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消化性溃疡药. 一、实验设计的医学基础 消化性溃疡主要指发生于胃和十二指肠的慢性溃疡，临床以上腹部剑突以下，脐以上胃脘部经常发生疼痛为主症。属中医“吞酸”、“胃脘痛”之范畴。 有关消化性溃疡病的病因病机尚未完全清楚。一般认为溃疡的形成主要由于胃、十二指肠黏膜的防御因素和攻击因素的平衡失调所致。攻击因素主要是指胃酸、胃蛋白酶以及近年提出的幽门螺旋杆菌；防御因素则包括粘液 —— 碳酸氢盐屏障、胃黏膜血流、胃上皮更新和内生性前列腺素等。任何原田导致攻击因素加强和 ( 或 ) 防御因素减弱时，均可导致溃疡发生。
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一、实验设计的医学基础 消化性溃疡主要指发生于胃和十二指肠的慢性溃疡，临床以上腹部剑突以下，脐以上胃脘部经常发生疼痛为主症。属中医“吞酸”、“胃脘痛”之范畴。 有关消化性溃疡病的病因病机尚未完全清楚。一般认为溃疡的形成主要由于胃、十二指肠黏膜的防御因素和攻击因素的平衡失调所致。攻击因素主要是指胃酸、胃蛋白酶以及近年提出的幽门螺旋杆菌；防御因素则包括粘液——碳酸氢盐屏障、胃黏膜血流、胃上皮更新和内生性前列腺素等。任何原田导致攻击因素加强和(或)防御因素减弱时，均可导致溃疡发生。 现代医学对消化性溃疡的治疗一般可分为二个方面：抑酸、强化黏膜防卫和抗菌治疗。中医认为本病的病因病机主要有情志所伤，饮食劳倦等方面。本病病位在胃，与肝、脾关系最为密切。在病机转化方面，具有由气及血，由实转虚，寒热转化、化热伤阴之特点，临证多从肝郁、脾虚、胃热、气滞、血癌及胃阴亏损进行辨证，采用疏肝、健脾、清热、理气、化瘀、养阴之法。
二、药效学研究的实验设计 (一)对溃疡病模型的防治作用试验 1．常用动物模型 (1)应激性胃溃疡模型：通过应激引发，如束缚、冷冻、饥饿、烫伤等。 (2)幽门结扎法溃疡模型：通过手术结扎幽门的方法而形成溃疡。 (3)药物性溃疡模型：如利血平模型、吲哚美辛溃疡模型、阿司匹林溃疡模型均通过相应药物的作用而产生溃疡。 (4)化学性溃疡模型：慢性乙酸溃疡模型、无水乙醇、盐酸、氢氧化钠溃疡模型，这些模型均为这些物质直接损伤胃黏膜而形成溃疡。 以上溃疡模型，除乙酸溃疡模型外，其余均为急性溃疡模型，前者通常作为观察药物对溃疡的愈合作用，后者则作为观察药物对溃疡发生情况及程度的影响。
2．观察指标 (1)溃疡愈合情况应是评价新药疗效的最主要指标。这通常是对慢性溃疡模型而言。衡量溃疡愈合的指标有溃疡面积或溃疡体积、溃疡愈合率。哪种表示更科学，应根据药物作用强度以及溃疡愈合程度而定。 (2)溃疡指数及溃疡发生率常作为评价药物对各种溃疡模型作用的指标。特别是对急性溃疡模型。前者常为评价溃疡的轻重程度，后者则衡量溃疡发生情况。溃疡指数的评定标准及方法视不同的溃疡模型而不同。 (3)其他可供分析的指标：胃黏膜出血程度，急性溃疡模型如应激溃疡、药物溃疡、化学致坏死性损伤物质引起的胃黏膜损伤常为出血性损伤，出血的程度与胃黏膜损伤程度相关。但由于实际操作不易测量出血量，可以“+”分级表示轻重程度，作为辅助指标。
3．方法学评价 上述各种溃疡模型，由于造模方法和发生机制不同，模型中各有特点。可根据新药的功能主治选择。 (1)慢性乙酸法溃疡模型：—般认为溃疡的病理形态特点与修复过程类似人类消化溃疡。溃疡发生率达100％，溃疡在胃肠任何部位均可造成，溃疡持续长，自愈约需 60—100日，在较长时间内观察药物治疗的效果等，因此，该模型适用各种证型药物的观察。是评价药物对溃疡愈合作用的较为理想的溃疡模型。 (2)幽门结扎溃疡模型：主要发生机制为潴溜的胃液对胃的消化作用及由于结扎幽门引起的血液循环障碍所致、与人类消化性溃疡的“自身消化”吻合，与中医的气滞血淤有—定的联系 由于操作方法简单易行，溃疡发生率高，几达100％，因此广泛用于抗溃疡药物研究，适合于各类证抗溃疡药物，特别是活血化瘀、理气行气类药物的抗溃疡作用观察。
(3)应激性溃疡模型：与人类应激性溃疡十分相似，此模型的发生机制比较复杂，一般认为应激作用使大脑皮层的兴奋与抑制过程失调，引起皮层下功能紊乱从而导致神经和下丘脑—垂休—肾上腺皮质的调节功能紊乱．使胃肌痉挛、胃血液循环障碍，胃分泌增加而导致溃疡形成。人类由于严重创伤、烧伤等可产生急性应激性溃疡，精神过度紧张，强烈的情绪激动导致溃疡的发生或复发。与中医肝郁型自主神经系统功能紊乱有一定的联系。同此该模型适于疏肝理气、疏肝清热、活血化瘀类药物的观察 (4)利血平溃疡模型：机制是由刺激5—HT和(或)组胺的释放，或激活甾体类激素的释放，引起过多的胃液分泌以及胃壁的血管运动变化。此模型的优点是操作简单、发病率高，缺点是溃疡比较表浅。适于脾胃虚弱之益气健脾药物的观察。 (5)吲哚美辛、阿司匹林溃疡模型：主要机制是抑制胃黏膜细胞内前列腺系统，细胞保护作用减弱有关。它优点是愦疡发生率高，再现性好，缺点是比较表浅，适合各种证型药物的观察。 (6)强酸、强碱、无水乙醇引起的溃疡模型：发生机制为直接损伤胃黏膜而形成溃疡。此类模型较偏重有关加强胃黏膜防卫作用药物的试验。适用于清热、解郁、益气健脾、益气养阴类药物的观察。
