生长与繁殖的概念

1. 生长与繁殖的概念 第七章 微生物的生长与控制 生长——微生物细胞吸收营养物质，进行新陈代谢，当同化作用>异化作用时，生命个体的重量和体积不断增大的过程。 繁殖——生命个体生长到一定阶段，通过特定方式产生新的生命个体，即引起生命个体数量增加的生物学过程。 发育——从生长到繁殖，是生物的构造和机能从简单到复杂、 从量变到质变的发展变化过程，这一过程称为发育。 个体生长——微生物细胞个体吸收营养物质，进行新陈代谢，原生质与细胞组分的增加为个体生长。 群体生长——群体中个体数目的增加。可以用重量、体积、密度或浓度来衡量。（由于微生物的个体极小，所以常用群体生长来反映个体生长的状况）个体生长个体繁殖 群体生长 群体生长 = 个体生长 + 个体繁殖

2. 第一节 微生物纯培养分离及生长测定第二节 微生物的生长规律第三节 影响微生物生长的主要因素第四节 微生物生长繁殖的控制

3. 第一节 微生物纯培养分离及生长测定 一、获得纯培养的方法 纯培养(pure culture)——微生物学中把在实验室条件下从一个细胞或一群相同的细胞经过培养繁殖而得到的后代,称纯培养. 单细胞：细菌、酵母菌等 多细胞：丝状真菌

4. ①液体稀释法 首先将待分离的样品进行连续稀释,目的是得到高度稀释的效果,使一支试管中分配不到一个微生物.如果经过稀释后的大多数试管中没有微生物生长,那么有微生物生长的试管得到的培养物可能就是由一个微生物个体繁殖而来的纯培养物. 这种方法适合于细胞较大的微生物.

5. ②平板划线分离法（Streak Plate） An inoculating loop is used to thin out organisms on the surface of the agar. 特点：快速、方便。 分区划线（适用于浓度较大的样品） 连续划线（适用于浓度较小的样品）

6. 划线分离后平板上显示的菌落照片（右图） 连续划线（左图）

7. ③倾注平板法（Pour Plate） Organisms are serially diluted, then a small amount is added to an empty sterile petri dish, to which melted agar at 50 ºC is added. Then mix to distribute the organisms. 1ml 1ml 1ml 9ml 9ml 9ml 9ml 1ml 1ml 1ml

8. Pour plate Pour plate

9. Pour plate Pour plate

10. ④平板涂布分离法（Spread Plate） Liquid specimen is spread on the surface of solid agar with a sterile bent glass rod. 简单易行，但易造成机械损伤

11. ⑤选择性培养分离法 为了从混杂的微生物群体中分离出某种微生物，可以根据该微生物的特点，包括营养、生理、生长条件等，采用选择培养的方法进行分离。 ＊利用选择培养基进行直接分离 ＊富集培养

12. ⑥单细胞（单孢子）分离法 采用显微分离法从混杂群体中直接分离单个细胞或单个个体进行培养以获得纯培养的方法。该方法要在显微镜下进行。 毛细管法：用毛细管提取微生物个体，适合于较大微生物。 显微操作仪：用显微针、钩、环等挑取单个细胞或孢子以获得纯培养。 小液滴法：将经过适当稀释后的样品制成小液滴，在显微镜下选取只含一个细胞的液滴来进行纯培养物的分离。

13. 二、微生物纯培养生长的测定方法 描述不同种类、不同生长状态的微生物生长情况，需选用不同的测定指标。 （一）微生物细胞数目的检测法 直接法（血球计数板、比例计数法） 间接法（活菌计数法、液体稀释法、膜过滤法） （二）微生物生长量和生理指标测定法 直接法(干重法，堆体积法) 间接法（比浊法，碳、氮含量法，其它生理指标）

14. 1.血球计数板法

15. 血球计数板法原理 原理：将1cm2×0.1mm的薄层空间划分为400小格，从中均匀分布地选取80或100小格，计数其中的细胞数目，换算成单位体积中的细胞数。 适用范围：个体较大细胞或颗粒，如血球、酵母菌等。不适用于细菌等个体较小的细胞，因为（1）细菌细胞太小，不易沉降；（2）在油镜下看不清网格线，超出油镜工作距离。 特点：快速，准确，对酵母菌可同时测定出芽率，或在菌悬液中加入少量美蓝可以区分死活细胞。

