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ESTUDIO DE LA SECUENCIA PEPTÍDICA PowerPoint PPT Presentation


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ESTUDIO DE LA SECUENCIA PEPTÍDICA. Las proteínas son polipéptidos con una secuencia de aminoácidos definida genéticamente Esta secuencia de aminoácidos constituye la estructura primaria de la proteína y es el nivel fundamental en el que se basan los niveles más elevados

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ESTUDIO DE LA SECUENCIA PEPTÍDICA

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ESTUDIO DE LA SECUENCIA PEPTÍDICA

Las proteínas son polipéptidos con una secuencia de aminoácidos definida genéticamente

Esta secuencia de aminoácidos constituye la estructura primaria de la proteína y es el nivel fundamental en el que se basan los niveles más elevados

La secuencia de una proteína es similar entre especies pero no es idéntica

Las proteínas han evolucionado mediante cambios en sus secuencias de aminoácidos. Algunos cambios son conservadores y otros no conservadores


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Método experimental

(Actualmente existen secuenciadores automáticos)

  • 1ª Fase: Determinar la composición de aa

    • Hidrólisis ácida

    • Cromatografía

DETERMINACIÓN DE LA SECUENCIA DE AMINOÁCIDOS DE UNA PROTEÍNA: SECUENCIACIÓN

1953: Sanger secuenció la insulina

2ª Fase: Identificar el aa N-terminal

Marcar el aa N-terminal

1-fluor-2,4 dinitrobenceno (DNF) (der. amarillo)

Cloruro de dansilo (ClDNS) (Der. Fluorescente)

Hidrólisis del péptido

Separación de aa (electroforesis, cromatografía)

Identificación del aa marcado


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  • Identificación del residuo C-terminal

  • Hidrazina (NH2-NH2): rompe enlaces peptídicos y forma derivados de hidrazina con todos los aa excepto el C-terminal

  • Carboxipeptidasa A: hidroliza el último enlace peptídico

  • 3ª Fase: Degradación de EDMAN

    • Marcar el aa N-terminal con fenilisotiocianato (PITC) en medio alcalino (se forma el derivado feniltiocarbanilo)

    • Se hidroliza el enlace peptídico entre los residuos 1 y 2

    • (medio ácido anhidro fuerte)

    • Se identifica el derivado del residuo N-terminal por HPLC

    • El resto del polipéptido sigue intacto por lo que puede repetirse el proceso para determinar el 2º aminoácido

    • Por repetición continuada puede secuenciarse el polipéptido desde el extremo N-terminal


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Después de la hidrólisis

Amarillo, se extrae con cloroformo (los demás productos de hidrólisis ionizados no se extraen)

Cloruro de dimetilaminonaftalen-5-sulfonilo

DNS-Cl

Cloruro de dansilo

Después de la hidrólisis

Análogo a FDNB pero fluorescente (detecta cantidades mínimas)

Reactivos para identificar NH2 terminales

2,4-dinitrofluorbenceno

FDNB Sanger


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Hidrazinolisis

NH2-NH2

Después de la hidrólisis

NH2-NH2

El terminal queda libre y los demás como hidracidas

Reactivos para identificar COOHterminales


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Marcaje

1ª vuelta

Liberación

Marcaje

2ª vuelta

Liberación

DEGRADACIÓN DE EDMAN

“Bioquímica” Stryer, Berg y Tymoczko Ed. Reverté, S.A. 2003


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SECUENCIACIÓN DE PROTEÍNAS


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“Bioquímica” Mathews, van Holde y Ahern. Addison Wesley 2002


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