Powerpoint Templates

1. T lymphocyte apoptosis in HIV infection Phennapha Klangsinsirikul Department of Medical Technology Faculty of Associated Medical Sciences Chiang Mai University Powerpoint Templates

2. The term apoptosis is often used synonymously with programmed cell death, implying the death results from the regulated activation of a pre-existing death program that is encoded in the genome. What is apoptosis?

3. Embryonic development and morphogenesis Formation of cavities Separation of digits Eliminates vestigial structures that once served a function during embryogenesis. Balances cell division, maintaining the constancy of tissue mass. Roles of apoptosis in physiology

4. Apoptosis in physiology and pathology

5. Removal of cells injured by genetic defects, ageing, disease, or exposure to noxious agents. Elimination of specific cell populations for maintaining the normal immune response. Excessive or insufficient apoptosis contributes to the pathogenesis of ischemia, neurodegeneration, autoimmunity, viral infection and growth and regression of tumours Roles of apoptosis in pathology

6. http://www.microbiologybytes.com/virology/kalmakoff/baculo/baculohostinteract.htmlhttp://www.microbiologybytes.com/virology/kalmakoff/baculo/baculohostinteract.html

7. Goodlett, C.R., and Horn, K.H. Mechanisms of alcohol-induced damage to the developing nervous system. Alcohol Research & Health 25(3):175–184, 2001.

8. http://ghr.nlm.nih.gov/handbook/illustrations/apoptosismacrophagehttp://ghr.nlm.nih.gov/handbook/illustrations/apoptosismacrophage

9. http://www.pharmainfo.net/reviews/p53-gene-therapy-potential-panacea-cancerhttp://www.pharmainfo.net/reviews/p53-gene-therapy-potential-panacea-cancer

10. http://www.bioscience.org/2009/v14/af/3509/fulltext.asp?bframe=figures.htm&doi=yeshttp://www.bioscience.org/2009/v14/af/3509/fulltext.asp?bframe=figures.htm&doi=yes

11. Cellular decision to initiate apoptosis programs depends on Cessation of extracellular signals that negatively regulate apoptosis, e.g. the signals are required for survival. Receipt of positive signals for cell death through ‘death receptors’. Extracellular death signals

12. CD95 (Fas or APO-1) is a type I transmembrane receptor that belong to tumour necrosis factor receptor (TNF-R) family. It is involved in death transducing signals and is referred as a ‘death receptor’. CD95-mediated apoptosis is triggered by its natural ligand, CD95L (FasL) which is type II transmembrane protein. Apoptosis signaling by CD95

13. Fas and FasL are implicated in Peripheral blood deletion of autoreactive T cells. Activation-induced T cell death. Cytolytic pathway mediated by CD8+ cytotoxic T cells (CTL). Apoptosis signaling by CD95

14. Cytotoxic T lymphocyte (CTL) killing of target cells http://www.pathology.unibe.ch/Forschung/apoptosis/TBrunner_res.htm

15. Cell can respond to diverse stressful stimuli and metabolic disturbances by triggering apoptotic programs. Drugs, toxins, heat, radiation, hypoxia, viral infection Intracellular death signals can activate mitochondria to release cytochrome C into the cytosol. When and how do cells decide to commit suicide when subjected to stressful stimuli? The intensity and the duration of the stimulus determine the outcome. The stimulus needs to exceed a threshold in order to trip the decision. Intracellular death signals

16. http://www.dkfz.de/en/immungenetik/Min_group/Min_englisch.htmlhttp://www.dkfz.de/en/immungenetik/Min_group/Min_englisch.html http://www.dkfz.de/en/immungenetik/Min_group/Min_englisch.html

17. http://flipper.diff.org/app/pathways/info/581

18. http://www.biooncology.com/research/apoptosis/pathways/intrinsic/http://www.biooncology.com/research/apoptosis/pathways/intrinsic/

19. Inhibition of apoptosis • Inhibition of apoptosis can result in a number of cancers, autoimmune diseases, inflammatory diseases, and viral infections. • It was originally believed that the associated accumulation of cells was due to an increase in cellular proliferation, but it is now known that it is also due to a decrease in cell death.

20. Hyperactive apoptosis • Loss of control of cell death (resulting in excess apoptosis) can lead to neurodegenerative diseases, hematologic diseases, and tissue damage. • The progression of HIV is directly linked to excess, unregulated apoptosis: CD4+ lymphocytes die at an accelerated rate through uncontrolled apoptosis.

