Agamenon J. Carpousis, Griet Van Houwe, Claude Ehretsmann and Henry M. Krisch. 1994

1. Copurification of E.ColiRNAase E and PNPase:Evidencefor a SpecificAssociationbetweentwoEnzymesImportant in RNA Processing and Degradation Agamenon J. Carpousis, Griet Van Houwe, Claude Ehretsmann and Henry M. Krisch. 1994

2. Introducción: Degradación de mRNA Disminución de nivel de expresión Regulación de la Expresión Génica Acción de Endo y Exonucleasas

4. E.Coli: mRNA • Exonucleasas Degradación desde 3` produciendo mononucleótidos La mayoría de los mensajeros tienen estructuras en sus extremos 3’ que pueden impedir la acción de estas exonucleasas. • Endonucleasas adheridas se cree que inician la degradación de ARNm por la creación de la llamada entrada de sitios de 3’ exonucleasas.

5. RNAase E: Originalmente identificada como una endoribonucleasa implicada en la maduración de ARNr 5S Subunidad 9S Subunidad 5S ribosomal ribosomal • A cierta temperatura una deformación termo-sensible del gen rne no produce el ARN ribosomal 5S y se acumula su precursor (ARN ribosomal 9S).

6. RNAaseE-bacteriófago T4 • Procesamiento y degradación de varios mRNA RNAase E- E.coli • Mutaciónamsafecta decaimiento químico de mRNA • Mutaciones rne y ams en el mismo locus • Gen rne Gen estructural

7. Resultados:

8. Purificación RNAase E • Método original purificación no homogénea (precipitación con sulfato MM Nativa 70Kd de amonio, cromatografía de intercambio iónico y gel filtración). • Gradiente de Glicerol MM Nativa 300 Kd • Lysozyme-Edta, Triton, NH4Cl, detergentes no-iónicos e inhibidores de proteasas mayor rendimiento.

9. Ensayo de Actividad • Se estudio una forma truncada del ARNr 9S como sustrato de la ARNasa E: 9Sa RNAase E • Sitios de corte: c, a, b

10. 45ºC Procesamiento de 9Sa RNA Wt HT Wt HT Rne H T

11. Corte en a no se ve afectado por el sustrato • Carriles 2 y 3: tratamiento con calor de RNAase E de cepa rne reduce procesamiento de 9Sa • 1U de Actividad: Cantidad de RNAase E que cliva completamente 9Sa en el sitio aen 30 min a 30ºC • Ensayo de ACTIVIDAD en cada paso de la purificación (tabla 1)

12. Tabla 1 1200 9 Enz se purifica 130-veces

13. Figura A: SDS-PAGE Tinción con CoomassieFigura B: Western blot Producto gen rne Purificación de la ARNasa E WT Polipéptido detectado similar se observó para enzima mutante

14. Procesamiento de ARN ribosomal 9S 45ºC WT rne • Gel electroforesis desnaturalizante • Se detectó p5S: tiene 6nt más que 5S • Identificación producto basado en tamaño • Sitio a: GA/AUU • 5’/a, 5’/c contienen extremo 5’ de 9S • P5, c/a, b/3’, son internos o del extremo 3’ de 9S • La enzima mutante es inactivada por tratamiento con calor (carril 3)

15. Procesamiento del ARNm por la ARNasaE • Mapeo in vitro del clivaje de la ARNasaEA ) secuencia líder 5’  del  bacteriófago T4 en gen 32; B)-  secuencia líder 5’   E.coliompA. • B. secuencias sin enzima • Carril 1 y 2 digerido con wtARNasa E. • Carril 3 y 4 digestión con ARNasatermosensible • + Control: dideoxinuclotidos fueron omitidos • ARN no marcado digerido con fracción HT de wt y sensible a temperatura. • Productos analizados por extensión de primers. • Reacción de secuenciación permitió determinar el sitio de clivaje: GA/AUU(gen32) y GG/AUU(ompA).