16. 2.涂片染色法 应用：可同时计数不同微生物的菌数，适 于土壤、牛奶中细菌计数。 方法：用镜台测微尺计算出视野面积；取 0.1ml菌液涂于1cm2面积上，计数后代 入公式： 每ml原菌液含菌数 =视野中平均菌数×涂布面积/视野面积 ×100 ×稀释倍数

17. 3.平板菌落计数法

18. 平板菌落计数法技术要求 ★A standard plate count (viable count) reflects the number of viable microbes and assumes that each bacterium grows into a single colony; plate counts are reported as number of colony-forming units (CFU) per ml (CFU/ml) or per g (CFU/g) of sample. ★技术要求：样品充分混匀，操作熟练快速（15~20min完成操作），严格无菌操作； ★注意事项：每一支吸管只能用于一个稀释度，样品混匀处理，倾注平板时的培养基温度； ★适用范围：中温、好氧和兼性厌氧、能在营养琼脂上生长的微生物， ★误差：多次稀释造成的误差是主要来源，其次还有由于样品内菌体分布不均匀、以及不当操作

19. Colony-Forming Unit When we observe colonies, we cannot assume each arose from just one cell originally planted on the medium, however. A pair, chain or cluster of cells which 'land' on the medium in close proximity to each other can multiply and produce a single colony. Thus, we use the term colony-forming unit when we consider the common origin for the cells of any colony." This term is usually abbreviated CFU.

21. 4.液体稀释法 10n 10n-1 10n-2

23. 5.薄膜过滤计数法 常用该法测定含菌量较少的空气和水中的微生物数目。 将定量的样品通过薄膜（硝化纤维素薄膜、醋酸纤维薄膜）过滤，菌体被阻留在滤膜上，取下滤膜进行培养，然后计算菌落数，可求出样品中所含菌数。

24. 6.干重法 将一定量的菌液中的菌体通过离心或过滤分离出来,然后烘干(干燥温度可采用105℃、100℃或80℃)、称重。一般干重为湿重的10%—20%，而一个细菌细胞一般重约10-12～10-13g。 该法适合菌浓较高的样品。 举例：大肠杆菌一个细胞一般重约10–12~10–13g，液体培养物中细胞浓度达到2×109个/ml时，100ml培养物可得10~90mg干重的细胞。

25. 7.比浊法 原理是在一定范围内，菌悬液中的细胞浓度与混浊度成正比，即与光密度成正比，菌数越多，光密度越大。因此，借助于分光光度计，在一定波长下测定菌悬液的光密度，就可反应出菌液的浓度。 特点：快速、简便；但易受干扰。

26. 8.生理指标法 • 测含氮量 蛋白质是细胞的主要物质，含量稳定，而氮是蛋白质的主要成分，通过测含氮量就可推知微生物的浓度。 一般细菌含氮量为干重的12.5%，酵母菌为7.5%，霉菌为6.0%，根据一定体积培养液中的含氮量再乘以6.25，就可测得粗蛋白的含量。 • 其他方法 含碳、磷、DNA、RNA、耗氧量、消耗底物量、产二氧化碳、产酸、产热、粘度等，都可用于生长量的测定。

27. Method Application Comments Direct microscopic count Enumeration of bacteria inmilk or cellular vaccines Cannot distinguish living from nonliving cells Viable cell count (colonycounts) Enumeration of bacteria in milk, foods, soil, water, laboratory cultures, etc. Very sensitive if plating conditions are optimal Turbidity measurement Estimations of large numbers of bacteria in clear liquid media and broths Fast and nondestructive, but cannot detect cell densities less than 107 cells per ml Measurement of total N or protein Measurement of total cell yield from cultures very dense only practical application is in the research laboratory Measurement of Biochemical activity e.g. O2 uptake CO2 production, ATP production, etc. Microbiological assays Requires a fixed standard to relate chemical activity to cell mass and/or cell numbers Measurement of dry weight or wet weight of cells or volume of cells after centrifugation Measurement of total cell yield in cultures  probably more sensitive than total N or total protein measurements Table 1. Some Methods used to measure bacterial growth

