Leszt genetika s molekul ris biol gia
This presentation is the property of its rightful owner.
Sponsored Links
1 / 82

ÉLESZTŐ GENETIKA ÉS MOLEKULÁRIS BIOLÓGIA PowerPoint PPT Presentation


  • 43 Views
  • Uploaded on
  • Presentation posted in: General

ÉLESZTŐ GENETIKA ÉS MOLEKULÁRIS BIOLÓGIA. A Saccharomyces cerevisiae élesztő : a természetben és alkalmazásai Más élesztők Az élesztő eukarióta: az élesztő sejt Az élesztő szexuális ciklusa és nemi élete Élesztő genetika: alapok Élesztő genetika: élesztő törzsek keresztezése

Download Presentation

ÉLESZTŐ GENETIKA ÉS MOLEKULÁRIS BIOLÓGIA

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation

Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author.While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server.


- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - E N D - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

Presentation Transcript


Leszt genetika s molekul ris biol gia

ÉLESZTŐ GENETIKA ÉS MOLEKULÁRIS BIOLÓGIA

  • ASaccharomyces cerevisiaeélesztő: a természetben és alkalmazásai

  • Más élesztők

  • Az élesztő eukarióta: az élesztő sejt

  • Az élesztő szexuális ciklusa és nemi élete

  • Élesztő genetika: alapok

  • Élesztő genetika: élesztő törzsek keresztezése

  • Élesztő genetika: mutáns készítés

  • Élesztő gének klónozása: vektorok

  • Élesztő gének klónozása komplementációval

  • Élesztő gének deléciója

  • Okos géndeléciók és transzpozon mutagenezis

  • Tovább: gének/fehérjék

  • Az élesztőben vizsgált modell rendszerek

  • Élesztő biotechnológia


Leszt www helyek

Élesztő WWW helyek

  • http://www.phys.ksu.edu/gene/chapters.html

  • http://genome-www.stanford.edu/Saccharomyces/VL-yeast.html

  • http://genome-www.stanford.edu/Saccharomyces/yeastlabs.html

  • http://genome-www.stanford.edu/Saccharomyces


A saccharomyces cerevisiae leszt a term szetben s felhaszn l sa

ASaccharomyces cerevisiaeélesztő:a természetben és felhasználása

  • Az élesztő gyümülcsökön, virágokban és más cukrot tartalmazó helyeken él

  • Az élesztő igen változatos éghajlati körülményekkel is megbírkózik:

    • Tűrik fagyponttól ~55°C-iga hőmérsékletet

    • 12°C-tól 40°C-ig képesek osztódni

    • pH 2.8-8.0 lehetséges a szaporodásuk

    • Elviselik a gyakorlatilag teljes kiszáradást (por élesztő)

    • Az élesztő még képes növekedni és fermentálni 3M-os cukor koncentráción (nagy ozmózis nyomás)

    • 20% alkohol koncentrációt még túlél

  • Saccharomyces cerevisiaemás élesztők mellet a borkészítés fő organizmusa (mert fermentációs kapacitása nagy és jól tűri a kis pH-t és a nagy etanol koncentrációt)

  • Saccharomyces cerevisiae (carlsbergensis)a sörélesztő, mert még oxigén jelenlétében is alkohollá fermentálja a cukrokat, a lager élesztő 8°C-on is fermentál

  • Saccharomyces cerevisiaea pékélesztő is, cukrokból gyorsan készít széndioxidot

  • Saccharomyces cerevisiae- vel termeltetnek sok értékes fehérjét, mert rekombináns DNS technikákkal jól kezelhető, elismerten biztonságos és fermentációs technológiája nagyon fejlett.

  • Saccharomyces cerevisiaehasználható drog screening-re és funkcionális analízisre, mert eukarióta és gyakorlatilag olyan könnyen kezelhető, mint a baktériumok.

