CYTOLOGICKÁ TECHNIKA

1. CYTOLOGICKÁ TECHNIKA MUDr. Filip Wagner Ústav histologie a embryologie Lékařská fakulta UP v Olomouci

2. Způsoby vyšetření cytologické vyšetření histologické vyšetření biopsie exfoliativní cytologie aspirační cytologie

3. Exfoliativní cytologie • umožňuje cytologické vyšetření v tělesných dutinách nebo površích • získávání buněk • přímým stěrem (např. na děložním hrdle) • po mechanické iritaci speciálním kartáčem • laváží dutého orgánu • vyšetření buněčných sedimentů (výpotky, exkrety, likvor) • otiskové preparáty (přitlačením sklíčka na patologickou tkáň vyjmutou z těla)

4. Aspirační cytologie • punkce provedená speciálně konstruovanými tenkými jehlami (FNA – fine needle aspiration) • rozetření aspirovaného materiálu na podložní sklo • složité morfologické hodnocení po běžném cytologickém barvení – často nutno doplnit speciální vyšetření • cytochemické barvení • elektronmikroskopické vyšetření

5. Provedení cytologie • správná volba techniky a místa odběru • správné provedení odběru • příprava nátěru • fixace (je-li její provedení v postupu) • cytologické barvení • lze provést speciální techniky: • cytochemické barvení, imunocytochemie • zobrazení elektronovou mikroskopií

6. Zhotovení nátěru • nátěr se zhotovuje na podložní sklíčko pomocí bakteriologické kličky, tamponu nebo druhého podložního sklíčka (se zabroušenou hranou) • nátěr musí být dostatečně tenký a nesmí dojít k poškození buněčných elementů • podložní sklíčka musí být čistá, odmaštěná, vypraná v etanolu

7. Fixace • fixace vlhkého nátěru etanol (96%) - éterem (1:1) po dobu 30 – 60 minut • izopropylalkohol 97,5% a ledová kyselina octová 2,5%

8. Barvení podle G. Papanicolaoua • alkohol 80%, 70% - propláchnutí • opláchnutí destilovanou vodou • Harrisův hematoxylin (6 minut) • opláchnutí destilovanou vodou • 0,25% roztok kyseliny chlorovodíkové (namočit 6x) • opláchnutí destilovanou vodou • alkohol ve vzestupné koncentraci 50%, 70%, 80%, 96% • I. cytoplasmatické barvení OG 6 (2 minuty) • opláchnutí v 95% alkoholu • II. cytoplasmatické barvení EA 50 (2 minuty) • opláchnutí v 96% alkoholu • odvodnění (absolutní alkohol) • oplach v xylenu

9. OG 6 – Oranž G 0,5% roztok v 95% roztoku alkoholu s kyselinou fosfowolframovou • EA 50 0,5% světlá zeleň, 0,5% Bismarkova hněď a 0,5% žlutý eosin v 95% roztoku alkoholu • Bismarkova hněď se v současnosti používá již jen v některých polychromech (EA31 a EA65)

10. Barvení dle E. Shora • barvení Shorr „SIII“ (1-5 minut) • propláchnutí alkoholem 70% (asi 10x) • propláchnutí alkoholem 93% (asi 10x) • propláchnutí absolutním alkoholem (asi 10x) • xylol (0,5 minuty) • zamontování preparátu složení roztoku „SIII“ • alkohol 50% 100 ml • vodný roztok Biebrichovy červeně 0,5g • oranž G 0,25g • zeleň FCF 0,075g • kyselina fosfowolframová 0,5g • kyselina fosfomolybdenová 0,5g • ledová kyselina octová 1,0 ml

11. Barvení podle Z. Pekárka (modif.) • oplach alkoholem 90% • oplach alkoholem 70% • oplach destilovanou vodou • Mayerův železitý hematoxylin (15 minut) • oplach pod tekoucí vodou (5 minut) • nasycený roztok kyselého fuchsinu v 96% alkoholu (30 sekund) • 1% kyselina fosfomolybdenová (30 sekund) • cytoplasmatické barvení (7-10 minut) • směs 2% světlé zeleně v 96% alkoholu a 1% žlutý eosin v 96% alkoholu v poměru 2:1 • oplach alkoholem 96% • oplach xylolem • zamontování preparátu

12. Barvení dle Pappenheima • panoptické barvení • roztoky: May – Grünwald Giemsa – Romanovski • postup: • neředěné May-Grünwaldovo barvivo (3 minuty) • následně se barvivo na preparátu zředí stejným dílem destilované vody a nechá se působit 1 minutu • barvivo se slije a bez oplachu se převrství Giemsovým roztokem /1 díl barviva na 10 dílů redestilované vody/ (15 minut) • výsledky barvení: • chromatin červenofialově, cytoplasma lymfocytů a monocytů světle modře, azurová zrna svítivě purpurově červeně, acidofilní zrna eosinofilních granulocytů cihlově červeně, bazofilní zrna modrorůžová, erytrocyty růžové

13. Vyšetření moče biochemie cytologie mikroskopické vyšetření moč. sedimentu mikrobiologie pozor na způsob odběru pro jednotlivé typy!

14. Močová cytologie • slouží pro cytologické vyšetření buněk ve • vymočené moči • výplachové tekutině (z močového měchýře, ledvinové pánvičky) • tekutině získané punkcí (např. renální cysty) • uplatnění v uroonkologii • skreening • sledování nádorů • provádí se centrifugací čerstvě získaného materiálu (1500 – 3000 otáček/minutu), barvení metodou dle Papanicolaoua

15. známky malignity v močové cytologii • makronukleóza • převaha jaderné hmoty nad cytoplasmou • anizonukleóza • nestejná velikost jader (polymorfonukleóza) • hyperchromazie • hrubý chromatin s nepravidelnými chromatinovými granulacemi • změny v počtu a velikosti jadérek • hodnocení • pětistupňové (PAP I a II – negativní, PAP III suspektní a PAP IV a V pozitivní) • pozor na negativní nález při nesprávně zvoleném způsobu odběru !!!