(二)其他试验 1． 胃分泌试验 抑酸常是消化性溃疡药物的作用环节之—。可观察药物对胃酸、胃蛋白酶分泌的影响，包括胃液分泌量、游离酸度、总酸排量(单位时间内)、胃蛋白酶排出量。方法有大鼠幽门结扎法收集胃液进行分析，也采用在体胃灌流法等。 2 胃黏膜血流量 胃黏膜血流不仅在胃黏膜的防御机制中起着主要的作用，而且对溃疡病灶的修复必不可少，因此，测定药物对胃膜血流的影响，也可作为药物药效的辅助指标之一。胃黏膜血流量的测定需要掌握一定的技术和一定的设备。常用的方法有中性红清除法、多普勒激光血流测定法、氧离子廓清法等。 3 胃黏液测定 胃黏液屏障在胃黏膜抗损伤中起到第一道防线的作用，是胃黏膜的防卫因素之一，中药治疗消化性溃疡的作用之一是通过影响胃黏液的分泌，因此，观察药物对胃黏液含量的影响也可作为药效研究的辅助指标。通常采用阿利新兰糖蛋白结合法分别测胃黏液的含量以及胃液中游离黏液的含量，以胃壁黏液较有意义。 4 抗炎镇痛试验 炎症是消化性溃疡病的病理特特征之一，疼痛往往由炎症引起。具有消炎、止痛作用的药物有利于溃疡病的修复，可以选择炎症模型如腹腔毛细血管通透性模型、炎症肿胀模型、足肿胀模型；疼痛模型如醋酸扭体、热板法、解痉试验等为药效辅助指标。 5．抑制幽门螺旋杆菌试验 幽门螺旋杆菌是消化性溃疡病重要的致病因素之一。有条件也可以观察药物对该菌的抑制作用。
(三)阳性对照药 阳性对照药既可选西药，也可以选用中药。西药的作用较明确，效果较肯定。常用有H2受体拮杭剂如西咪替丁、雷尼替丁、法莫替丁等；加强胃黏膜防卫功能的有生胃酮、硫糖等。中成药品种较多，一般应选择疗效较肯定的主治功能相似的中成药作为对照药，对照组应是药典记载的。对照药剂量应与受试药的剂量相呼应(等效量或给药倍数相等)，以资比较。 三、消化性溃疡动物模型建立方法 (一)慢性乙酸溃疡模型 1．原理 在大鼠胃的浆膜下或浆膜面注射或浸润定量的乙酸，由于乙酸的腐蚀致胃黏膜损伤而造成溃疡。
2．方法 大鼠禁食24h，自由饮水，乙醚麻醉，常规消毒开腹，轻轻将胃取出，在腺胃部前壁窦体交界处注入30％乙酸0．03ml于浆膜下，缓慢出针，勿使乙酸流出。用生理盐水冲洗胃创面，将胃送入腹中，缝合腹壁创口。术后常规喂养，术后3～5日形成溃疡。溃疡—般呈圆形或卵圆形，但有不规则。一般术后的次日可分组进行给药治疗。观察完毕后，杀死动物，剖腹，结扎幽门及贲门，用甲醛溶液10ml注入胃内，将胃放人同一浓度甲醛溶液中l0min，使胃的内外层固定以便测量。然后沿胃大弯将胃剪开，用自来水洗去胃内容物，将胃铺于纸上观察，测量溃疡面积。通常以疗后溃疡面积(或体积)的大小评价药物的作用。 3．注意点 (1)技术操作过程应严格消毒，笼具也应消毒，以免术后感染影响药物的观察治疗。 (2)注射的部位要求一致，酸的量要准确，确认乙酸注入浆膜下。发现有误者应弃去，以免影响结果。 (3)溃疡的大小与注射乙酸量的大小有关。操作过程应严格掌握，否则形成溃疡差异较大。
(二)应激性溃疡模型 1. 原理 给动物(大鼠或小鼠)施加一定强度的刺激因素(如束缚、冷冻、饥饿、创伤等)，可形成急性胃溃疡，通常采用束缚水浸应激法。 2．方法 取禁食24h大鼠，关进特制的圆形铁丝笼内，浸入水中至剑突部位，水温18~20C，7h后处死动物，打开腹腔，结扎贲门与幽门后将胃取出，由幽门向胃内注入1％甲醛溶液10ml，将胃浸入同浓度甲醛溶液中10min，固定内外层。沿胃大弯剪开胃，用自来水洗去胃内物，平铺白纸上。观察脾胃部溃疡发生的情况。溃疡位于腺胃部，表现为点状出血，并出现线状或直径为l-2mm圆形表浅性溃疡，溃疡的程度以溃疡指数表示，并计算溃疡的发生率。溃疡发生率：溃疡发生的动物数占试验动物数的百分比。 3．注意点 (1)动物体重以160—180mg为宜，每批动物大小一致。禁食宜每只—笼，笼底应不能积留粪便，以免动物自食。 (2)所用的应激铁笼大小与动物关进后松紧度合适为准，太松动物应激时会在笼中上下移动或转身溺水死亡。 (3)溃疡程度与应激强度有关，包括应激时间、水温、水浸部位的高度等因素，故应严格控制。
(三)利血平溃疡模型 1．原理 利血平刺激5-HT和(或)组胺的释放，引起过多的胃液分泌以及胃壁的血管运动变化从而引起溃疡。 2．方法 取体重160～180g大鼠，禁食24h，自由饮水，腹腔注射利血平5mg/kg(体重)，18h处死动物，取胃按上法用福尔马林固定，沿胃大弯割开胃腔平铺纸上，观察溃疡发生情况，溃疡位于腺胃部，以条索状和点状为主。溃疡指数的测量及计算与应激性溃疡模型相同。 3．注意点 利血平的剂量不宜过大，否则动物容易死亡。给利血平后处死动物的时间应视天气情况而定，天气太冷时相对缩短处死时间，12—15h为宜。该模型的稳定性与动物体质、禁食时间、利血平的量、室温等同素有关，应尽量控制实验条件—致。
