Le tribolazioni di una proteina di membrana
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b 6. IV. FeS. cyt f. Francesca Zito IBPC CNRS UMR 7099. Le tribolazioni di una proteina di membrana. Le proteine di membrana costituiscono il 20-30% dei genomi completamente sequenziati ma ottenera la loro struttura rappresenta ancora una sfida genoma unano: 40-60 000 geni. 60-70 %

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Le tribolazioni di una proteina di membrana

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- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - E N D - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

Presentation Transcript


Le tribolazioni di una proteina di membrana

b6

IV

FeS

cyt f

Francesca Zito

IBPC CNRS UMR 7099

Le tribolazioni di una proteina di membrana


Le tribolazioni di una proteina di membrana

Le proteine di membrana costituiscono il 20-30% dei genomi completamente sequenziati ma ottenera la loro struttura rappresenta ancora una sfida

genoma unano: 40-60 000 geni

60-70 %

proteine solubili

30-40 %

Proteine di membrana

~ 6000 strutture

~ 20 strutture


Le tribolazioni di una proteina di membrana

RMN completamente sequenziati ma ottenera la loro struttura rappresenta ancora una sfida

Biochimica

Cristallografia

Genetica molecolare

Fd

E

C

D

struttura

H

G

J

M

K

I

L

P700

funzione

N

F

PC

Biochimica Spettroscopia


Le tribolazioni di una proteina di membrana

PQ completamente sequenziati ma ottenera la loro struttura rappresenta ancora una sfida

PQ

PQ

Fd

PSII

ATP

ADP + Pi

a

b

d

b

a

b

a

e

II

I

g

E

C

D

CP43

CP47

D1

D2

A B

Qi

A0

bh

III

III

III

III

III

IV

IV-cyt b6

Lhcbi

Lhcbi

M

G

L

X

M

J

K

W

I

E

F

L

H

N

H

G

J

M

K

I

L

Lhcbi

Qo

bl

P700

R

O

N

ISP

F

P

T

PC

3 H+

Q

CP43

CP47

cyt f

2 H2O

4H+ + O2

PC

ATPsynthase

cyt b6f

PSI


Le tribolazioni di una proteina di membrana

PQ completamente sequenziati ma ottenera la loro struttura rappresenta ancora una sfida

PQ

ATP

ADP + Pi

d

II

I

b6

IV

L

bl

FeS

Q

F

P

3 H+

cyt f

2 H2O

4H+ + O2

Antennes

PSII

cyt b6f

PSI

ATPsynthase

(mitochondrie)


Le tribolazioni di una proteina di membrana

C completamente sequenziati ma ottenera la loro struttura rappresenta ancora una sfida

N

C

N

C

stroma

C

C

C

L

N

f

b6

b6

b6

b6

IV

G

M

IV

IV

Rieske

lumen

N

N

N

N

C


Le tribolazioni di una proteina di membrana

Cytochrome completamente sequenziati ma ottenera la loro struttura rappresenta ancora una sfidac oxidase

PS I

Complex I

+

PS II

2H

stromal

cytb6+IV/cytb

in

-

e

Q

QH

b

H

2

[function : b6 f & bc1]

-

e

-

e

b

QH

QH

L

2

2

out

-

-

e

+

luminal

e

2H

PC

cyt

-

e

Rieske

cyt

f/c

1


Le tribolazioni di una proteina di membrana

+ completamente sequenziati ma ottenera la loro struttura rappresenta ancora una sfida

H

-

e

PS I

+

PS II

2H

cytb6+IV

Kinase ?

-

e

State

transitions

Q

QH

b

2

H

[function : b6fvs.bc1]

-

e

-

e

b

QH

QH

L

2

2

-

-

e

+

e

2H

PC

cytc

-

e

Rieske

+

cyt

f

H


Le tribolazioni di una proteina di membrana

+ completamente sequenziati ma ottenera la loro struttura rappresenta ancora una sfida

H

-

e

PS I

?

