Metody molekulární biologie v ekologii a systematice rostlin
This presentation is the property of its rightful owner.
Sponsored Links
1 / 28

Metody molekulární biologie v ekologii a systematice rostlin 10 . RAPD, ISSR apod. PowerPoint PPT Presentation


  • 64 Views
  • Uploaded on
  • Presentation posted in: General

Metody molekulární biologie v ekologii a systematice rostlin 10 . RAPD, ISSR apod. Petr Koutecký & Jiří Košnar, 201 3. Vytvořeno v rámci projektu Molekularizace biologických oborů PřF JU reg. č. CZ.1.07/2.2.00/15.0364. RAPD – princip.

Download Presentation

Metody molekulární biologie v ekologii a systematice rostlin 10 . RAPD, ISSR apod.

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation

Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author.While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server.


- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - E N D - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

Presentation Transcript


Metody molekul rn biologie v ekologii a systematice rostlin 10 rapd issr apod

Metody molekulární biologie v ekologii a systematice rostlin

10. RAPD, ISSR apod.

Petr Koutecký & Jiří Košnar, 2013

Vytvořeno v rámci projektu Molekularizace biologických oborů PřF JU

reg. č. CZ.1.07/2.2.00/15.0364


Rapd princip

RAPD – princip

  • Random amplified polymorphic DNA (Williams et al. 1990)

  • Hledáme polymorfismus DNA pomocí PCR reakce s1 arbitrárním primerem

  • Sekvenci primeru volíme „náhodně“:

    • obvykle dekanukleotid

    • počet různých dekanukleotidů: 410 = 1048576

    • volí se primery se zvýšeným (60-70%) obsahem GC → stabilnější vazba při PCR (annealing, extenze při 72°C)

  • V praxi se sekvence primerů „naslepo“ zkouší:

    • test většího počtu primerů

    • výběr těch, které dávají vhodné banding pattern (dost variability a zároveň jednoznačné vyhodnocení výsledků)


Rapd princip1

nic

(orientace)

nic

(moc daleko)

RAPD – princip

  • PCR reakce proběhne, pokud:

    • jsou přítomny komplementární sekvence k primerům na protilehlých vláknech DNA

    • jsou dostatečně blízko u sebe

  • separace fragmentů elektroforézou na základě délky

  • jsou vzorce na výpočet očekávaného počtu proužků (např. Williams et al. 1993), ale nefungují


Rapd gel

http://pgrc3.agr.ca/

RAPD gel

  • agarosa (horizontální) nebo polyakrylamid (vertikální)

  • barvení EtBr, SYBR green, GelRed apod.

    • ideálně po proběhnutí ELFO, post-staining (minimalizace deformací a posunů proužků)

  • vyhodnocení: přítomnost / nepřítomnost proužku

    • dominantní data (0 / 1)


Rapd vznik varibility

kodominantní

RAPD – vznik varibility

  • Mutace v místě nasedání primerů (zánik / vznik místa)

většinou detekovatelný jen kratší produkt

  • Inzerce / delece v amplifikovaném úseku

  • Inverze apod.


Rapd metodick probl my

RAPD – metodické problémy

  • Metoda velmi citlivá na reakční podmínky PCR

    • koncentrace a čistota DNA

    • koncentrace primerů, Mg2+, polymerasy, složení pufru,…

    • konkrétní průběh teploty (rychlost zahřívání,…) → nutno používat stejný cykler

  • Relativně nízká teplota annealingu (35-45°C)

    • mismatched priming = amplifikace i z míst, kde primery nesedají zcela přesně (mírně odlišná sekvence)

    • zásadních ± 8 nukleotidů na (3’ konci), zbytek nemusí nasedat přesně

    • zejména u kratších fragmentů mohou vznikat stabilní smyčky z daného vlákna DNA (konce mají komplementární sekvenci!) → horší amplifikace


Rapd metodick probl my1

RAPD – metodické problémy

  • Neznámá genetická podstata proužků

    • nejistá homologie

    • dominance (nepoznáme heterozygoty), ale ne vždy

      • až 5% kodominatních proužků (Williams et al. 1990)

    • neznámá dědičnost (nukleární vs. organelové)

      • biperentální vs. uniparentální

    • kompetice primerů apod.