16. Detección de la actividad PNPasa • La PNPasa, exonucleasa que degrada progresivamente el ARN partirext3’ produciendomononucleotidosdifosfatos. • Digestión del sustrato L168 marcado (α 32P)UTP, digerido a 50º con fracción HT de wt en el transcurso del tiempo. • Producto analizado en cromatografia de capa fina. • Se observa actividad PNPasa en la fracción HT.

17. Sedimentación del complejoARNasaE-PNPasa sobre gradiente de glicerol

18. PNPasa residual es una forma de la enzima que no esta asociada con la ARNasaE,por eso no es perturbada por la desnaturalizacion del producto del gen rne. • La PNPasa-ARNasaE en 11-13 son parte de un gran complejo proteico. • Dos posibles interpretaciones de la heterogeneidad: - ARNasaE-PNPasa normalmente existen como una mezcla de formas libres y complejos. - Las formas libres son un artefacto debido a la perturbación parcial del complejo proteico durante la purificación.

19. Imunoprecipitación del complejo ARNasa E-PNPasa e identificación de las proteínas 85 y 45kd • Inmunoprecipitación con anticuerpo anti-hmp1. • La coprecipitación de los polipéptidos de 180, 85 y 48 Kd, podría deberse a la interacción específica entre los mismos. HT sirve como marcador y la posición de las proteínas de 180, 85, 50, y 48 kd B: Control sin antígeno 1: muestran la inmunoprecipitación de PNPasa altamente purificada 2: wt de la fracción AP de nuestra preparación de RNAasa E 3: entrada PNPasa 4: entrada de la fracción AP

20. La migración de los polipéptidos de 85 y 48 kd de la preparación de PNPasa en el carril 3 es exactamente igual que la de los polipéptidos de 85 y 48 kd en la fracción HT. • Una comparación de los carriles 2 y 4 muestra que el anticuerpo del anti-hmp1 precipitó selectivamente el producto de 180 kd del gen rne y la subunidad catalítica de PNPasa de 85 kd. • Estaba también clara en el gel original que era el polipéptido de 48 kd immunoprecipitado. • El carril 1 es un control importante que muestra que el anticuerpo del anti-hmpl no precipita los polipéptidos 85 y 48 kd en la preparación altamente purificada de PNPasa. • La co-precipitación de los polipéptidos de 180, 85, y 48 kd en el carril 2 debe ser debida a una interacción específica entre el polipéptido de 180 kd y los polipéptidos de 85 y 48 kd.

21. Comparación de la proteólisis limitada del polipéptido de 85 Kd de la fracción HT y PNPasa con proteasa V8. • El polipéptido de 85 Kd es aparentemente idéntico a la subunidad catalítica de la PNPasa (pnp) 1 y 2 son controles que muestran las proteínas purificadas 3 y 4 muestran la proteólisis limitada de las proteínas individuales con la proteasa V8 El carril 5 es la proteólisis de una mezcla igual de cada proteína. El carril 6 es un control que muestra la proteasa solamente

22. La figura B muestra una comparación de la proteólisis limitada de las proteínas de 85 kd de nuestra fracción HT y de PNPasa. • Estas proteínas fueron purificadas por SDS-PAGE. • En carriles 3-5, el patrón de productos es esencialmente igual con solamente diferencias de menor importancia en la intensidad de algunas bandas. Esto es probablemente debido a variaciones pequeñas en el grado de la digestión.

23. Este experimento muestra que la proteína de 85 kd en nuestra preparación es al parecer idéntica a la subunidad catalítica de la PNPasa (pnpα). Este resultado fue confirmado usando la papaína.