PS II

+

2H

?

-

e

in

Q

QH

b

2

H

-

e

-

e

b

QH

QH

L

2

2

-

out

-

e

+

e

2H

PC

cyt

Rieske

Cyt f

+

H


Le tribolazioni di una proteina di membrana

Institut de Biologie Physico-Chimique completamente sequenziati ma ottenera la loro struttura rappresenta ancora una sfida

UMR 7099, CNRS/Université Paris-7

l l l l l

f R b6IV4 kDa

SDS-PAGE analysisof Chlamydomonasb6f complex

purified in Hecameg/egg PC mixed micelles

(TMBZ + silver)


Le tribolazioni di una proteina di membrana

Institut de Biologie Physico-Chimique completamente sequenziati ma ottenera la loro struttura rappresenta ancora una sfida

UMR 7099, CNRS/Université Paris-7

l l l l l

f R b6IV4 kDa

subIV

PetG

PetL

PetM

PetN

cytb6

N

C

N

C

C

C

N

stroma

C

C

) x 2

bH

β-car.

A

D

B

C

bL

Chla

N

N

N

C

lumen

N

Fe2S2

Rieske

protein

cytf


Le tribolazioni di una proteina di membrana

Institut de Biologie Physico-Chimique completamente sequenziati ma ottenera la loro struttura rappresenta ancora una sfida

UMR 7099, CNRS/Université Paris-7

l l l l l

f R b6IV4 kDa

subIV

PetG

PetL

PetM

PetN

cytb6

N

C

stroma

N

C

C

C

N

C

C

bH

β-car.

A

D

B

C

bL

Chla

N

N

N

C

lumen

N

Fe2S2

Rieske

protein

cytf

homology to bc1


Le tribolazioni di una proteina di membrana

Institut de Biologie Physico-Chimique completamente sequenziati ma ottenera la loro struttura rappresenta ancora una sfida

UMR 7099, CNRS/Université Paris-7

subIV

PetG

PetL

PetM

PetN

cytb6

N

C

stroma

N

C

C

C

N

C

C

bH

β-car.

A

D

B

C

bL

Chla

N

N

N

C

lumen

N

Fe2S2

Rieske

protein

cytf

homology to bc1

structure solved


Le tribolazioni di una proteina di membrana

Cristallizazione di una proteina di membrana completamente sequenziati ma ottenera la loro struttura rappresenta ancora una sfida

Solubilizzazione e Purificazione

- Détergente

+ Détergente

Aggregazione

Dissociazione

Manipolazione in soluzione

Cristallizazione


Le tribolazioni di una proteina di membrana

Institut de Biologie Physico-Chimique completamente sequenziati ma ottenera la loro struttura rappresenta ancora una sfida

UMR 7099, CNRS/Université Paris-7

EM on 2D crystals

3D crystals

100 µm

Crystals from Hecameg/PC solution Cryo-EM projection map

(Stroebel & Picot, unpublished) (Breyton, 2000)


Le tribolazioni di una proteina di membrana

b completamente sequenziati ma ottenera la loro struttura rappresenta ancora una sfida6 f

Purificazione del complesso selvatico

Risultato della purificazione:

- Pura, actifttiva.

- 3mg/ 20ml di membrane.

 Particolarità:

- Presenza di lipidi esogeni con ruolo stabilizzatore

- Variabilità.

- Difficile da modificare

(hydroxylapatite)

Hécameg-lipides à 4°C

Solubilisation

25mM HG

Gradient de

saccharose

20mM Hécameg

+ 0.1 g/l lipides

Colonne

d’hydroxylapatite

Ref.: Pierre et coll (1995) J. Biol. Chem. 270, 29342-29349.


Le tribolazioni di una proteina di membrana

Cristalli piccoli e difficili da riprodurre completamente sequenziati ma ottenera la loro struttura rappresenta ancora una sfida

100 mm

Ago in fase cubica

100 mm

Ref.: E. Landau & J. Rosenbuch (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 14532-14535.