      • ve směsi DNA dvou různých organismů se neamplifikují proužky z obou stejně (pokud se mírně liší sekvence v místech nasedání primeru)

      • mohou vznikat heteroduplexy (2 různě dlouhá vlákna) → jiná mobilita při elfo

      • může nastat v genomu hybridů, allopolyploidů,…

    • nespecifičnost – amplifikuje jakoukoliv DNA

      • endofytické houby, epifytické řasy,…


Rapd standardizace

RAPD - standardizace

  • vyhodnocujeme jako dominantní data (0 / 1)

  • intenzita proužků se neuvažuje

    • mohou být heterozygoti, ale nemusí

  • obecně slabé produkty se neuvažují

    • raději méně spolehlivých znaků nežvíce, ale nespolehlivých

  • krátké fragmenty (< 100 bp) se většinou neuvažují

    • zvyšuje se nejistota homologie

  • podobně i u příliš dlouhých fragmentů

    • 1700 bp je na agarose téměř nerozlišitelné od 2000 bp

  • všechny analýzy provádět stejně a na stejném cykleru

  • všechny vzorky 2× (včetně extrakce!)

    • uvažují se jen pozice, kde jsou opakování shodná


Rapd srovn n s jin mi metodami

Výhody

není nutná znalost genomu (univerzální metoda)

relativně málo DNA

jednoduchost a rychlost

cena

fragmenty (teoreticky) rozmístěny po celém genomu

velké množství (~ desítky až stovky) polymorfních fr.

RAPD – srovnání s jinými metodami

Nevýhody

  • citlivost na reakční podmínky, nesrovnatelnost mezi laboratořemi → někteří recenzenti zamítají publikace založené na RAPD...

  • dominantní data

  • nejistá homologie fragmentů atd.

  • neznámá dědičnost fragmentů


Metody molekul rn biologie v ekologii a systematice rostlin 10 rapd issr apod

nic

(orientace)

nic

(moc daleko)

flanking sequence

CACACACACACACACACA

flanking sequence

ISSR

  • Inter-simple sequnce repeats (Zietkiewicz 1994)

  • podobný princip jako RAPD

  • jako primery slouží mikrosatelitové sekvence

    • mikrosatelit (= simple sequence repeat, SSR) je jeden z typů repetitivních sekvencí - několikanásobné opakování krátkého (2-6 bp) sekvenčního motivu za sebou

  • amplifikují se úseky mezi dvěma mikrosatelity stejné sekvence a opačné orientace


Metody molekul rn biologie v ekologii a systematice rostlin 10 rapd issr apod

ISSR

  • menší citlivost na reakční podmínky než RAPD

  • primery delší (cca 18-20 bazí) než u RAPD

    • vyšší teplota annealingu (~45-60°C) → přesnější amplifikace (menší intenzita mismatched priming)

  • primery zahrnující několik bazí flanking sequence = anchored(„ukotvené“, např. GAGAGAGAGAGAGAGAYC) vs. unanchored (GAGAGAGAGAGAGAGA)

    • anchored primers neamplifikují vždy („selektivní báze“)

  • někdy používán touch-down postup

    • vyšší teplota annealingu v prvních cyklech PCR → specifičtější amplifikace, i když menší výtěžek

    • v dalších cyklech nižší teplota → vyšší výtěžek, specifita zajištěna předešlými cykly


Issr gely

ISSR - gely

  • separace fragmentů na gelu (agarosa n. polyakrylamid); finální analýza:

    • dlouhé gely (aspoň ~40x40 cm); agarosa 1-1.5% w/v, 80V přes noc

    • post-staining


Issr gely1

ISSR - gely

  • separace fragmentů na gelu (agarosa n. polyakrylamid); finální analýza: všechny vzorky 2x

KOR

KAR

BAL

KEP

SAF

RYL

SKA

SKR

49 T

47

48

25

26

50

52 T

53 T

111

113 T

114 T

123

124

125

131

132

159

160

164

12

13

24

11

112

Carex, Jan Košnar

1st run


Issr gely2

ISSR - gely

  • separace fragmentů na gelu (agarosa n. polyakrylamid); finální analýza: všechny vzorky 2x

KOR

KAR

BAL

KEP

SAF

RYL

SKA

SKR

49 T

47

48

12

13

24

25

26

50

52 T

53 T

111

113 T

114 T

123

124

125

131

132

159

160

164

11

112

Carex, Jan Košnar

2nd run


Issr fragmenta n anal za

ISSR – fragmentační analýza

  • separace fragmentů v sekvenátoru → fragmentační analýza

  • fluorescenčně značené primery

    • pozn.: optimalizace – značený a neznačený primer stejné sekvence se může lišit v požadavcích na jednotlivé parametry PCR