24. Proteólisis limitada del polipéptido de 48 Kd con V8. • El polipéptido de 48 Kd es aparentemente idéntico a la subunidad  de la PNPasa (pnp ). 1 y 2 son controles que muestran las proteínas purificadas 3 y 4 muestran la proteólisis limitada de las proteínas individuales con la proteasa V8 El carril 5 es la proteólisis de una mezcla igual de cada proteína. El carril 6 es un control que muestra la proteasa solamente

25. Autorradiograma de la Inmunoprecipitación de la ARNasaE parcialmente purificada marcada radioactivamente con 35S metionina. Esta proteína fue purificada con cromatografía S-Sepharose. • pnp, pnp  y una proteína de 50 Kd coprecipitan con el producto del gen rne. 1: precipitación del control usando el suero normal del conejo 2: precipitación con el suero del anti-hmpl 3: proteína radiactiva de la entrada.

26. El carril 1 muestra que no hay precipitación significativa de las proteínas de entrada usando el suero del control, mientras que el carril 2 muestra el pnpα, el pnpβ, y el co-precipitado de la proteína de 50 kd del producto del gen rne. • El carril 2 del autorradiograma fue explorado con densitometría. • La única proteína detectada en los niveles significativos funcionó cerca de 75 kd (carril 2, banda débil debajo del pnpα). Está presente en alrededor de 10% la cantidad de la subunidad del pnpα.

27. Caracterización de la forma proteolizada de la ARNasa E • Sedimentación de una forma degradada de la ARNasa E (ARNasa E*) en un gradiente de glicerol. • ARNasa E purificada es muy sensible a la proteólisis • ARNasa E* tiene altos niveles de actividad endonucleasa y la misma especificidad que la ARNasa E intacta. • Análisis por Western blotting mostró que los polipéptidos de 73 y 69 Kd son producto de la degradación del polipéptido de 180 Kd. • Como no se detecta los pl. de 85, 50 y 48 Kd y no hay actividad PNPasa, los resultados indican que la proteólisis del producto del gen rne durante la purificación, puede romper el complejo ARNasa E-PNPasa. -.

28. Discusión

29. La copurificación y cosedimentación de la PNPasa con la ARNasa E, sugiere que ambas enzimas son parte de un complejo proteico (CP). • El CP altamente purificado contiene 4 polipéptidos de 180, 85, 50 y 48 Kd. El de 85 Kd se identificó como pnp y el de 48 Kd comopnp . • El tratamiento con calor de la enzima producto del gen mutado resulta en una inactivación de la misma. El mismo tratamiento de la enzima wt no tuvo efecto en la actividad o en el complejo proteico. • La ARNasa E es muy sensible a la proteólisis durante la purificación. ARNasa E* contiene pl. de 73 y 69 Kd que son fragmentos proteóliticos del pl. de 180Kd. • ARNasa E* tenía un tamaño menor al del CP y no estaba asociada a la PNPasa E. Estos resultados indican que el producto del gen rnepuederomper el CP ARNasa E-PNPasa y sugieren que el sitio catalítico de la ARNasa E está localizado en un dominio de la proteína rne.

30. La ARNasa E estaría asociada a membrana ya que se requieren detergentes y alta concentración de sales para su solubilización. El análisis de la forma degradada sugiere que la proteólisis podría liberar el dominio del producto del gen rne que contiene el sitio catalítico ARNasa E. • Posibles funciones del resto de la proteína: regulación de la actividad ARNasa e interacción de la ARNasaE con la PNPasa u otras nucleasas. • La asociación física sugiere que las dos actividades tal vez actúan de forma concertada durante el procesamiento y degradación del ARN. • La degradación se iniciaría por por la unión del CP. La ARNasa E realizaría un endoclivaje y el nuevo extremo 3’ generado sería atacado por la PNPasa. • Una vez que actúa la exonucleasa, la ARNasa E se alejaría del complejo. Esto permitiría la asociación de la ARNasa E con una PNPasa libre, comenzando nuevamente el ciclo. También es posible que permanezcan asociadas durante todo el proceso.

31. FIN