השמר נאלץ להתמודד עם השינויים, באמצעות מנגנוני הגנה. מנגנון התגובה לאוסמולריות חיצונית גבוהה :

1. Unique and redundant roles for HOG MAPK pathway components as revealed by whole-genome expression analysis – O’Rourke and Herskowitz(2003)

2. השמר נאלץ להתמודד עם השינויים, באמצעות מנגנוני הגנה. מנגנון התגובה לאוסמולריות חיצונית גבוהה: שמירת המים בתוך התא פירוק חומרי תשמורת ליצירת גליצרול בתא שרשרת סיגנאלים חישת אוסמולריות גבוהה מסלול הסיגנאלים מכונה בקיצור מסלול HOG (High Osmolarity Glycerol)

3. שני סנסורים שונים לאוסמולריות גבוהה: Sln1 ו Sho1 למסלול ה HOG יש שני ענפים upstream שמשתלבים. MAP KKK’s MAP KK MAP K כשמשופעל – טרנסלוקציה לגרעין ושם מזרחן פקטורי שעתוק.

4. מטרת המחקר של או'רורק והרשקוביץ: הבנה טובה יותר של תפקידי הרכיבים השונים במסלול ה HOG. דמיון והבדלים בתפקידי הרכיבים. * המחקר מתייחס למנגנון התגובה לאוסמולריות גבוהה בהיבט הגנטי – שעתוקי.

5. שלבי המחקר : • תגובה למומסים שונים. • גנים תלויי HOG1 בתגובה לאוסמולריות גבוהה. • תפקידי רכיבים שונים במסלול HOG בתגובה לאוסמולריות גבוהה. • הבדלים בתגובה לאוסמולריות מתונה. • שרידות ושגשוג של תרביות התאים מהם נמדד הרנ"א.

6. א. מומסים. בתאי שמר wild type, שני ניסויים מקבילים: 1M סורביטול, 0.5M KCl. בכל ניסויי 10 נק' זמן בחשיפה של 180 דקות. בכל נק' זמן – "מדידה".

7. תוצאות שני הניסויים מאד דומות. 2277 גנים נמצאו "מבוקרי אוסמולריות". גנים עבורם היה הבדל. בתגובה ל KCl ביטויים הוגבר, ובתגובה לסורביטול ביטויים נשאר רגיל.

8. מספר הגנים המבוקרים: השמר הגיב מהר יותר ל KCl. יותר גנים נמצאו מבוקרי-KCl מאשר מבוקרי-סורביטול. שחור – מס' גנים שבוקרו ע"י 0.5M KCl. לבן – מס' גנים שבוקרו ע"י 1M סורביטול.

9. עצמת השינוי בביטוי : גנים הוגברו או הושתקו בעצמה גבוהה יותר בתגובה ל KCl לעומת סורביטול. שחור – עצמת התגובה הממוצעת ל 0.5M KCl. לבן – עצמת התגובה הממוצעת ל 1M סורביטול.

10. בגלל התגובה המהירה, הרבה והחזקה יותר ל KCl החליט הצוות להמשיך ולערוך את הניסויים הבאים עם KCl.

11. ב. גנים תלויי HOG1. השוואה בין התנהלות wild type לבין hog1Δ בתגובה לאוסמולריות גבוהה. לכל גן המגיב לאוסמולריות גבוהה חושב יחס השפעת-המוטנט (ME): רמת ביטוי הגן במוטנט חלקי רמת ביטוי הגן ב wt. גנים, עבורם יחס ה ME היה גדול מ 3 או קטן מ , הוגדרו תלויי-HOG1.

12. נמצאו 579 גנים תלויי- HOG1 ובאנליזת הצברה אובחנו 6 תבניות ביטוי כלליות שונות. צבר 2: גנים שזקוקים ל HOG1 לביטוי הבזאלי ובחלקם גם להגברה קטנה באוסמולריות גבוהה. ביניהם גנים מוכרים לגליצרול-3-פוספטאז. צבר 6: גנים שב wt עוברים השתקה זמנית בתגובה לאוסמולריות גבוהה, אך במוטנט עוברים השתקה מתמשכת. ביניהם גנים לתת יחידות ריבוזומאליות, שממחקרים קודמים התגלה שעוברים רפרסיה בתגובות לעקות שונות. צבר 5: כמו בצבר 4, אך באופן קיצוני יותר. כאן ובצבר 4 גנים רבים שמוגברים בתגובה לעקות נוספות ומשויכים לקבוצת גנים כלליים ל stress (ESR). צבר 4: גנים שהוגברו בשני הגזעים, אך ב wt ההגברה היתה זמנית ובמוטנט ממושכת יותר. צבר 1: גנים שהוגברו "בצורה לא-אופיינית" במוטנט. ביניהם גנים בעלי תפקיד ידוע בתגובה לפרומון ההזדווגות או ב filamentous growth . צבר 3: גנים שבמוטנט חסרו את ההגברה שהיתה ב wt בתגובה לאוסמולריות גבוהה. צברים 4, 5 ו 6. שינוי זמני בביטוי ב wt. שינוי ממושך במוטנט. ל HOG1 יש תפקיד בחזרה לשגרה.