28. 第二节 微生物的生长规律 一、微生物的个体生长和同步生长 • 由于微生物细胞极其微小，研究其个体生长存在着技术上的困难。 • 同步生长的概念：一个细胞群体中各个细胞都在同一时间进行分裂的状态，称为同步生长（synchronous growth） ，进行同步分裂的细胞称为同步细胞。 • 同步细胞群体在任何一时刻都处在细胞周期的同一相，彼此间形态、生化特征都很一致，因而是细胞学、生理学和生物化学等研究的良好材料

29. 获得同步生长的方法 获得同步生长的方法主要有两类： 环境条件诱导法：变换温度、光线、培养基等。造成与正常细胞周期不同的周期变化。 选择法：选择性过滤、梯度离心。物理方法，随机选择，不影响细胞代谢。

30. Helmstetter-Cummings 法 原理：一些细菌细胞会紧紧粘附于硝酸纤维微孔滤膜上。 步骤：菌悬液通过微孔滤膜，细胞吸附其上；反置滤膜，以新鲜培养液通过滤膜，洗掉浮游细胞；除去起始洗脱液后就可以得到刚刚分裂下来的新生细胞，即为同步培养。

31. Figure .synchronous growth Figure 5.  The synchronous growth of a bacterialpopulation.  By careful selection of cells that havejust divided, a bacterial population can besynchronized in the bacterial cell division cycle.Synchrony can be maintained for only a few generations.

32. 二、微生物的群体生长 1.无分支单细胞微生物的群体生长特征 ☆无分支单细胞微生物主要包括细菌和酵母菌，其群体生长 是以群体中细胞数量的增加来表示的。 ☆ 由一个细胞分裂成为两个细胞的时间间隔称为世代，一个世代所需的时间就是代时（Ｇeneration time, G ），代时也就是群体细胞数目扩大一倍所需 时间，有时也称为倍增时间。 ☆右图表示的是一个细胞经过若干代分裂后的情况。右图可见，每经过一个代时，细胞数目就增加一倍，呈指数增加，因而被称为指数生长，这就是单细胞群体生长的特征。

33. 1.无分支单细胞微生物的群体生长特征 By definition, bacterial growth is cell replication – i.e., growth of the culture. Most species of bacteria replicate by binary fission, where one cell divides into 2 cells, the 2 cells into 4, the 4 into 8, etc. If this cell division occurs at a steady rate – such as when the cells have adequate nutrients and compatible growing conditions – we can plot numbers of cells vs. time such as on the graph at right. Before too long, we will need to extend the paper vertically as the population continues to double. For a culture where cells divide every 20 minutes, one cell can result in 16,777,216 (i.e., 224) cells after just 8 hours – barring nutrient depletion or other growth-altering conditions.

34. If we were to convert our vertical axis to a logarithmic scale – as on the graph at right – we will not need as many sheets of graph paper, and we will find that a steady rate of growth is reflected as a straight line. (On the vertical axis, the same distance on the paper is covered with each doubling.) This type of graph paper is called semilogarithmic graph paper on which we will be plotting our class results. The numbers we plot will fall on the graph at the same place the logarithms of these numbers would fall when plotted on conventional graph paper.

35. The example at right shows the type of graph we may obtain from our class data. We can plot both colony-forming units (CFUs) per ml and absorbance on the same graph, remembering that the absorbance units should also be on a logarithmic scale. Rather than "connecting the dots," we draw the best straight line among our CFU/ml plots to represent the phases of growth – lag, exponential, and the start of the maximum stationary phase.

36. 指数生长 指数生长可以用下式表示： b = B×2n B, b 和 t 可由试验获得， n 可通过上式计算得出，将等式两侧取对数重排后得： lgb = lgB + nlg2 lgb - lgB lgb - lgB   lg2 0.301 n = = 式中： B 为起始师细胞数目， b为指数生长某个时刻 t 时的细胞数目， n 为世代数

37. 例如：一培养液中微生物数目由开始的12，000（ B ），经4h （t ）后增加到49，000，000（ b ）， 这样， n ＝ (lg4.9×107－lg1.2×104）÷0.301＝12 ★借助于 n 和 t ，还可以计算出不同培养条件下的代时G， G ＝ t / n 在本例中， G ＝4×60 / 12 ＝20min ∴该种微生物的代时为20分钟。在4小时内共繁殖了12代。