(四)幽门结扎法溃疡模型 1．原理 通过手术结扎幽门，使胃内胃酸、胃蛋白酶潴留，攻击因素增强，造成对胃黏膜的侵蚀作用而形成溃疡。 2．方法 大鼠禁食36h，自由饮水。在轻度乙醚麻醉下，常规消毒开腹，在幽门与十二指肠连接处用缝线结扎，术后禁食禁水，18h后处死，按需要不同时间处死，取胃按前法用甲醛溶液固定，沿胃大弯剖开。观察前胃部溃疡发生情况，并同时分析胃液分泌情况。无穿孔者以小溃疡数及溃疡面积计算溃疡指数。溃疡的最大径大于1mm者计算面积。 3．注意点 (1)动物应严格禁食，时间36~48h，单笼，笼底不能存留粪便，以免饥饿自食。因为胃内容会影响溃疡的形成，干扰结果。 (2)手术结扎小心避开血管，以免影响胃血液循环。结扎时间的长短、室温的高低直接影响溃疡的形成；时间太短溃疡轻微，太长易致穿孔死。室温较低应相应缩短处死时间。 (3)观察药物对溃疡的作用时，动物应预先给药，或同时给药，若粗制剂采用灌胃给药，应确认胃内药物已排空手术结扎。粗制剂在结扎的同时采用十二指肠注入给药较好。
(五)吲哚美辛溃疡模型 1．原理 美辛通过抑制胃黏膜前列腺素合成酶，使胃黏腆内前列腺素减少，细胞保护作用减弱，以致胃黏膜防御因素减弱而形成溃疡。 2．方法 大鼠禁食24h，自由饮水，皮下注射吲哚美辛20mg／kg(体重)(吲哚美辛粉溶于5％碳酸氢钠溶液中，成为10mg／ml，再用蒸馏水稀释成2mg／ml。此溶液为等张，pH介于7．5—8．0)。7h后处死，取胃用甲醛溶液固定，沿胃大弯剖开胃腔，展开平铺，观察溃疡情况并汁算溃疡指数，溃疡位腺胃部，表现为与轴平行的点状、线状瘀点。溃疡指数的评定及计算与应激性溃疡模型相同。 3．注意点 该模型的损伤程度与动物体质、禁食时间、美辛的量、给吲哚美辛后的时间有关。观察中药的效应一般应预先给药．给药后30—60min给吲哚美辛。本法也可以采用阿司匹林或腹腔注射(150mg／kg)复制得到相似的溃疡模型。
(六)无水乙醇、O．6mol／L盐酸、O．2mol／L氢氧化钠胃损伤模型 1．原理 给动物某些化学物质如强酸(HCL)、强碱(NaOH)、无水乙醇。由于这些物质直接损伤胃黏膜而形成溃疡。 2．方法 大鼠禁食24h，自由饮水，每只动物选择下列物质灌胃：0．6mol／l盐酸、0．2mol／L氢氧化钠、上水乙醇1．0ml。60min后处死动物，取胃用甲醛溶液固定，沿胃剖开胃腔，展开，观察腺胃部溃疡发生情况，并测溃疡指数，溃疡指数的评定方法同应激性胃溃疡模型。 3．注意点 此类溃疡发病部位在腺胃部，以条索状出血性缺损为特征。观察中药对模型的效应时，如果采用灌胃给药，需确认中药在胃中已排空。某中约对胃排空呈抑制作用。往往给药后短时间(1—2h)难以排空，这时如果给上述物质造型，由于胃内药液的稀释作用能导致假阳性结果。
一、实验设计的医学基础 慢性萎缩性胃炎(简称CAG)是以胃黏膜固有腺体萎缩、黏膜变薄、黏膜肌层增厚、胃酸分泌减少，临床上以上腹疼痛、胀满、嗳气、纳呆为主要表现的病变。属中医“胃脘痛”、“胃痞”的范畴。 有关慢性萎缩性胃炎的病因尚未完全清楚。现代医学认为其病因一般与环境、免疫、遗传、年龄、胆汁返流、慢性乙醇中毒、慢性浅表性胃炎、幽门螺旋菌感染等因素有关。中医对本病病因的认识，认为主要与饮食不节、嗜好烟酒、进食热烫粗糙或刺激性食物、情志不节、恼怒郁结、素体虚弱、劳倦内伤，或用药不当、久病体虚等因素有关。
在治疗方面，日前，西医治疗仍缺乏特效药物，对证治疗为主，如消除病因，避免服用对胃有强刺激的食物和药物，忌烟酒，注意饮食规律，积极治疗浅表性胃炎及有关的感染病灶。治疗的药物主要有维酶素、肽胃泌素、弱酸、消胆胺、吗丁啉、硫糖铝、复方铋制剂以及必要时手术治疗等。在治疗方面，日前，西医治疗仍缺乏特效药物，对证治疗为主，如消除病因，避免服用对胃有强刺激的食物和药物，忌烟酒，注意饮食规律，积极治疗浅表性胃炎及有关的感染病灶。治疗的药物主要有维酶素、肽胃泌素、弱酸、消胆胺、吗丁啉、硫糖铝、复方铋制剂以及必要时手术治疗等。 中医治疗本病有一定的优势。治疗方法主要有辨证论治、基础方加减、专方以及中成药。由于CAG的病因病机变化复杂以及各地学术上的差异，临床辨证沦治也不一样。国内中医CAG的分型多达30种，比较集中的证型有脾胃虚弱(或脾胃虚寒)、肝胃不和、脾胃湿热、胃阴不足、胃络瘀血、痰浊中阻、热毒温结。因此常采用健脾、疏肝理气清热化湿、养阴益胃、活血化瘀、温中化痰、解毒消痈、清热和胃等治疗方法。鉴于临床多表现虚中夹实，在临证时多采用一法为主多法结合的治疗方法。在疗效评价方面，一般以临床症状、胃镜检查、病理活校综合评定。由于各地标准不一致，疗效评价存在—定的差异。