Le tribolazioni di una proteina di membrana

Institut de Biologie Physico-Chimique completamente sequenziati ma ottenera la loro struttura rappresenta ancora una sfida

UMR 7099, CNRS/Université Paris-7

His6

subIV

PetG

PetL

PetM

PetN

cytb6

N

C

stroma

N

C

C

C

N

C

C

bH

β-car.

A

D

B

C

bL

Chla

N

N

N

C

lumen

N

Fe2S2

Rieske

protein

cytf


Le tribolazioni di una proteina di membrana

Purificazione di un complesso portante un etichetta poli-istidina

Solubilisation

Risultato della purificazione:

- Pura, attiva.

- 2mg /20ml di membrane.

 Particolarità:

- Possibilità di lavorare senza lipidi esogeni.

- Risultati riproduttibili.

- Protocollo rapido e flessibile

- Cristalli dopo 4 giorni

Colonne d’échange

d’ions

b6 f

FPLC

Colonne

de nickel

b6 f

FPLC

Colonne de dessalage

FPLC


Le tribolazioni di una proteina di membrana

500 µm poli-istidina

400 µm

500 µm

Cristallisation

Cyt f

Rieske

Cyt b6

SuIV

pt su

SDS-PAGE

di un cristallo

100 mm


Le tribolazioni di una proteina di membrana

b poli-istidina6

IV

FeS

cyt f

Purificazione in hecameg

i cristalli non ci soddisfano

H

Purificazione su colonna di affinità

Buoni cristalli!

b6

IV

FeS

cyt f


Le tribolazioni di una proteina di membrana

Institut de Biologie Physico-Chimique poli-istidina

UMR 7099, CNRS/Université Paris-7

400 µm

Crystal grown from C12-M solution in the presence of C13-stigmatellin


Le tribolazioni di una proteina di membrana

Institut de Biologie Physico-Chimique poli-istidina

UMR 7099, CNRS/Université Paris-7

~200 µm

Crystal in cryo-loopDiffraction pattern (ESRF line BM30A)


Le tribolazioni di una proteina di membrana

H poli-istidina

b6

IV

b6

IV

FeS

3,1 Å

FeS

cyt f

cyt f

100 mm


Le tribolazioni di una proteina di membrana

stroma poli-istidina

lumen


Le tribolazioni di una proteina di membrana

115 poli-istidinaÅ


Le tribolazioni di una proteina di membrana

b poli-istidinaH

bL

Fe2S2

f


Le tribolazioni di una proteina di membrana

b poli-istidinaH

bL

Fe2S2

c1

f

~16 Å

--- b6 f

--- bc1


Le tribolazioni di una proteina di membrana

Rieske TMH poli-istidina

Cyt f TMH

PetL

B

PetN

b6

A

E

4-kDa

subunits

PetM

PetG

C

D

F

IV

G

Cytochrome b6f transmembrane region – view from the lumen side


Le tribolazioni di una proteina di membrana

bc poli-istidina1

G

QP-C

H

F

IX

Rieske

f

c1

PetL

D

B

PetN

A

E

C

PetG

b6f

[transmembrane helices, b6f + bc1]

PetM

PetM

PetG

E

PetN

C

A

B

PetL

f

D

c1

Rieske

IX

F

QP-C

H

G

--- Chlamydomonasb6 f

--- yeast bc1(1KB9 ; Lange et al., EMBO J. 20:6591, 2001)


Le tribolazioni di una proteina di membrana

chlorophyll poli-istidinaa

2 Fo – Fc (contouring at1 σ)


Le tribolazioni di una proteina di membrana

MGDG poli-istidina


Le tribolazioni di una proteina di membrana

chlorophyll poli-istidinaa

C13-stigmatellin


Le tribolazioni di una proteina di membrana

-carotene poli-istidina


Le tribolazioni di una proteina di membrana

Cys35 poli-istidina


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