38. ★代时能够反应细菌的生长速率，代时短，生长速率快，代时长，生长速率慢。在很多微生物学研究中常常要了解微生物的代时。★代时能够反应细菌的生长速率，代时短，生长速率快，代时长，生长速率慢。在很多微生物学研究中常常要了解微生物的代时。 ★代时在不同种微生物中的变化很大，多数微生物的代时为1~3h,然而有些快速生长的微生物的代时还不到10min,而另一些微生物的代时却可长达几小时或几天；另外，同一种微生物，在不同的生长条件下其代时的长短也不同；但是，在一定条件下，每一种微生物的代时是恒定的，因此它是微生物菌种的一个重要特征。

39. 一些细菌的代时

40. Table . Generation times for some common bacteria under optimal conditions of growth. Bacterium Medium Generation Time (minutes) Escherichia coli Glucose-salts 17 Bacillus  megaterium Sucrose-salts 25 Streptococcuslactis Milk 26 Streptococcus lactis Lactose broth 48 Staphylococcus aureus Heart infusion broth 27-30 Lactobacillus acidophilus Milk 66-87 Rhizobiumjaponicum Mannitol-salts-yeast extract 344-461 Mycobacterium tuberculosis Synthetic 792-932 Treponema pallidum Rabbit testes 1980

41. 不同温度下的代时

42. 2.无分支单细胞微生物的群体生长曲线 ☆以细菌为例介绍无分支单细胞微生物群体生长规律，其结论也基本适用于酵母菌。 ☆生长曲线代表了细菌在新的环境中从开始生长、分裂直至死亡的整个动态变化过程。 ☆每种细菌都有各自的典型生长曲线，但它们的生长过程却有着共同的规律性。一般可以将生长曲线划分为四个时期。

43. 生长曲线的制作 将少量单细胞的纯培养，接种到一恒定容积的新鲜液体培养基中，在适宜条件下培养，每隔一定时间取样，测菌细胞数目。以培养时间为横坐标，以细菌增长数目的对数为纵坐标，绘制所得的曲线。

44. 典型的生长曲线 （Growth curve） 延滞期 对数期 稳定期 衰亡期 时期的划分：按照生长速率常数（growth race constant）不同

45. 一条典型的生长曲线至少可以分为迟缓期、对数期、稳定期和衰亡期等四个生长时期。

46. .

47. ①延滞期（lag phase） • 其它名称：停滞期、调整期、适应期 • 1.现象：活菌数没增加，曲线平行于横轴。 2.特点： • 生长速率常数= 0 • 细胞形态变大或增长 • 细胞内RNA特别是rRNA含量增高，原生质嗜碱性增强 • 合成代谢活跃（核糖体、酶类、ATP合成加快），易产生诱导酶 • 对外界不良条件敏感，（如氯化钠浓度、温度、抗生素等化学药物） 3.原因：适应新的环境条件，合成新的酶，积累必要的中间产物

48. ★影响延迟期长短的因素 ◆菌种 ： 繁殖速度较快的菌种的延迟期一般较短； ◆接种物菌龄 ： 用对数生长期的菌种接种时，其延迟期较短，甚至检查不到延迟期； ◆接种量：一般来说， 接种量增大可缩短甚至消除延迟期（发酵工业上一般采用1/10的接种量）； ◆培养基成分： ◇在营养成分丰富的天然培养基上生长的延滞期比在合成培养基上生长时短；◇接种后培养基成分有较大变化时，会使延滞期加长，所以发酵工业上尽量使发酵培养基的成分与种子培养基接近。

49. 认识延迟期的特点及形成原因对实践的指导意义认识延迟期的特点及形成原因对实践的指导意义 ◆在发酵工业上需设法尽量缩短延迟期 采取的缩短lag phase 的措施有： ①增加接种量； （群体优势----适应性增强） ②采用对数生长期的健壮菌种； ③调整培养基的成分，在种子基中加入发酵培养基的某些成分。 ④选用繁殖快的菌种 ◆在食品工业上，尽量在此期进行消毒或灭菌

50. ②对数期（logarithmic phase） • 其他名称：指数期 • 现象：细胞数目以几何级数增加，其对数与时间呈直线关系。 • 特点： 生长速率常数最大，即代时最短 细胞进行平衡生长，菌体大小、形态、生理特征等比较一致 代谢最旺盛 细胞对理化因素较敏感 影响因素： 菌种 营养成分 营养物浓度﹡ 培养温度