21. HIV progression • HIV enzymes deactivate anti-apoptotic Bcl-2: primes the cell for apoptosis should the appropriate signal be received. • HIV enzymes activate pro-apoptotic procaspase-8, which directly activate the mitochondrial events of apoptosis. • HIV may increase the level of cellular proteins which prompt Fas-mediated apoptosis. • HIV proteins decrease the amount of CD4 glycoprotein marker present on the cell membrane.

22. HIV progression • Released viral particles and proteins present in extracellular fluid are able to induce apoptosis in nearby "bystander" T helper cells. • HIV decreases the production of molecules involved in marking the cell for apoptosis, giving the virus time to replicate and continue releasing apoptotic agents and virions into the surrounding tissue. • The infected CD4+ cell may also receive the death signal from a cytotoxic T cell

24. Detection of Apoptosis • Cell morphology • Annexin V/PI binding • DNA fragmentation • Mitochondrial transmembrane potential • Caspase activity assay • Procaspase activation • DNA binding • Apoptotic gene expression (mRNA)

25. การศึกษาอัตราการเกิด Apoptosis ของ CD4+ T lymphocytes ในผู้ติดเชื้อเอชไอวี และผู้ป่วยเอดส์

26. ผู้ติดเชื้อเอชไอวี และผู้ป่วยเอดส์ ที่รักษาด้วยยาต้านไวรัสหลายขนานร่วมกัน (HAART) ปริมาณ VL ลดลงอย่างรวดเร็วจนถึงระดับที่ตรวจวัดไม่ได้ การเพิ่มจำนวน CD4+ T lymphocytes ในกระแสเลือด ผู้ป่วยที่ล้มเหลวจากการรักษาด้วยยาต้านไวรัส ปริมาณไวรัสในกระแสเลือดสูงขึ้น ระดับ CD4+ T lymphocytes ลดลงหรือไม่เพิ่มขึ้นเมื่อเทียบกับก่อนเริ่มการรักษา อาจเกิดจากผู้ป่วยกินยาต้านไวรัสไม่สม่ำเสมอ ทำให้เกิดการกลายพันธุ์ของไวรัส จนเกิดการดื้อต่อยาต้านไวรัสที่ใช้รักษาอยู่ ที่มาของปัญหา

27. การตรวจทางห้องปฏิบัติการเพื่อใช้ติดตามประเมินผล HAART CD4+ T lymphocyte Count HIV Viral load assay HIV drug resistancetest การตรวจหาการตายของ CD4+ T lymphocytes โดยขบวนการ apoptosis ใช้เทคนิคการตรวจที่ไม่ยุ่งยากมากนัก จึงอาจนำมาใช้ร่วมในการติดตามประเมินผล HAART cละอาจใช้ช่วยพยากรณ์ผลการรักษาได้ การตรวจ Apoptosis assay ด้วยเครื่องโฟลไซโตมิเตอร์ เช่น วิธี Annexin V ทำได้ง่าย ไม่ยุ่งยาก ห้องปฏิบัติการที่ให้บริการตรวจ CD4+ T cell count สามารถทำการตรวจได้ ที่มาของปัญหา (ต่อ)

28. การตรวจโดยใช้ Annexin V http://www.lifesci.dundee.ac.uk/services/flow_cytometry/common_applications/cell-death.html

29. เพื่อศึกษาความสัมพันธ์ระหว่างอัตราการเกิด apoptosis ของ CD4+ T lymphocytes กับปริมาณ CD4+ T lymphocytes ในผู้ติดเชื้อ HIV และผู้ป่วยเอดส์ ก่อนและหลังได้รับการรักษาด้วยยาต้านไวรัส เพื่อศึกษาว่า apoptosis assay สามารถนำมาใช้ติดตามประเมินผลการรักษาด้วยยาต้านไวรัส นอกเหนือจากการตรวจ CD4+ T lymphocytes และ HIV-1 Viral load ได้หรือไม่ วัตถุประสงค์