  • ASaccharomyces cerevisiaea legfontosasbb eukarióta sejt modell rendszer, mert genetikai és sejtbiológiai vizsgálata hatékony; az eukarióta sejtek sok fontos tulajdonságát élesztőben fedezték fel.

  • Ezért aS. cerevisiae–t olyan kutatásokban használják, amelyek az élő sejt tulajdonságainak megismerését, a funkciókat működtető mechanizmusok felderítését célozzák, továbbá a már meglévő biotechnológiai eljárások javítását, vagy újak elkészítését szolgálják.


N h ny fontos leszt

Néhány fontos élesztő

  • Schizosaccharomyces pombe, a hasadó élesztő, a molekuláris és a sejtbiológia fontos modell organizmusa, néhány fermentációban használják.

  • Kluyveromyces lactis, a tej élesztő; modell organizmus némi biotechnológiai jelentősséggel alaktóz fermentáció miatt

  • Candida albicans, nem jó modell, mert nincs szex-ciklus; de vizsgálják, mert humán patogén

  • Saccharomyces carlsbergensisésSaccharomyces bayanus: aS. cerevisiaeközeli rokonai, sör és bor készítésre használják.

  • Pichia stipidis, Pichia pastoris, Hansenula polymorpha, Yarrovia lipolyticagenetikai vizsgálata kisebb jelentőségű (speciális tulajdonságok, mint pl. a peroxiszóma biogenezise), fehérje termelő gazdák

  • Fonalas gombák, a nemzetségek nagy csoportja, mint genetikai modell organizmus, mint pl.Cryptococcus, Aspergillus, Neurospora...., biotechnológiai jelentőség, humán patogének is. A S. cerevisiaeis képes fonalas növekedésre.


A saccharomyces cerevisiae eukari ta

ASaccharomyces cerevisiae eukarióta

  • Ascomyceta gomba

  • Egysejtű, pszeudohifa képzés képességgel

  • S. cerevisiaesarjadzással osztódik (hiszen: sarjadzó élesztő), míg a Schizosaccharomyces pombehasadással osztódik (hasadó élesztő)

  • A sarjadzás két nem azonos méretű sejtet eredményez, egy anya (öreg) és egy leány (új) sejtet.

  • Az élesztő nem kortalan; a sejtek öregszenek és az anya sejt 30-40 osztódás után elpusztul.

  • A sejt az eukariótákra jellemző szerkezetű, különböző organellumokkal:

    - A sejtfal glukánokat, mannánokat és fehérjéket tartalmaz.

    • Periplazmatikus tér hidrolítikus enzimekkel

    • Plazma membrán foszfolipid kettősréteggel és sok különböző fehérjével.

    • Nukleusz nukleolusszal

    • Vakuolumok mint tároló és hidrolitikus szervecskék

    • Szekréciós útvonal endoplazmatikus retikulummal, Golgi apparátus és kiválasztó hólyagocskák.

    • Peroxiszómák az oxidatív degradációhoz

    • Mitokondriumok a légzéshez

Az élesztő sejt kb. 4-7mm nagy.

Az alján látható „szemek” a

hasadás utáni sebhelyek.


Az leszt k letciklusai

Az élesztők életciklusai

Sarjadzó élesztő

Hasadó élesztő


Az leszt nek van szexu lis lete

Az élesztőnek van szexuális élete!

  • Az élesztő sejtek haploidként (1n, minden kromoszómából egy kópia) és diploidként (2n, két kópia minden kromoszómából) is tudnak létezni; a 2n sejtek 1,2-szer nagyobbak.

  • A haploid sejtek a vagy a párosodási típusúak.

  • Két haploid sejt párosodik és zigótát képez;az élesztő nem tud mozogni, ezért egymás felé kell nőniük (shmoos).

  • A diploid zigóta a kapcsolódás helyén kezd osztódni.

  • Nitrogén éheztetésre a diploid sejt meiozison megy át és négy haploid spórát tartalmazó aszkusz képzése közben spórázik.