二、药效学研究的实验设计 (一)对萎缩性胃炎动物模型的防治作用试验 1．常用的动物模型 有关CAG的动物模型，有文献报道，近年也偶见有关CAG药效观察的报告，但由于研究者的研究目的和出发点不同，在模型的制备方法、评价指标也存在一定的差异。如何复制出与人类临床病理特征相似的、方法可靠、重复性好的、适合药效学试验的模型仍在探索之中。综合国内外近年文献的报告主要有如下几种造模方法： (1)去氧胆酸法：给大鼠或小鼠饮用一定浓度的去氧胆酸钠，时间90日。 (2)主动免疫加去氧胆酸钠法：大鼠皮下注射佐剂抗原(同种大鼠胃黏膜的生理盐水的组织匀浆与福氏剂以1：l配成的乳剂)，加去氧胆酸钠溶液饮用。 (3)综合法：大鼠灌胃胆汁、50C热水、主动免疫2次，时间70日。 (4)氨水法：给大鼠饮用o．02％浓度氨水90日。 (5)牛黄胆酸法：给大鼠饮用一定浓度的牛黄胆酸钠6个月。 (6)MNNG法：在饮水加入致痼剂MNNG给大鼠饮用60日。 (7)Y线照射法：采用Co多次小剂量照射大鼠。
2．观察指标 (1)组织病理学：病理学的改变应是反映新药疗效和评价药效的最主要指标。由于CAG是以胃黏膜固有腺体萎缩和固有层炎细胞浸润为病理特征，并作为诊断依据，药效的评价也应体现这方面。动物模型之造模方法的不同，形成CAG的病理改变程度有所不同，评价指标也有所侧重，观察指标常包括胃黏膜厚度、黏膜肌厚度、腺体数量、主壁细胞数、炎性细胞计数以及肠化发生率等。应该指出的是，目前在动物模型的组织病理学指标尚未有统一标准，评价指标仍以定性为主。如何使组织病理学的指标更加科学可靠，仍应努力探讨，研究指标的定量化评价是发展的趋势，研究者应尽可能采用先进的检测方法或严密的科研设计，使研究指标科学可靠。 (2)生理病理指标：CAG在胃黏膜发生形态病理改变的同时，其功能也伴随改变，如胃固有腺体减少，主、壁细胞也相应减少，以致胃酸、胃蛋白酶的分泌也减少，胃黏膜的血管遭破坏而导致胃黏膜流量减少；胃黏腆屏障破坏而导致胃黏腆电位差下降；在胃黏膜细胞动力学方面，萎缩性胃炎时，胃黏膜上皮成熟障碍，失去了对DNA合成的控制能力，表现为DNA合成活性增强，若某种治疗有效，随着组织病理学的改善其胃分泌功能，胃黏膜血流、胃黏膜屏障功能得以改善或恢复正常，因此，胃酸、胃黏膜血流量、黏腆电位、胃黏膜DNA含量的测定也可作为反映药物的疗效指标。 (3)其他指标：胆汁返流是萎缩性胃炎的重要病因之一，螺旋杆菌(HP)感染也是CAG的致病因素之一，胃液胆汁酸盐和胃黏膜HP的检测也可作为评价药效的辅助指标之—。
3．方法学评价 CAG动物模型的制备，就方法学而言其共同点之一是胃黏膜进行慢性刺激。由于刺激的因素和强度不一样，CAG形成的时间和程度也有差别。一般单因素，如单纯占氧胆酸钠饮用，时间相对较长，胃黏腆萎缩程度也相对轻一些。由于CAG的形成是一个缓慢的过程，病因是多方面的，田此在动物模型制备方法上采用综合因素，取得较好效果，口前就CAG动物模型的制备来说仍以综合法较为理想。一是其形成过程与人类相似，多由浅表性炎症发展到萎缩性胃炎的过程，二是其组织病理特征与人类相似，三是CAG形成，短期内不易恢复，适合药效观察。由于CAG存在轻重程度之分，同是治疗CAG的药物，其适应证从作用强度有所不同，研究者可根据药物的作用特点及条件，选择合适的造模方法。
(二)其他试验 1. 抗炎试验 胃黏膜的慢性炎症反应是CAG的病理特征之一，消除或减轻炎症是临床治疗目的之一。除在CAG模型评价药物的作用外，也可采用一般的非特异性炎症模型观察药物的抗炎效果，如棉球肉芽肿炎症模型、免疫性关节肿模型等。 2．止痛试验 疼是CAG临床症状之一，具有止痛作用的药物有利改善CAG的临床症状。观察药物的止痛效果，也叫作为评价药效的辅助指标，通常采用醋酸扭体法试验、热板法、离体肠管解痉试验等。 (三)阳性对照药 由于对CAG的治疗尚缺少特效药物，故理想的阳性药难以找到。国内在西药多选择维酶索作为对照药。作为中药新药研究，能选择功能相似的中药则较为理想，但必须是疗效比较肯定的，而且药效试验证明是有效的。鉴于目前市场疗效肯定的中药不多，研究者在选择时应加以注意，以保证阳性药质量。
三、动物模型的建立方法 (一)综合法复制CAG大鼠模型 1．原理 采用复合刺激因素，胆汁或主要成分(去氧胆酸钠)、热水、免疫损伤等对胃黏膜进行较长时间的刺激，造成胃黏膜慢性损伤，胃黏膜的营养代谢障碍，以致胃黏膜萎缩变薄、固有腺体减少、炎性细胞浸润、结缔组织增生而形成CAG。 2 . 方法 采用主动免疫2次，同时胆汁及热水灌胃连续70日。 (1) 主动免疫：每只大鼠皮下注射佐剂抗原(同种大鼠胃黏膜的生理盐水的组织匀浆与福氏佐剂以1：1配成的乳剂)0．3ml，1个月后重复注射1次。 (2)胆汁灌胃：进行第一次免疫的同时，采用无化脓性炎症病人的引流胆汁，按12．5ml／kg(体重)给大鼠灌胃(灌目前4h停食、自由饮水)，每日1次，连续70日。 (3)热水灌胃：在灌胃胆汁的同日(与灌胆汁间隔5h)灌胃50℃热水12．5ml／kg(体重)，每日1次，连续70日。