30. วิธีวิจัยและขอบเขตการวิจัยวิธีวิจัยและขอบเขตการวิจัย • กลุ่มตัวอย่าง 4 กลุ่ม • กลุ่มผู้ป่วยก่อนได้รับยาต้านไวรัส(Naïve)16 ราย • กลุ่มอาสาสมัครปกติ (HIV negative) 16 ราย • กลุ่มผู้ป่วยที่รักษาด้วยยาต้านไวรัส และมี CD4+ T cells >200 cells/µl16 ราย • กลุ่มผู้ป่วยที่รักษาด้วยยาต้านไวรัส และมี CD4+ T cells <200 cells/µlจำนวน 16 ราย • การวิเคราะห์ทางสถิติ • เปรียบเทียบอัตราการเกิด apoptosis ทั้ง 4 กลุ่ม • หาความสัมพันธ์ระหว่างการเกิด apoptosis กับปริมาณ CD4+ T cells ของผู้ป่วย

31. การตรวจหาอัตราการเกิด CD4+ T lymphocyte apoptosis โดยวิธีโฟลไซโตเมทรี ย้อมเซลล์เม็ดเลือดด้วย anti-CD3-PC5 และ anti-CD4-PE เพื่อแยกแยะ CD4+ T lymphocytes (CD3+/CD4+) ออกจากเม็ดเลือดขาวชนิดอื่นๆ ย้อมเซลล์ด้วย Annexin V- FITC ซึ่งจะย้อม phosphatidylserine ที่ผิวของเซลล์ที่กำลังเกิด apoptosis ควบคู่กับการย้อมด้วย Propidium iodide ซึ่งย้อม DNA ภายในเซลล์ซึ่งตายแล้ว นำไปวิเคราะห์ด้วยเครื่อง BC FC500 flow cytometer ซึ่งวิเคราะห์ได้ 4 สีในเวลาเดียวกัน วิธีการตรวจ

32. วิธีการตรวจ (A) (B) ภาพแสดงการตรวจการเกิด apoptosis ของ CD4+ T lymphocytesด้วยวิธี Flow cytometry, (A) Dot plot ระหว่างค่า SSC and anti-CD3-PC5 เพื่อกำหนดให้ CD3+ T cells อยู่ใน gateA, (B) จาก gateA มาทำ Dot plot ระหว่าง anti-CD4-PE and anti-CD3-PC5 เพื่อแยกกลุ่มเซลล์เป็น CD4+ T cells and CD4- T cells

33. วิธีการตรวจ Necrosis Late apoptosis Viable cell Early apoptosis ภาพแสดง Dot plot ระหว่าง PI and Annexin V-FITC จาก gateB เพื่อแยก cells ออกเป็น 4 กลุ่ม ปริมาณ cells ที่อยู่ใน quadrant ของ E1, E2, E3 และ E4 หมายถึง necrosis cells, late apoptosis cells, viable cells และ early apoptosis cells ตามลำดับ

34. ผลการวิจัย

35. ภาพแสดงการเปรียบเทียบ % Early apoptosis แต่ละกลุ่ม P = 0.000 P = 0.451 %Early apoptosis P = 0.008 Naïve Normal Treated(CD4<200) Treated(CD4>200)

36. ภาพแสดงการเปรียบเทียบ % Late apoptosis แต่ละกลุ่ม P = 0.000 P = 0.003 %Late apoptosis P = 0.000 Naïve Normal Treated(CD4<200) Treated(CD4>200)

37. ภาพแสดงการเปรียบเทียบ % Total apoptosis apoptosis แต่ละกลุ่ม P = 0.035 P = 0.065 %Total apoptosis P = 0.001 Naïve Normal Treated(CD4<200) Treated(CD4>200)

38. ตารางแสดงค่า p value ในการเปรียบเทียบทางสถิติของค่า %Total apoptosis, %Early apoptosis, % Late apoptosis ระหว่างกลุ่มตัวอย่างแต่ละกลุ่ม

39. ภาพแสดงการเปรียบเทียบ % Early apoptosis P = 0.146 %Early apoptosis P = 0.661 Naïve(CD4<200) Naïve(CD4>200) Normal Treated(CD4<200) Treated(CD4>200)

40. ภาพแสดงการเปรียบเทียบ % Late apoptosis P = 0.016 %Late apoptosis P = 0.007 Naïve(CD4<200) Naïve(CD4>200) Normal Treated(CD4<200) Treated(CD4>200)

41. ภาพแสดงการเปรียบเทียบ % Total apoptosis P = 0.502 %Total apoptosis P = 0.236 Naïve(CD4<200) Naïve(CD4>200) Normal Treated(CD4<200) Treated(CD4>200)