  • Ezért bár az élesztő egysejtű, különböző sejt típusokat tudunk megkülönböztetni, különböző genetikai programmal:

    • Haploid MATaésMATa

    • Haploid és Diploid (MATa/a )

    • Spóra

    • Anyák és lányok


Leszt genetika s molekul ris biol gia

Élesztő szex!

  • A szexuális kommunikáció központjában a feromon válasz szignál transzdukciós útvonal van.

  • Ez egy komplex felépítésű útvonal, ami az a- vagy az alfa-faktorra adott választ szabályozza az élesztő sejtekben.

  • Ennek az útvonalnak minden eleme, az élesztőtől az emberig, konzerválódott.Az útvonalban van az a- vagy alfa-faktort kötő receptor (a G-fehérjével kapcsolt hét-transzmembrán receptorok osztályába tartozik, mint sok humán hormon receptor).A feromon kötődése a sejthez a sejtet a feromon forrása, a párosodási partner felé irányítja.

  • A feromon kötődése stimulál egy jelátvivő kaszkádot, az úgynevezett MAP (Mitogen Activated Protein) kinázútvonalat (sok emberi, állati és növényi útvonalhoz hasonlóan).

  • A jelátvivő útvonal megállítja a sejtciklust, hogy a sejtek felkészülhessenek a párosodásra (a sejteknek szinkronban, a G1 fázisban kell lenni a fúzióhoz).Az útvonal a párosodásban fontos gének megnyilvánulását szabályozza.


Leszt szex

Élesztő szex!

  • Aktus közben: sejt-sejt kapcsolódás, sejt fúzióés sejtmag fúzió elektron mikroszkópi képe.

  • A haploid sejtek párosodási feromon peptideket készítenek: a- illetve alfa-faktort, amire a párosodási partner válaszként felkészül a párosodásra.

  • Ez azt jelenti, hogy az eltérő nemű élesztő sejtek genetikailag megkülönböztethetőek, hiszen eltérő gének készlete nyilvánul meg bennük.

  • Vagyis, olyan haploid specifikus gének, amelyek részt vesznek a feromonra adott válaszban, továbbá azRME1gén, ez a meiózis represszorát kódolja.

  • Az a-specifikus gének, amelyek az a-faktor termeléséhez kellenek és az alfa-faktor receptor génje.

  • Az alfa-faktor termeléshez szükséges és az a-faktor receptor gének.


Az leszt sejt t pus nak genetikai meghat rozotts ga

Az élesztő sejt típusának genetikai meghatározottsága

  • A párosodási típust a III-as kromoszóma MAT lokuszán lévő allél határozza meg.

  • A párosodási típus lokusz szabályozó fehérjéket kódol, azaz transzkripciós faktorokat.

  • AMATa lokusz kódolja az a1 transzkripciós aktivátort (az a2 funkciója nem ismert).

  • AMATalpha lokuszkódolja az alfa1 aktivátortés az alfa2 represszort.

  • A párosodási típus lokusz mester szabályozó lokuszként működik: sok gén megnyilvánulását szabályozza.


A p rosod si t pust meghat roz g nek expresszi ja

A párosodási típust meghatározó gének expressziója

  • Az alfa sejtekben az alfa1 aktívátor stimulálja az alfa-specifikus géneket és az alfa2 represszor gátolja az a-specifikus géneket.

  • Az a sejtekben nem aktíválódnak az alfa-specifikus gének és nem represszálódnak az a-specifikus gének, más, eltérő transzkripciós aktívátort használnak a megnyilvánuláshoz.

  • A diploid sejtekben az a1/alfa2 heteromer represszor gátolja alfa1 megnyilvánulását és ezért az alfa-specifikus gének csendesek. Az a- és a haploid-specifikus gének szintén represszáltak.

  • Ilyen haploid-specifikus gén a meiózis represszorát kódolóRMEés bár a diploidokban nem nyilvánul meg; a meiózis és a spórázás programok csak tápanyag limitációra kezdődnek el.