17. Vyšetření sekretů v urologii uretrální fluór • uretrální fluór – mikrobiologie • prostatický exprimát • získává se po krátkodobé masáži prostaty (per rectum), pacient si následně vytlačí sekret směrem od kořene penisu • pro zánět svědčí více než 25 leukocytů v zorném poli (zvětšení 400x) • ejakulát • odběr se provádí po asi pět dní trvající sexuální abstinenci • pyospermie – zvýšená přítomnost leukocytů ve spermatu může svědčit pro záněty mužských adnex • hemospermie prostatický exprimát ejakulát

18. Ejakulát • analýza ejakulátu je nezbytným vyšetřením u mužského faktoru sterility • je třeba vyšetřit nejméně tři různé vzorky v různých časových obdobích • ejakulát se získává masturbací po nejméně pět dní trvajícím období bez ejakulace • ejakulát vzniká smíšením spermií se sekrety prostaty, semenných váčků, Cowperových a Littreových žlázek

19. Normální a patologický spermiogram • hodnoty normální spermiogramu: • objem spermatu: > 2 ml • pH: 7,2 – 7,8 • koncentrace spermií: > 20x106 spermií/ml • celkový počet spermií: > 40x106 spermií • pohyblivost: > 50% spermií s pohybem vpřed • morfologie: > 50% spermií s normálním tvarem • vitalita spermií: > 50% spermií živých • některé termíny vztahující se ke spermiogramu: • aspermie – značí úplnou absenci ejakulátu při orgasmu • azoospermie – v ejakulátu se nenacházejí žádné spermie • oligospermie – koncentrace spermií je nižší než 20 mil. spermií / 1 ml • astenozoospermie – pohyblivost spermií nižší než norma (50%~ 60%) • nekrozoospermie – přítomnost jen avitálních spermií

20. Gynekologická cytologie • onkologická cytologie představuje důležitou screeningovou metodu a je důležitou metodou při diagnostice cervikálních lézí • hormonální cytologie je funkční cytologií, zaměřuje se na změny epitelu pochvy v reakci na hormonální stimulaci onkologická cytologie hormonální cytologie

21. Metodika gynekologické cytologie • odběr materiálu • z exocervixu např. vatovou štětičkou, platinovou kličkou nebo jinými speciálními nástroji • z kanálu děložního pomocí kartáčků • natření na podložní sklíčko • fixace (95% alkoholem) • standardní barvení dle Papanicolaoua • hodnocení (Bethesda systém)

22. Bethesda systém - cytodiagnostika • od roku 1988 (do té doby platilo v gynekologické cytologii hodnocení podle Papanicolaoua) • základem popisná diagnostická terminologie • kvalita nátěru (optimální, suboptimální, nehodnotilný) • popis infekce (koky, gardnerely, smíšená bakt. flóra) • hormonální stav (odpovídá/neodpovídá věku a cyklu) • buněčné změny dlaždicového epitelu • buněčné změny žlázového epitelu

25. Cytologická diagnostika respiračních onemocnění • mikroskopické vyšetření sputa (mikrobiologie, cytologie) • cytologické vyšetření materiálu odebraného během bronchoskopie (kartáčky …) • biopsie postiženého plicního parenchymu (lepší dg. výtěžnost) • bronchoalveolární laváž • vyšetření punktátu (pleurální a perikardiální výpotek, fluidothorax …)

26. Bronchoalveolární laváž • během bronchoskopie aplikováno 150 – 300 ml fyziologického roztoku do segmentálního bronchu a jeho opětovná aspirace • získává se tak výplachová tekutina z alveolů a bronchiolů • buněčný rozpočet (lymfocyty, polymorfonukleáry, eosinofily) • nádorové buňky • hodnocení makrofágů – krystalická tělíska (silikóza), hemosiderin (plicní hemoragie) • nález specifických buněk – např. Langerhansovy buňky s Birbeckovými granuly (histiocytóza X)

27. Vyšetření ascitu • biochemie (rozlišení exsudát – transsudát) • mikrobiologie • cytologie • detekce nádorových buněk • prognóza nemocných s maligním onemocněním a nádorovými buňkami v ascitu

28. Cytologie plodové vody • fyziologe: • amniová tekutina produkována amniem a močovým traktem plodu • voda je plodem polykána a je do ní vyměšována moč • cytologický obraz • buňky dlaždicového epitelu (bazální, intermediární, povrchové) • blížící se porod – povrchové epitelie ve shlucích, bezjaderné šupiny – squamy – tvoří mázek • buňky urogenitálního a trávicího traktu a bronchů plodu • Kittrichova zkouška • průkaz plodové vody • barvení squam Nilskou modří oranžově – sg. zralosti plodu

29. Cytologie likvoru • v 1 mm3 likvoru se fyziologicky nachází: • několik deskvamovaných buněk • maximálně 2 – 5 lymfocytů

30. Nátěry periferní krve a sternální punkce • barvení dle Pappenheima (diferenciál) • barvení brilantkresylovou modří (retikulocyty) • zhotovení nátěru periferní krve

31. periferní krev

32. periferní krev

33. sternální punkce

34. Cytologická barvení v histologii • barvení podle Heidenheina • jádrová barvení • barvení jádrovou červení • barvení galocyaninem • Feulgenova nukleární reakce

35. Díky za pozornost 