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　实验四 DNA 的提取

　实验四 DNA 的提取. 生命科学学院 沈剑敏. 　实验目的. １．学习一种提取 DNA 的方法 — 氯仿和去污剂相结合 ２．了解在核酸提取中一些试剂的作用. 　实验原理. 在核酸分子中，由于磷酸基的存在，使其酸性占优势， DNA 或 RNA 都能溶于水中，而不溶于有机溶剂。 在 0.14mol/LNaCl 溶液中 RNP 或 RNA 有相当大的溶解度 ; 而 DNP 或 DNA 在 1 ～ 2mol/LNaCl 溶液中有相当大的溶解度 , 据此可以初步把它们分开。

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　实验四 DNA 的提取

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Presentation Transcript

  1. 　实验四 DNA的提取 生命科学学院 沈剑敏

  2. 　实验目的 １．学习一种提取DNA的方法—氯仿和去污剂相结合 ２．了解在核酸提取中一些试剂的作用

  3. 　实验原理 • 在核酸分子中，由于磷酸基的存在，使其酸性占优势， DNA或RNA都能溶于水中，而不溶于有机溶剂。 • 在0.14mol/LNaCl溶液中RNP或RNA有相当大的溶解度;而DNP或DNA在1～2mol/LNaCl溶液中有相当大的溶解度, 据此可以初步把它们分开。 • 用络合剂EDTA抑制核酸水解酶的活力, 同时用去污剂SDS把蛋白质和DNA分开,再用氯仿-异丙醇作为蛋白质的变性剂沉淀蛋白质, 最后用乙醇把DNA沉淀出来。

  4. 主要试剂和器材 1. 1×ssc溶液: 0.15 mol/L NaCl- 0.015 mol/L柠檬酸钠 2. 0.15 mol/L NaCl- 0.14 mol/L EDTA 3. 10% SDS 4. 5 mol/L NaCl 5. 氯仿- 异丙醇 ( 24:1 ) 6. 95% 乙醇 7. 电子天平 8. 离心机 9. 恒温水浴

  5. 提取流程 2. 绞碎肝脏称取5g,加3mL 1×ssc溶液研磨 3.用40mL1×ssc溶液将肝糜转移至离心管内,平衡后3000r.p.m10min 1. 将兔子迅速杀死, 取出肝脏, 用1×ssc溶液洗涤 5. 沉淀物悬于25mL pH 8.0的0.15 mol/L NaCl- 0.14 mol/L EDTA中 4. 弃去上清夜,重复第3步, 再去上清 6. 缓慢滴加10%SDS溶液3mL, 边加边搅 9. 加入40mL氯仿-异丙醇混合液, 激烈摇动20min 7. 60℃恒温水浴保温10 min, 不断搅动,溶液变为粘稠并略有透明 8. 取出, 冷却, 加5mol/L NaCl 8mL 10. 3000r.p.m离心 5min. 离心后的混合物分为三层 12. 用玻璃棒轻轻缠出DNA丝状物 11. 吸取上清夜, 放到30mL95%的乙醇中

  6. 注意事项 • 离心前一定要连同离心管、铁套、离心管盖子和支架平衡 • 混合物液面高度不能超过离心管的2/3，超过的话，分装在两个离心管内 • 第10步离心后的分层情况： 实验结束后请勿将肝糜倒入水槽内 危险 DNA，DNP 变性蛋白，肝糜 氯仿

  7. 思考题 1. 根据核酸在细胞内的分布、存在方式及其特性，提取过程中采取了什么相应的措施？ 2. 试述保温的温度为什么选择60℃恒温水浴？ 3. 上述提取流程第8步中, 加入8mL的5mol/L NaCl溶液是什么目的?

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