13. מפני שעיקר הרגולציה לאוסמולריות גבוהה ב wt התרחשה ב 40 הדקות הראשונות, החליט הצוות לערוך את הניסויים הבאים רק במשך 40 דקות ולמדוד בזמנים 0, 10, 20, 30 ו 40 דקות.

14. ג. רכיבים שונים במסלול ה HOG. השוואה בין גזעים שונים: גזע הבר ומוטנטים שונים. דמיון והבדלים בתבניות הביטוי הגנומיות בתגובה לאוסמולריות גבוהה (0.5M KCl).

15. תוצאה: תבניות הביטוי של המוטנטים hog1Δ ו pbs2Δכמעט זהות. מסקנה: תפקידו היחיד של החלבון Pbs2 הוא לשפעל את HOG1.

16. מוטנט ה (ssk1Δ+ste11Δ) חוסם את שני הנתיבים הידועים לשפעול Pbs2 (ו HOG1). תוצאה:הבדלים בין המוטנט הכפול ובין pbs2Δ ו hog1Δ. הגברה שתלוייה ב Pbs2 וב HOG1. סיום השתקה זמנית. מסקנה: ישנם עוד קלטים לשפעול Pbs2, מלבד Ste11 ו Ssk1.

17. האם הסנסור Sho1 הוא היחיד הגורם לשפעול Ste11 באוסמולריות גבוהה? נבדקו שני מוטנטים כפולים: ו ssk1Δ+sho1Δ (כחול). ssk1Δ+ste11Δ (אדום) תוצאה: בגזע עם המוטציה ל Sho1 (כחול) השפעה פחות חמורה. מסקנה: קיים סנסור נוסף שגורם לשפעול Ste11 בתגובה לאוסמולריות גבוהה.

18. האם יש כפילות בתפקיד שני הענפים upstream, בתגובה לאוסמולריות גבוהה? הושוו גזעים מוטנטים: ste11Δ, ssk1Δ ו sho1Δ. תוצאות: הביטוי היהדומה לביטוי ב wt. מסקנה: בתגובה לאוסמולריות גבוהה, יש כפילות בתפקיד של שני הענפים.

19. ד. האם יש כפילות גם עבור ריכוזים נמוכים יותר ? כדי לבדוק זאת הושוו גזע הבר וגזעים מוטנטים בתגובה לריכוזים נמוכים יותר : 0.0625M KCl ו 0.125M KCl.

20. מסקנה: בריכוזים מתונים של KCl ענף אחד פעיל, בעוד שהענף השני לא פעיל. ז"א אין כפילות פונקציונלית בריכוזים מתונים. ריכוזים נמוכים. אפשר להסתדר ללא Ste11, אבל לא ללא Ssk1. ריכוז גבוה. כפילות. אפשר להסתדר ללא כל אחד מהענפים.

21. ה. תרבית התאים. פרופילי הביטוי הגנומי הנ"ל מציגים את רמת השעתוק בתא. כיצד מגיבים התאים בכלל (מעבר לרמת הרנ"א) ? בדקו את שגשוג תרביות הגזעים הנבדקים.

22. נמצא שב 0.5M KCl, תרבית המוטנט הכפול ל Ste11 ול Ssk1 לא שרדה, אך כן שרדה ב 0.123M KCl .

23. סיכום הממצאים, מסקנות והשערות: • תגובה מהירה וזמנית. • זמן חשיפה מספיק - 40 דקות. • ל HOG1 תפקיד בבקרת עוצמת הגנים, ובחזרה לשגרה. • שני הענפים upstream - כפילות באוסמולריות גבוהה, אבל באוסמולריות מתונה רק אחד מהם עובד.

24. המערכת האמיתית מורכבת יותר ממה שהיה ידוע קודם. ? ?

25. פער בין תוצאות פרופילי הביטוי הגנומיות לבין תוצאות התרבית in vivo. למוטנטים החסרים את Ssk1 יש ליקויים חמורים בהגברת גנים בריכוזים הנמוכים יותר, ובכל זאת התרביות של שני המוטנטים הללו שרדו ב 0.125M KCl. לסיכום השיטה ושני המאמרים

26. בעיות בשיטה : • בדיקת ביטוי גנים רק ברמת הרנ"א. במאמר של או'רורק והרשקוביץ אכן נראתה סתירה בין ממצאי שעתוק הגנים לבין התפתחות התאים בתרבית. • ייצוג הגנים ע"י וקטור של תבניות ביטוי הוא הפשטה. בשני המחקרים התחשבו בכך והשתדלו שהוקטור לכל גן יהווה מדגם מייצג/מאפיין : - הצוות של גאש בחן מגוון רחב של תנאים ונתן משקלים מושכלים לכל המדידות. - הצוות של או'רורק והרשקוביץ בדק את מסגרת הזמן ונק' הזמן המייצגות, שיהוו תיאור טוב עבור תגובת התא.

27. מקורות: • Eisen MB et al. (1998) Cluster analysis and display of genome-wide expression patterns. Proc Natl Acad Sci U S A. 95(25):14863-14868. • O'Rourke SM, Herskowitz I. (2004) Unique and redundant roles for HOG MAPK pathway components as revealed by whole-genome expression analysis. Mol Biol Cell. 15(2):532-42. • Gasch AP et al. (2000) Genomic expression programs in the response of yeast cells to environmental changes. Mol Biol Cell. 11(12):4241-4257.