  • separace fragmentů kapilární elekroforézou v sekvenátoru

    • vzorky nemigrují v čase lineárně, proto přidáván velikostní standard (směs fragmentů DNA o známé délce)

    • možnost kombinovat několik primerů značených různou barvou

    • v naší laboratoři až 4 barvy (6FAM, VIC, NED, PET) + 5 barva size standard (LIZ)


Issr fragmenta n anal za1

ISSR – fragmentační analýza

Centaurea, J. Karásek & P. Koutecký


Issr srovn n s jin mi metodami

ISSR – srovnání s jinými metodami

  • jako RAPD, ale spolehlivější, méně citlivé na reakční podmínky

Výhody

  • není nutná znalost genomu (univerzální metoda)

  • relativně málo DNA

  • jednoduchost a rychlost

  • cena

  • fragmenty (teoreticky) rozmístěny po celém genomu

  • velké množství (~ desítky až stovky) polymorfních fr.

Nevýhody

  • dominantní data

  • nejistá homologie a neznámá dědičnost fragmentů

  • somatické mutace (nadhodnocují diverzitu)

  • do jisté míry citlivost na reakční podmínky, nepřenositelnost pro jiné studie, nutnost optimalizace primerů


Dal podobn metody

Další podobné metody

  • DNA amplification fingerprinting (DAF)

    • velmi krátké primery (5 nukleotidů)

    • různé teploty annealingu (vysoké i nízké)

  • Arbitrarily primed PCR (AP-PCR)

    • delší primery (≥ 20 nukleotidů)

    • na začátku několik cyklů s nízkou t annealingu (mismatch), následně cykly s vysokou t annealingu (přesná amplifikace)

  • Sequence-characterised amplified regions (SCAR)

    • osekvenování vybraných RAPD proužků (vyříznutí, klonování)

    • specifické primery (≥ 20 nukleotidů) komplementární ke koncům

    • primery jsou specifické pro daný lokus – lze rozlišit i kodominantní varianty

    • delší primery = vysoká reprodukovatelnost


Dal podobn metody1

Další podobné metody

  • random amplified microsatellite polymorphism (RAMP)

    • kombinace 5‘-anchored ISSR primeru a RAPD primeru

    • složité PCR cykly (primery mají různé teploty annealingu –střídání v různých cyklech)

    • ISSR primer značený (fluorescenčně n. radioaktivně) → produkty amplifikované obou stran RAPD primerem nejsou vidět

  • … a mnoho dalších metod využívajících jako primery:

    • specifické sekvence různých typů transpozonů

    • kombinace retrotranspozonů a mikrosatelitů

    • kombinace s restrikčním štěpením fragmentů


Issr aplikace

ISSR - aplikace

  • populační genetika (diverzita, fragmentace,…)

    • ochranářská

    • invazní

  • klonální a prostorová struktura populací

  • hybridizace

  • rozmnožovací systémy

  • taxonomie (vymezení a podobnost taxonů,…)

  • (fylogeografie)

  • (mezidruhové vztahy, fylogeneze)


Popula n a ochran sk genetika

www.primulaworld.com

Populační a ochranářská genetika

Crema et al. 2009, Plant Syst. Evol. 280: 29–36

  • Primula apennina, endemit

  • 6 populací „v řadě“, 9 primerů / 164 lokusů

  • relativně velká variabilita – He,, Shanon. index(sexuál, hetorostylie, daleko létající opylovač)

  • souvislost s pozicí populací (nejmíň na kraji,nejvíce v prostřední populaci)

  • tři genetické skupiny (BAPS), zřetelný tok mezi populacemi

  • potvrzeno i Mante-lovým testem(mírná pozitivní korelace)


Taxonomie

Taxonomie

Jiménez et al. 2009, Folia Geobot. 44: 145-158

  • Narcissus sect. Pseudonarcissi, Španělsko

  • spousta „podezřelých“ endemických druhů

  • 6 primerů – 89 lokusů + ITS sekvence

  • PCoA, NJ strom, (+ parsimonie pro ITS)

  • 3 výrazné skupiny v PCoA

  • nesoulad s morfologií

  • některé druhy nelze rozlišit

  • podpořeno také ITS

  • návrh revize taxonomie (spojení některých druhů)


