Difetti congeniti del metabolismo II

1. Difetti congeniti del metabolismo II Lezione 2 ByNA

2. Albinismo oculocutaneo OCA Esistono diverse forme di albinismo: sono tutte recessive e una forma e’ X-linked e’ presente eterogeneita’ genetica L’albinismo oculocutaneo OCA e’ caratterizzato da: assenza di pigmentazione dovuta all’incapacita’ di sintetizzare la melanina, mentre il numero dei melanociti e’ normale. La melanina e’ presente nei capelli, nella cute e nella retina. La via che porta alla sintesi della melanina parte dall’amminoacido tirosina, che e’ coinvolto in una serie di altre reazioni il cui mancato svolgimento porta alla manifestazione di altri difetti congeniti del metabolismo: Alcaptonuria e Fenilchetonuria ByNA

3. La tirosinasi Le prime due tappe che portano alla sintesi della melanina sono catalizzate dalla tirosinasi che in una prima reazione idrossila la tirosina e successivamente catalizza l’ossidazione della diidrossifenilalanina ottenuta, in DOPA-chinone. Il gene della tirosinasi e’ stato clonato e sono state identificate le mutazioni che sono la causa della comparsa dell’albinismo Le strategie di clonaggio sono varie: lo scopo e’ quello di identificare la sequenza di DNA voluta in mezzo a tutte quelle che si possono isolare ByNA

4. La tirosinasi clonaggio Dal momento che si conoscevano le basi biochimiche della patologia e’ stato possibile utilizzare il clonaggio funzionale Non si conosceva la sequenza della tirosinasi, ma si sapeva che era coinvolta, pertanto si sintetizzo’ il cDNA a partire da RNA totale estratto da cellule che sintetizzano l’enzima e si inserirono i cDNA in fagi. • Creazione di una library di cDNA in vettore di espressione • Produzione di anticorpi specifici per la tirosina • Screening della library di espressione e isolamento della colonia • Ricerca nei topi del DNA corrispondente al cDNA clonato • Sequenza dei cDNA cercando una ORF • Screening di una library di DNA genomico per isolare la sequenza completa • Analisi del DNA degli affetti per individuare le mutazioni ByNA

5. Polimorfismo RFLP • Polimorfismi del DNA: di restrizione (RFLP), minisatellite, microsatellite. Individuabili con southern blottling o PCR • RFLP: La sonda riconosce il polimorfismo con un particolare enzima, ma non con altri Enzima A Enzima B B1 B2 A2 A3 A1 B1 B2 A3 A1 mutazione elimina il sito di restrizione endonucleasi A endonucleasi B Pattern di ibridazione su filtro ByNA

6. Polimorfismo • Variazione presente nella popolazione con una frequenza superiore a 1% • Polimorfismi proteici • Polimorfismi del DNA: di restrizione (RFLP), minisatellite, microsatellite. Individuabili con southern blotting o PCR ByNA

7. Polimorfismo RFLP esempio I1 I2 II1 II2 I3 I4 III1 III2 III3 III4 III5 III6 III7 III8 Lunghezza dei frammenti Alleli identificati dall’ibridazione su Southern Possibile interpretazione dei risultati I 1 2 3 4 II 1 2 III 1 2 3 4 5 6 7 8 ByNA

8. Polimorfismo PCR • Mini e micro satelliti: Riconosciuti su gel dopo amplificazione con PCR ByNA

9. Analisi delle mutazioni di OCA I Il gene della tirosinasi e’ lungo circa 50Kb ed e’ composto da 5 esoni La ricerca delle mutazioni e’ essenziale per definire se il gene clonato e’ quello che una volta mutato provoca la patologia in esame Bisogna tenere presente che le variazioni di sequenza non sempre sono patogene, possono anche rappresentare polimorfismi che nel caso delle recessive costituiscono un problema. Perche? • Nella popolazione generale e’ impossibile definire se un soggetto e’ portatore o meno dell’allele patogeno.Bisogna sempre esaminare gli affetti e i loro genitori, anche i fratelli possono essere fonte di errore: potrebbero essere non portatori ByNA

10. Analisi delle mutazioni di OCA II • Nell’albinismo oculocutaneo grazie al sequenziamento del gene e’ stata evidenziata la presenza di mutazioni diverse in siti diversi del gene (allelia multipla), che possono provocare fenotipi leggermente diversi. • Non confondere questo con l’eterogeneita’ genetica che e’ pure presente nell’albinismo. Esistono altre forme di albinismo non legate a mutazione del gene della tirosinasi, che dipendono da mutazioni di altri loci ByNA

11. Analisi delle mutazioni di OCA III Apriamo una parentesi • Eterogeneita’ genetica :e’ fra locus • Il fenotipo e’ il risultato di una catena di interazioni:il risultato finale puo’ risultare simile anche quando i locus sono diversi. • E’ importante identificare con precisione i criteri di definizione nel caso dell’albinismo un primo criterio e’ il dosaggio della tirosinasi ByNA

12. Analisi delle mutazioni di OCA IV Le strategie per individuare le mutazioni negli affetti o nei potenziali eterozigoti sono varie, la piu’ usata e’ la PCR o l’utilizzo di oligonucleotidi allele specifici sintetizati ad hoc per le singole famiglie Come si studiano le famiglie? Bisogna sempre analizzare i risultati nel loro insieme, utilizzando le informazioni che vengono dalla popolazione generale. ByNA

13. Analisi delle mutazioni di OCA V Presenza di piu’ di una mutazione nel DNA dell’affetto: Le mutazioni possono essere : Missenso: sostituzione di una base che porta al cambiamento dell’amminoacido. La stessa sostituzione e’ presente nella popolazione generale anche in omozigosi senza conseguenze? se si e’ un polimorfismo e ci dice che quella regione della proteina o quell’amminoacido non e’ critico per la funzione.E’ una mutazione conservativa.(L’accumularsi di dati su piu’ famiglie e sulla popolazione generale facilita l’interpretazione) ByNA

14. Analisi delle mutazioni di OCA VI Ognuna delle altre mutazioni e’ presente in omozigosi in altri soggetti albini non imparentati? Se si e’ probabile che siano patogenetiche e ritrovarne una nei fratelli dell’affetto lo fa identificare come portatore (la mutazione deve essere presente in eterozigosi in un genitore) Ognuna delle altre mutazioni e’ presente in omozigosi in altri soggetti albini non imparentati? Se no riguarda una regione nota per essere necessaria al funzionamento della proteina? Se si e’ probabile che sia patogenetica(cfr. sopra) ByNA

15. Analisi delle mutazioni di OCA VII Nel gene della tirosinasi sono riportate anche mutazioni frameshift che possono originare una proteina tronca. Nell’albinismo oculocutaneo sono stati trovati eterozigoti composti: soggetti affetti in cui la mutazione patogenetica non e’ presente in omozigosi, ma la presenza di due alleli patologici fa manifestare la malattia. I genitori ed eventuali fratelli in cui e’ presente anche l’allele wild-type sono eterozigoti per una sola mutazione. ByNA

16. I II III IV V Cu(B) Cu(A) Mappa delle mutazioni di OCA Mutazioni puntiformi: patogene Mutazioni puntiformi:polimorfismi Mutazioni frameshift ByNA