42. ตารางแสดงค่า p value ในการเปรียบเทียบทางสถิติของค่า %Total apoptosis, %Early apoptosis, % Late apoptosis ระหว่างกลุ่มตัวอย่างแต่ละกลุ่ม

43. วิจารณ์ผลการทดลอง จากผลการทดลองดังกล่าวแสดงให้เห็นว่าอัตราการเกิด apoptosis ของ CD4+T lymphocytesสัมพันธ์กับการลดลงของจำนวน CD4+ T lymphocytesของผู้ที่ติดเชื้อ HIV โดยที่อัตราการเกิด apoptosis ในคนปกตินั้นก็สามารถพบได้ในระดับที่ไม่สูงมากนัก พบว่าในผู้ติดเชื้อ HIV ทั้งที่ยังไม่ได้รับการรักษาและได้รับการรักษาด้วยยาต้านไวรัสแล้ว ในกรณีที่มีปริมาณของ CD4+T lymphocytesที่ใกล้เคียงกัน มีอัตราการเกิด apoptosis ที่แตกต่างกัน โดยผู้ที่ติดเชื้อ HIV ที่มีอัตราการเกิด apoptosis ที่สูงกว่า น่าจะมีความรุนแรงในการดำเนินโรคที่มากกว่าผู้ที่ติดเชื้อที่มีอัตราการเกิด apoptosis ที่ต่ำกว่าในกรณีที่มีปริมาณของ CD4+T lymphocytesที่ใกล้เคียงกัน

44. สรุปผลการทดลอง กลุ่มผู้ติดเชื้อ HIV ที่ยังไม่ได้รับการรักษา มีอัตราการเกิด apoptosis สูงกว่ากลุ่มคนปกติอย่างมีนัยสำคัญทางสถิติ (p<0.01) กลุ่มผู้ติดเชื้อ HIV ที่ยังไม่ได้รับการรักษามีอัตราการเกิด apoptosis ต่ำกว่ากลุ่มผู้ติดเชื้อ HIV ที่ได้รับการรักษาที่มี absolute CD4 count < 200 cells/µl อย่างมีนัยสำคัญทางสถิติ (p < 0.05) อัตราการเกิด apoptosis ของกลุ่มผู้ติดเชื้อ HIV ที่ยังไม่ได้รับการรักษา กับกลุ่มผู้ติดเชื้อ HIV ที่ได้รับการรักษาที่มี absolute CD4 count > 200 cells/µl ไม่แตกต่างกันอย่างมีนัยสำคัญทางสถิติ (p > 0.05) จากผลการศึกษาดังกล่าวแสดงให้เห็นว่าสามารถนำวิธีการตรวจหาการเกิด apoptosis ของ CD4+ T lymphocytesด้วย Annexin V-FITC มาประยุกต์ใช้ในการตรวจเพื่อช่วยประเมินความรุนแรงในการดำเนินโรค และประเมินผลการรักษาผู้ติดเชื้อ HIV ร่วมกับการตรวจนับปริมาณ CD4+ T lymphocytes ได้

45. http://www.biooncology.com/research/apoptosis/pathways/intrinsic/http://www.biooncology.com/research/apoptosis/pathways/intrinsic/

46. การศึกษาเบื้องต้นเกี่ยวกับการแสดงออกของยีนที่เกี่ยวข้อกับการเกิด apoptosis ในผู้ติดเชื้อเอชไอวี

47. http://www.si.mahidol.ac.th/department/biochemistry/home/md/MD_faq_contents/MD_faq_14ans.htmhttp://www.si.mahidol.ac.th/department/biochemistry/home/md/MD_faq_contents/MD_faq_14ans.htm http://www.meduni-graz.at/zmf/946

48. Crossing point (Cp) http://www.dnassequencing.com/2010/11/25/real-time-pcr-5/

49. 1. กลุ่มผู้ติดเชื้อเอชไอวีที่มีปริมาณ CD4+ < 100 cells/µl จำนวน 8 ตัวอย่าง 2. กลุ่มผู้ติดเชื้อเอชไอวีที่มีปริมาณ CD4+ >100 cells/µl จำนวน 7 ตัวอย่าง 3. กลุ่มคนปกติที่ไม่ติดเชื้อเอชไอวี จำนวน 10ตัวอย่าง รวม25 ตัวอย่าง

50. Bax Bcl-2 BA ภาพแสดงค่า Tm ของ PCR product