Hybridizace

Hybridizace

Ducarme et al. 2010, Folia Geobot. 45: 387-405

  • Rhinanthus minor, R. angustifolius

  • test 100 RAPD a 100 ISSR primerů, výběr 8 druhově specifických lokusů (4 pro každý druh)

  • hybridní index: čisté druhy -4 a 4, F1 hybrid má 0, zpětní kříženci něco mezi

  • 2 přírodní populace + 1 umělá

  • vznik hybridů v umělé populaci

  • většina zpětných kříženců k Rh. angustifoliusvysvětlováno chováním opylovačů a většíautogamie u Rh. minor

  • drobné meziroční fluktuace


Hybridizace1

Hybridizace

Lo 2010, J. Evol. Biol. 23: 2249–2261

  • mangrove rodu Rhizophora, 3 základní druhy a 3 předpokládaní hybridi (morfologie, neklíčivost semen)

  • 12 ISSR primerů (+ITS, cpDNA)

  • privátní alely zákl. druhů; hybridi 0, ale celkově víc alel (součet rodičů)

  • STRUCTURE identifikuje vždyhybrida (směs)i jeho rodiče

  • NewHybrids: všechno F1 hybridi

  • každá lokalita svůj ISSR genotyp →opakovaný vznik hybridů

  • ITS, cpDNA: ukazuje naobousměrnou hybridizaci

jedna z lokalit, 3 druhy + hybrid


Rozmno ovac syst my

Rozmnožovací systémy

Han et al. 2009, Plant Syst. Evol. 277: 13–20

  • Lotos nucifera v Číně

  • sběr semen (9-20) z 20 rostlin

    + dospělé rostliny, 10 populací

  • 5 / 12 primerů (28 / 173 lokusů)

  • porovnání potomstva a mateřský r.v programu MLTR

  • velká míra cizoprášení (>90%)

  • skoro žádný inbreeding (f ~ 0)

  • mírná autokorelace (podobné zdroje pylu u blízkých mateřských rostlin)

    + obvyklá studie populací (AMOVA, Mantel test,…)


Identifikace klon

Identifikace klonů

Gross et al. 2012, Ann. Bot. 109: 331–342

  • Klonální struktura sterilních i fertilních popu-lací Greivillea rhizomatosa (Proteaceae)

  • Simpsonův index, gene diversity, modelypříbuznosti jedinců

  • 4 ISSR primery / 120 lokusů

  • velká klonální diverzita (>90%) i u sterilních populací (→ minulost)

  • somatické mutace ! 10 ze 42 ramet spojených pod zemí mělojiný genotyp

  • podle modelů 17-48% genotypů(v různých populacích) mohlo vzniknout somat. mutacemi

[pozor, jiný druh]


Prostorov z visloti n co jako fylogeografie

Prostorové závisloti (něco jako fylogeografie)

Belluci et al. 2011, Plant Biol. 13: 381-390

  • Tripodion tetraphyllum (= Anthyllistetraphylla) v sev. Africe

  • sucho, včetně intenzivních pastvin

  • 36 lokalit Maroko-Tunisko, z každésemena, z nich ale jen 2-3 kytky (celk. 94)

  • 5 ISSR primerů / 32 lokusů (+ cpSSR + 1 morfol. znak)

  • zřetelně klesající variabilita od západu k východu

  • 2 extrémní genotypy (STRUCTURE) na okrajích gradientu západ-východ, plynulý přechod (klinální variabilita)

  • relativně velké rozdíly mezi „populacemi“ (autogamie)

  • zřetelné autokorelace na škále <400 km

  • asi migrace od záp. k východu a selekce ve prospěch určitého genotypu na V okraji gradientu


Prostorov struktura populace

Prostorová struktura populace

Matesanz et al. 2011, J. Ecol . 99: 838-848

  • společná populace Thymus vulgaris (hojný)+ Th. loscosii (endemit) na ploše 10 m2

  • prostorové rozmístění jedinců v 1m2 plochách + faktory prostředí (vlhkost, půda, pokryvnost,…)

  • genetická variabilita (5 ISSR primerů pro druh)

  • obecně shlukovité rozmístění obou druhů a negativní vztah mezi nimi

  • u Th. vulgaris žádné klony, u Th. loscosii79 genotypů ze 100)

  • korelace mezi genetickou podobností Th. loscosii a abundancí Th. vulgaris – asi selekce genotypů Th. loscosii specializova-ných na určitou míru kompetice Th. vulgaris


  • Login