3．模型考核 造模结束，随机取少数动物进行生理病理、组织病理学指标检测，确认模型成功后才能进行药物疗效观察。 (1)生理病理学指标：胃黏膜pH(微玻璃pH电极直接测定)、胃黏膜血流量、胃黏膜电位差。 (2)组织病理学：固定部位取，通常在胃小弯及前后壁，常规石蜡包埋、切片、HE染色、光镜下观察胃窦、胃体变化。此法造模大鼠的病理学改变为：胃黏膜变薄，胃固有腺体减少，黏膜肌层增厚；胃黏腆pH升高，胃黏膜血流量、胃黏膜电位差下降。 4．药物疗效观察 造模结束，确认CAG成功后，将动物随机分组进行给药观察，治疗时间通常45~60日，治疗结束进行上述组织病理学，病理生理学指标检测，综合评价药物的疗效。 5．注意点 此法是采用多同素造模，每日须2次给大鼠灌胃，时间较长，要求操作者技术要熟练，否则易误伤食管、胃部或误入气管引起吸入性肺炎，造成不必要的动物死亡。动物的饲养、卫生条件都进行严格控制．确保模型成功的同时，不受其他疾病的干扰。
(二)综合法复制CAG大鼠模型 1．原理 采用去氧胆酸钠、热糊灌胃和免疫损伤的方法造成胃黏膜慢性损伤，以致胃黏膜营养代谢障碍，最后形成CAG。 2 方法 与前法不同的是，本法以去氧胆酸钠饲养代替人的胆汁灌胃，并以热糊灌胃主动免疫的方法。 (1)去氧胆酸钠饲养：0．2％去氧胆酸钠作为饮料给大鼠饮用，连续90日。 (2)主动免疫：造模的第一星期和第五星期，每只大鼠皮下注射佐剂抗原(同种大鼠胃黏膜的生理盐水组织匀浆与福氏佐剂以1：1成的乳剂)0．3ml。 (3)热糊灌胃：每隔1日灌胃热糊(55℃)10ml／kg(体重)，连续90日。
3．模型考核 造模结束，随机抽取少量动物进行组织病理学检测和胃酸、胃蛋酶测定。 (1)胃酸、胃蛋酶的测定：造模结束处死少数动物，摘胃，沿胃大弯剪开，用5ml蒸馏水浸洗胃黏膜3次，3000r／min离心10min，吸清液1ml测定胃蛋白酶活性(酪氨酸法)，其余采用酸碱中和法滴定胃液的酸度。 (2)组织病理学：沿胃小弯自前胃至幽门取全层胃壁一块，用10％甲醛溶液固定，常规包埋切片，HE染色，作光镜检查。 (3)炎症指标：炎症程度分四级(1—4级)：“1”无炎症；“2”在胃黏膜表层或底部有少量散在的炎细胞；“3”在胃黏膜部分均有较多的炎细胞；“4”在黏膜内聚集成堆的炎细胞浸润。在低倍镜观察全层胃黏膜，每一切片取10个视野：窦部4个，窦体交界处1个，体部4个，前胃与腺胃交界处1个。根据每个视野的炎症分级数，按窦部、窦体交界、体部、前胃与腺胃交界处等四个部位，分别取具均值进行比较。 此法造模动物胃黏膜病理学改变以胃窦部及胃体部改变明显，表现为胃黏膜变薄、黏膜肌增厚、炎性细胞浸润，胃的泌酸功能下降。
(三)MNNG法复制CAG大鼠模型 1 . 原理 MNNG为一种致癌剂，在诱发胃痛过程中，胃黏膜屏障受到破坏，早期胃黏膜经历从糜烂、萎缩、化生过程，符合人类CAG的病理变化。 2．方法 雄性Wistar大鼠，体重180-200g，常规颗粒鼠料喂养。在饮水中加入MNNG作为饮用液。方法是：每星期先用蒸馏水配成1g／L浓度的储存液，避光冷藏保存，同时用蒸馏水将其配成含MNNGl67ug／ml的饮用液，装入200ml的饮水瓶，外涂黑色，每日更换，大鼠尽量饮用，连续2个月。 3．病理检查 造模结束，断头处死动物．迅速取胃，沿胃大弯剖开，摊平，用生理盐水冲洗放入10％甲醛液固定，然后沿前壁、小弯和后壁自幽门至前胃剪取一条2cmx0.3cm病理材料，经常规包埋，切片、染色，光镜观察病理变化情况。
4 病理改变 本法造模动物病变以腺胃小弯、前壁受累较明显，病变不仅见于幽门区，遍及胃体各处。服用MNNG2个月，大鼠胃黏膜出现不同程度萎缩和修复增生，并有炎细胞浸润，2／3动物黏膜糜烂，个别动物糜烂同时见于幽门、胃体多处。 模型病理改变程度与服用MNNG时间的有关。大鼠饮用MNNG 1星期时，胃黏膜表皮及小凹局部遭到破坏，上皮剥脱，形成浅表糜烂，固有腺体尚完好，黏膜刚有层及黏膜下层充血，有炎细胞浸润，两星期时，黏膜糜烂加深，表面覆有炎性渗出物或结痂，腺体出现萎缩。位于胃体的黏膜固有腺体壁细胞和主细胞染色特征消失，部分腺体出现修复性增生，腺体数增多，排列较密，上皮呈方形，胞浆嗜碱，核大而深染，核分裂常见，但无异型。1个月时，黏膜萎缩和修复性再生都进一步加重，至2个月几乎难见到正常黏膜固有腺体，而为再生腺体取代。
(四)氨水法复制CAG大鼠模型 1．原理 氨水是—种胃黏膜屏障的破坏剂。低浓度的氨水给大鼠长时间饮用，造成对胃黏膜的慢性刺激，从而引起胃黏膜屏障及胃黏膜防御功能的破坏，胃黏膜营养代谢障碍，导致胃黏膜萎缩。 2．方法 选用Wistar雄性大鼠，200～220g，以0．02％氨水作为饮料给大鼠饮用，同时每隔7 日给大鼠灌胃l％氨水(10ml／kg)1次，连续90日。造模结束进行胃黏膜组织学检查。 3．注意点 大鼠以成年雄性大鼠为好，幼龄大鼠胃黏膜修复能力强，同法造模，其胃黏膜萎缩的程度轻于成年鼠。氨水宜隔日新鲜配制，所用氨水要新鲜。