  • Összegezve, a sejt típust nagyon kevés primer transzkripciós faktor határozza meg, amelyek egyénileg, vagy pedig kombinációban hatnak.

  • Ez sarkalatos alapelv és a soksejtű organizmusokban is konzerválódott a különböző sejttípusok meghatározásánál: pl. homeotikus gének ( és valóban, az a1 homeobox faktor)


Haploidok s diploidok a term szetben s a laborban

Haploidok és diploidok a természetben és a laborban

  • A természetben az élesztő sejtek mindig diploidként növekednek, valószínűleg azért, mert javítja túlélési esélyeiket, ha esszenciális génjükben lesz mutáció (mindig van egy másik példány).

  • Nitrogén éheztetésre a diploid sejt spórázik és később a haploid spóra kicsírázik, már ha minden nélkülözhetetlen génje működőképes.

  • Ez gyakran azt jelenti, hogy jó ha egy tetrádból egy spóra életképes.

  • Hogyan lehetünk biztosak, hogy ez az egyetlen spóra talál magának párosodási partnert, hogy újra diploidot képezzenek? A válasz a párosodási típus váltás(mating type switch)!

  • Az első osztódás után az anya-sejt típust vált és párosodik a leányával, hogy diploidot képezzenek, ami persze homozigóta az összes génjére és a sejtek új klónját jelentik.

  • Ha a párosodási típus váltható és a diploid a kedveltebb forma, akkor mi szükség van spórázásra és párosodási típus váltásra?

  • Lehet rá néhány ok: (1) A spórák sokmindent túlélnek (2) A spórázás egy lehetséges módja annak, hogy megszabaduljon a felhalmozódott mutációktól. (3) A meiózis alkalom az allélok új kombinációjának kialakítására, ami előnyösebb lehet, mint a korábbi (4) Néha a sejtek egy másik tetrádból találnak maguknak párt és képeznek egy új klónt, amelyiknek előnyösebb lehet az allél kombinációja

  • Azért, hogy az élesztővel genetikai vizsgálatokat lehessen végezni és, hogy haploid sejteket lehessen szaporítani a laborban, a párosodási típus váltást meg kell előzni: ezért az összes laboratóriumi törzs HO mutáns és nem tud váltani.

  • Hogyan is működik ez a szex váltó?


A haploidok k pesek p rosod si t pust v ltani

A haploidok képesek párosodási típust váltani!

  • A párosodási típus váltást két csendes, ugyanazon a kromoszómán lévő párosodási típus lokusz okozza, amelyek akkor válnak aktívvá, ha áthelyeződnek (transzlokálódnak) a MAT lokuszba

  • A MAT lokusz ezen két kópiájának csendesítését részletesen vizsgálták és vannak a magasabb rendűek sejtjeiben is konzerválodott tulajdonságok: heterokromatin képzés.

  • A transzlokáció egy a HO nukleáz által kezdeményezett génkonverzió, ez úgy vág mint egy restrikciós enzim a a kromoszómán lévő párosodási típus lokusz közepébe

  • A laboratóriumi élesztő törzsekből hiányzik a HO nukleáz, ezért stabilan haploid fázisban vannak

  • Érdekes, hogy csak az anya sejt tud váltani

  • Ez biztosítja, hogy osztódás után ellentétes típusok legyenek

  • Ez a szabályozó fehérjék egyenlőtlen öröklődése miatt van

  • Ez a stratégia konzerválódott és a soksejtű organizmusokban a sejtek differenciálódását okozza (anyai hatás)


Leszt genetika az r k t anyag

Élesztő genetika: az örökítő anyag

  • AS. cerevisiaesejtmag genomja 16 kromoszómát tartalmaz

  • Ezen kívül, még van mitokondrium genom és egy plasztid, a 2micron-os plazmid

  • Az élesztő kromoszómáknak van centromerje és telomerje, amelyek egyszerűbbek, mint a magasabb rendű eukariótáké

