLA配型与器官移植

人体遗传差异并非都对导致组织不相容性有同等重要的作用,最有意义的是ABO血型抗原和HLA抗原。主要组织相容性抗原不合是引起排斥反应的主要抗原。

通过组织配型(tissue matching),可以尽可能降低供者与受者间组织不相容性。组织配型的原则是使供者与受者的ABO血型抗原和HLA抗原相同,或者供者没有受者所缺的抗原,此时受者的免疫系统并无“非己”抗原所识别,构成了组织相容性移植物即可存活。


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HLA配型:

在同一条染色体上HLA诸座位等位基因的组成称为单体型(haplotype)。由于各位点紧密连锁,所以在遗传时,单体型总是作为一个“单位”传给下一代。


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进行HLA配型时应使供者和受者有尽可能多的HLA抗原相同。子女总是得到一条父亲的单体型和一条母亲的单体型。所以父子(女),或母子(女)之间必有一条相同的单体型,即HLA半相同。同胞之间可分为HLA相同、HLA半相同和HLA不相同三种情况。

在肾移植中,HLA各基因座配合的重要性依次为:

HLA-DR、HLA-B、HLA-A。


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亲属活体肾移植

同卵双生同胞间移植→ HLA相同的同胞→ 次选HLA半相同的同胞或亲代。

对于移植器官应选择有尽可能多的相同抗原的供者。

在骨髓移植时,不仅受者免疫系统会识别骨髓移植物为“非己”,骨髓移植物也会识别受者细胞为“非己”,只有供者、受者间HLA完全相同的情况下才容易获得成功。

因此,为了精确快速地进行组织配型,保证器官移植的成功,首先必须对供者和候选受者进行HLA基因分型。


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