一、实验设计的医学基础 便秘指粪便在结肠停留时间太久，水分含量降低，变干变硬，以至不易排出。分类有功能性便秘(或称原发性便秘)、器质性便秘(或称继发性便秘)、弛缓性便秘和痉挛性便秘。便秘的病因较复杂，常见的有胃肠道内容物运动速度减慢，胃肠道梗阻，结肠应激性减退，肠道肌张力减低或痉挛，精神过度紧张或抑郁等。 中医认为本病发病的原因，有燥热内结，津液不足，情志失和，气机郁滞，劳倦内伤，身体虚弱，气血不足等。辨证可分热秘、气秘、虚秘和冷秘四类。 继发性便秘应以治疗原发性疾病为主，中医药主要适用于原发性便秘的治疗。治疗目的为通利大便，排除肠道内宿食积滞。
二、药效学研究的实验设计 (一)对便秘模型的防治作用试验 1．常用便秘动物模型 (1)失水便秘模型：采用失水小鼠模拟津伤、肠燥之便秘。 (2)地芬诺酯模型：为非特异性便秘模型。 (3)实验型便秘模型：为粪性腹膜炎模型，模拟实热壅滞之便秘。 2．观察指标 (1)第一次排黑便时间。 (2)排便的粒数(或点数)、重量、性状。 3．方法学评价 燥结便秘模型为通过禁水不禁食使小鼠由失水引起肠水分缺少，大便于燥不易排出而出现便秘。地芬诺酯模型是绐止泻药地芬诺酯，增加肠张力，抑制肠蠕动和肠节段性收缩，使肠的内容物通过延迟，肠内水分吸收增加，引起大便秘结。两种模型基本都属于肠燥便秘，但造模方法不同，便秘发生的机制也有差异，实验时两个模型互相补充，对药效的反映更加全面。
(二)相关药效学试验和机理研究 1．对正常小鼠排便的影响 观察指标与便秘模型相同，可反映受试药物对在正常状态下动物的药理作用。 2．肠内容物推进速度试验 排便活动与肠的推进运动有关，肠推进运动减缓时，粪便在肠管滞留时间延长，利于水分吸收，引起便秘。炭末椎进试验方法以炭末为标志，灌胃后在规定时间内处死动物，取出胃肠，测量炭末头端在肠内推进的距离，作为观察小肠推进性运动的定量指标。试验可观察药物对正常小肠推进运动的影响，也可以观察药物拮抗肾上腺素负荷致推进减缓和阿托品(或吗啡)所致小鼠小肠推进减慢的作用。炭末排出时间测定方法同样以炭末灌胃后，观察粪便首次出现黑色炭末的时间，评价试药对小肠和大肠推进运动的影响。此外还有用酚红作为标志物定量测定胃排中和肠道推进运动，以及采用盲肠插管注入炭末混悬液测定大肠推进运动等方法，均可参考。 3. 对肠容积的影响 肠容积增大，可扩张肠管，促进排便运动，本项试验多用寸；药物升高肠腔渗透压，增大肠容积的药理作用。
4．肠管平滑肌试验 肠道运动主要是平滑肌的收缩和舒张，结合肠推进实验，可分析通便药对肠管运动的作用部位和机制，通常有离体或在体肠运动试验方法，离体肠法常采用豚鼠、大鼠或家兔的离体肠为材料，在体试验多用家兔、犬等较大动物。肠实验与肠推进实验也一样，对观察成药对正常肠管运动的影响外，还可采用肾上腺素、阿托品或乙酰胆碱负荷的方法，观察试药对药物引起的肠管运动抑制或兴奋的拮抗作用。 (三)阳性对照药的选择 首选功能、主治、制剂相似的有生产批文的中成药，目前通便中成药制剂较多，如麻仁丸(北京同仁堂)、便秘通(广州中药—厂)等，可供选用。西药有硫酸镁、液状石蜡等，直肠用药有甘油栓、开塞露等，但一般治疗便秘中药药效学实验很少作为阳性对照药选用。
三、动物模型建立方法 (一)失水便秘模型 1．原理 禁水后引起小鼠体液减少，模拟中医的伤津、肠燥便秘。 2．方法 取健康小鼠，禁水不禁食，用大米喂养7日。小鼠外观瘦小，尿色深黄，体重下降，大便结成圆珠状。实验前禁食禁水12h，给药溶液及水中加入2％墨汁。给药后小鼠置铺有吸收纸的钟罩内连续观察4h，记录小鼠第一次排便时间，粪便粒数及称量干粪重量，比较各组动物上述各项指标的差异。 3．注意点 ①动物可选用老年大鼠更易成功；②造模禁水不禁食时间有采用3日时间的，可根据各试验室经验选择；③给药时间也有于禁水72h后进行的，同样根据经验选择；④给药组给药液，对照组给等量蒸馏水。
(二)地芬诺酯模型 1．原理 地芬诺酯系呱替啶的衍生物，为人工合成，能加强肠张力，抑制肠蠕动，增加肠的节段性收缩，使肠的内存物通过延迟，从而使肠内水分吸收增加，动物造模即利用地芬诺酯这些药理作用，灌胃给予地芬诺酯，使小鼠肠道水分吸收增加而引起肠燥便秘。 2，方法 小鼠禁食不禁水12h后，灌胃给复方地芬诺酯，剂量50mg／kg， 然后观察给药后12h内小鼠的干粪点数、稀粪点数及不排便的动物数。 3．注意点 地芬诺酯的剂量可根据预实验结果适当调整，以给药后小鼠无稀粪，干粪点数少于正常对照组，70％以上有部分不排便为参考标准。
(三)实热型便秘模型 1．原理 本模型模拟急性细菌性腹膜炎，该病在临床上可出现阳明腑实证，痞、满、燥、实、坚，需用寒下法通里攻下治之。 2．方法 取小鼠自家粪少许，磨碎，加生理盐水适量，制成自家粪混悬液。缩小鼠腹腔注射自家粪混悬液0．5ml。l8h后，可见动物竖毛、少动，蜷曲蹲伏、不进食。解剖腹内有少量混浊液体，肠管充血，表面有纤维素性沉积物附着，多数肠管充气膨胀，部分肠管痉挛。
一、实验设计的医学基础 泄泻是指排便次数、便量和水量比平时增加，粪便稀溏，井可有未消化的食物、黏液、脓血及脱落的肠黏膜等。渗出性腹泻可由肠道炎症、溃疡、肿瘤浸润等引起；渗透性腹泻常见原因为消化不良，吸收不良和肠系膜淋巴管梗阻；分泌性腹泻则与细菌感染或内分泌肿瘤有关。此外肠易激综合征、甲状腺功能亢进等引起肠道运动功能紊孔，是常见病因之一。 对泄泻应首先引对不同病因分别给予治疗，例如肠道感染给抗菌药，肿瘤则应手术切除等抗肿瘤治疗。止泻药只是针对泄原发病因的治疗后考虑使用。西药一般分为四类：①阿片及其衍生物制剂，通过抑制肠管运动而止泻；②吸附剂，通过表面吸咐作用吸附水、气、细菌、毒物而起止泻作用；③收敛剂，能凝固蛋白质形成层而使肠道免受有害因子刺激，减少分泌；④保护剂，能在胃肠道黏膜创面形成一层保护膜，使之不受刺激而减轻腹泻。 中医队为泄泻的主要病变在脾胃与大小肠，病因与感受外邪、饮食所伤、情知失调及脾胃虚弱或肾阳虚衰有关，其主要病因病机在于脾胃功能障碍。辨征分为温热、食滞、肝胃不和、脾胃虚弱及肾阳虚衰等类型。治法有散寒化湿、清热利湿、消食导滞、调和肝脾、健脾和胃、温肾固涩等。
二、药效学研究的实验设计 (一)对泻下动物病理模型的治疗作用试验 1．常用药物致泻动物模型 通过灌胃给蓖麻油、番泻叶或大黄等泻下药刺激肠道引起泄泻。 2 观察指标 粪便总粒数、重量或同时记录排湿粪动物数等。 3 方法学评价 造模方法简便易行，能较准确反映受试药物的止泻作用。某些对肠道运动无明显影响的受试药，更适采用本法观察止泻作用。 (二)阳性对照药 止泻试验的阳性对照药选现有中成药或西药，但止泻西药的作用较肯定，如复方地芬诺酯、盐酸洛哌丁胺、次碳酸铋等。中药可选用腹可安等，疗效也较满意。
三、动物模型的建立方法 1．原理 蓖麻油、大黄、番泻均属刺激性泻药，给药后能刺激动物的肠黏膜，增加肠蠕动，促进排便。小医认为大黄、番泻叶性味苦寒，归大肠经，能致泻，因此所造模近似中医的“脾虚泻”、“寒泻”。 2．方法 番泻叶制剂的制备：取干燥叶片，研成细末(叶脉弃去不用)，先用沸蒸馏水研和，再加冷蒸馏水配制成8％的混悬液备用。大黄制剂的制备：取生大黄l00g，砸碎，以水浸泡24h，过滤，40℃水济浓缩至lg/ml。造模时取体重20k的纯种健康小鼠，一般先给预试药，然后以8％的番泻叶粉混悬液灌胃，也可以用大黄水浸液，蓖麻油代替灌胃造模，小鼠放在滤纸(也可用浅色吸水纸)上，以湿粪多少表示腹泻的程度，也可分别记录正常便、软便(便形不零散)、烂便(便形中间崩散)和泻下便：观察给番泻叶(或大黄、蓖麻油)后1-6h，每小时换纸1次，7-24h后计数。
3．注意点 (1)小鼠必须分笼(或分格)单独饲养观察，笼底网眼适当稍大，以便湿粪可随时掉至笼下。或用大玻璃漏斗罩住小鼠，更易于观察，可避免粪便沾在笼网。 (2)试验前应先将小鼠分笼饲养，观察1—2日，有泄泻(湿粪)的动物不应选取进行实验。 (3)造模前先给受试药物，剂量和疗程根据预试验结果制定。 (4)由于药材来源，质量等关系，大黄、番泻叶的提取方法、剂量也可根据预试验结果适当调整。 (5)湿粪的识别，指近似圆形的糊状软粪或稀粪，在滤纸上，其周围有棕色环带，而正常的干粪则呈饼棍形或梭形，在滤纸上，其周围不显颜色。 (6)给泻下药后，1—6h，每小时换滤纸1次，必要时可缩短换纸时间，如不及时换纸，容易造成粪重叠，影响计数，6h后，湿粪减少，可少换或不换纸。 (7)评价试药的止泻作用，计算和比较各组小鼠24h湿粪总数。也可比较排湿粪的动物数，或比较各组不同粪便性质的数，根据试验具体情况考虑。
一、实验设计的医学基础 肝纤维化、肝硬化是一种或多种病因长期或反复作用引起的慢性进行性弥漫性肝脏损害的—种疾病。在我国本病发病的主要病因是病毒性肝炎、血吸虫病、乙醇中毒、毒物和药物、胆汁淤积、循环障碍和代谢紊乱等。一是可引起脂肪积蓄形成脂肪肝，二是肝细胞受到反复而广泛的损害，肝细胞变性、坏死，继而由肝细胞的再生和纤维组织增生，使肝脏组织结构破坏，质地变硬，发生硬化。 根据肝硬化的临床表现特点，属中医的”臌胀”、“黄疸”、”胁痛”、“积聚”等病证，形成肝硬化的病机，早期是肝脾的功能失调。先是肝气失条达，郁结日久，脾失健运，湿浊不化，进一步阻滞气机，脾虚及气机阻滞，使瘀血蕴里，络脉壅塞，日久则成痞呋。瘀结日久，肝脾进一步受损，水湿停聚并波及了肾。因此气滞、血瘀、水停是肝硬化的三个重要病理变化。中医早期治疗多疏通肝气，兼顾补脾运湿，中期化瘀、行气，补脾并养血柔肝，晚期化瘀逐水，健脾益肾。西医则注重休息，高热量高蛋白饮食，此外药物的治疗是补充维生素c、E及B族，保肝用肝太乐、维内肝等。青霉胺被认为有纤维化作用，免疫功能调节剂可调整机体免疫功能，因此临床均可使用，、但需注意青霉胺副反应较多，其他药物疗效不够稳定，故防治脂肪肝、肝纤维化、肝硬化的药物尚需进一步开发。
二、药效学研究的实验设计 (一)对疾病动物模型的防治作用试验 1，常用动物模型 (1)乙硫氨酸模型：乙硫氨酸有左旋、右旋及消旋光学异构体，乙硫氨酸可引起肝脏脂肪变性。由于化学结构与硫氨酸相似．后者为体内甲基转换的供体，乙硫氨酸与之竞争，取代甲基而提供乙基，使肝脏蛋白质合成发生障碍，使生成的RNA和蛋白质含有乙基而非甲基，由于蛋白质合成障碍，导致三酰甘油(甘油三酯)蓄积于肝脏，引起脂肪肝，长期给药可形成肝硬化或肝痼，此模型操作简便，成功率高，适合抗脂肪肝药物筛选。 (2)营养不良、乙醇、四氯化碳复合因素肝硬化模型：采用两种方法造成营养不良性肝硬化，一是给予高脂肪、低蛋白质、低胆碱饮食，使肝肌发生脂肪变性，逐渐形成肝硬化，二是食物缺乏营养物质，如胱氨酸、蛋氨酸、维生素K等，引起肝细胞坏死，发展为肝硬化，上述两种营养不良法再加上乙醇和四氯化碳，可加速脂肪肝的发展，因脂肪变性的肝细胞对CCl4损伤作用敏感，故大量肝细胞坏死，网状支架塌陷，纤维增生，发展为肝硬化。
(3)酒精(乙醇)性肝损伤、肝纤维化、肝硬化模型：乙醇能改变生物膜的蛋白和脂质的比例，导致膜的损伤，能改变膜对钙的通透性，使大量钙内流而致细胞死亡。乙醇还能结合到膜的脂质层，使膜的生理功能发生改变。动物灌服乙醇后首先经胃肠道吸收，先进入门静脉，通过毛细管迅速散到全身细胞内、外液，进入体内的乙醇90％—98％在肝脏代谢，所以消化系统的损害较之其他系统就比较突出，大鼠连续服用2—3个月，更长时间，开始肝损伤逐渐便可发展为脂肪肝、肝纤维化，最后导致乙醇性肝硬化。 (4)猪血清(PS)大鼠肝纤维化模型：PS反复腹腔注射可形成肝纤维化 实验可采用PS与甲基亚硝胺(DMA)合用绣发肝细胞纤维化，模型与CCl4诱发的纤维增生不同，不是细胞坏死造成的。DMA与PS诱发的肝纤维化分别是通过抑制胶原酶活性和刺激脯氨酰羟化酶，与肝细胞坏死性炎症无关。 (5)四氯化碳反复给与造成肝硬化：反复给予CCl4可造成肝中毒，致使肝细胞变性、纤维增生而致肝硬化。病理变化有肝结构紊乱，静脉回流受阻，肝静脉高压，促进肝内动静脉吻合支形成致使肝细胞供血减少、血清白蛋白减少，血浆凝集素减低，纤维蛋白原减少和血清转氨酶升高。
2 方法学评价 脂肪肝、肝纤维化动物模型较急慢肝损伤动物模型较难复制，时间长且程度不一，复合法所制模型较稳定，一般6星期末全部动物叫达到重度纤维化及肝硬化，作为防治肝纤维化药物筛选用，近来，长期给乙醇制品(如市场所售烈性酒)造成脂肪肝的模型以及猪血清动物模型也逐渐多用于研究，有所创新，实验结果可靠，与临床肝硬化病症近似。 (二)阳性对照药 前述抗急慢性肝损伤的中西药也可防治肝纤维化、肝硬化。西药抗肝纤维化的药有亚甲蓝，它抑制乙醇诱导的前胶原基因的表达，起抗乙醇肝纤维化作用。此外，皮质激素、青霉胺、秋水仙素和Y—干扰素均可分别作用于胶原的不同环节，起到抑制胶原合成的作用，可作为阳性对照药用。
三、肝纤维化、肝硬化、脂肪肝模型的建立方法三、肝纤维化、肝硬化、脂肪肝模型的建立方法 (一)猪血清诱导免疫损伤性肝纤维化大鼠模型 1．原理 猪血清可刺激大鼠产生抗猪血清抗体形成免疫化合物沉积于肝窦和血管，激活补体，引起炎症细胞浸润，释放炎症介质，造成肝细胞损伤、坏死，形成纤维化。 2．方法 实验采用雄性Wistar种大鼠，体重130g左右。新鲜猪血离心取血清，滤过除菌备用。每只大鼠腹腔注射猪血清0. 5ml，每星期2次，连续8—12星期。处死大鼠后，取血清做血清生化检测，同时取肝脏进行组织学观察。见不同程度的病变。 3. 注意事项 (1)猪血清复制免疫性肝纤维化模型以第四早期为最重，该模型纤维化出现较早，出现率高达86．7％。 (2)实验测定指标根据实验需要进行选择。 (3)必须进行病理组织学的检查，以确定纤维化的程度。 4．评价 猪血清诱导肝纤维化动物模型方法简便、周期短、经济可靠。动物模型稳定性好，发生率高，动物损伤小．生长状态良好，死亡率低，目前认为该模型有望成为肝纤维化的较理想的动物模型。
(二)CCl4复合因素肝纤维化模型 1．原理 玉米粉仅含9％蛋白质，只能满足鼠正常蛋白质需要量之一半，且此蛋白质中缺乏色氨酸与蛋氨酸，这些氨基酸属趋脂物质．缺乏会导致肝脂肪变，以致纤维化，加入胆固醇增加机体对胆碱需要量，从而加速脂肪肝的发展。脂肪变性的肝细胞对CCl4损伤作用敏感，肝细胞大量坏死，网状架塌陷，纤维增生，发展肝硬化。 2 方法 采用SD或Wistar雄性大鼠，体重150-200g，实验第一日皮下注射40％CCl4植物油溶液0．3～0．5ml／l00g(体重)，以后每隔3日(或4日)皮下注射40％CCl43ml／kg(体重)。以79. 5％单纯玉米粉加20％猪油、0. 5％胆固醇成混合饲料，另外30％乙醇为饮料饲养动物，实验第六星期末，即可形成肝硬变。 3．注意 (1)肝纤维化肝硬化所测血清生化学指标与急慢性肝损伤模型类似，可选择几项进行，但必须测定血或肝组织脯氨酸含量和肝胶原蛋白含量。 (2)病理组织学观察十分重要，采用HE染色和胶原纤维染色等方法进行。侧重于成纤维细胞、纤维细胞和增生的胶原纤维的观察。