  • A haploid élesztő genom körülbelül 12 500 kbp és 1996-ra teljesen szekvenálták ( ez volt az első eukarióta genom szekvencia)


Leszt genetika s molekul ris biol gia

Élesztő genetika: az örökítő anyag

  • Az élesztő genom a predikció szerint körülbelül 6 200 gént tartalmaz, annotációjuk még folyamatban van

  • Számottevő a redundancia, ami egy ősi genom duplikáció következménye

  • Ez azt jelenti, hogy számos génnek van nagyon közeli homológja, amelyek viszont gyakran másként szabályozódnak

  • A legextrémebb példa a cukor transzporter géneké, ezekből több mint húsz van

  • A géneknek durván 1/3-át jellemezték genetikai analízissel, 1/3-uk biokémiai funkciója homológia alapján becsülhető, a maradék harmad nem homológ más génekkel, vagy csak eddig még nem jellemzett génekhez hasonlít

  • Az élesztő géneknek csak kis hányada tartalmaz intront, nagyon kevésben van egynél több; az intronok térképezése még nincs készen

  • A gének közötti intergénes szekvenciák csak 200 és 1000 bp között vannak (intergenic space)

  • A legnagyobb ismert regulátor szekvenciák több mint 2800 bp-ra terjednek ki (MUC1/FLO11)


Leszt genetika s molekul ris biol gia

Élesztő genom analízise

  • Az élesztőt kutató társaságok közös célja: minden egyes gén funkciójának meghatározása

  • Ezért néhány nagy program, különböző megközelítési módokkal működik

  • Micro array analízis: a megnyilvánuló gének szimultán meghatározására

  • Micro array analízis minden transzkripciós faktor kötőhelyének meghatározására a genomon

  • Élesztő deléciós analízis: a teljes készlet, több mint 6000 deléciós mutáns van készen

  • Különböző megközelítésekkel vizsgálják ezeket a mutánsokat

  • Minden élesztő gént jelöltek a zölden fluoreszkáló fehérjével (GFP), ami lehetővé teszi a fehérje lokalizációjának megállapítását mikroszkópos vizsgálatokkal

  • Különböző globális fehérje kölcsönhatási vizsgálatok vannak folyamatban


Leszt genetika nomenklat ra

Élesztő genetika: nomenklatúra

  • Az élesztő gének neve három betűből és legfeljebb három számból áll:GPD1, HSP12, PDC6...Általában elegendő (vagy nem) rövidítések

  • A vad típusú géneket nagy, dőlt betűkkel írjuk: TPS1, RHO1, CDC28...

  • A recesszív mutáns géneket kis dőlt betűkkel: tps1, rho1, cdc28

  • A mutáns alléleket kötőjel meg egy számmal: tps1-1, rho1-23, cdc28-2

  • Ha a mutáció konstruált, pl. gén delécióval, akkor azt is jelöljük, meg a delécióhoz használt genetikai markert is : tps1D::HIS3

  • A gén termékét, a fehérjét nagy kezdőbetűvel írjuk és álló betűkkel; gyakran egy „p” betűt teszünk a végére:Tps1p, Rho1p, Cdc28p

  • Sok gént csak szisztematikus szekvenálással találtak meg és amíg funkciójukat meg nem határozzák, addig csak a helyzetükből adódó nevük van: YDR518C, YML016W..., ahol

    • Ya ”yeast”-ből jön

    • A második betű a kromoszómát jelöli (D=IV, M=XIII....)

    • LvagyRa jobb vagy bal kromoszóma kart jelenti

    • A három számjegy azt, hogy hányadik ORF a centromertől számítva az adott kromoszóma karon

    • CvagyWa ”Crick” vagy ”Watson” szálat jelenti, vagyis az ORF irányát

  • Néhány gén nem ezt a nomenklatúrát követi,amit már ismernek: HO, MATa, MATa


Leszt genetika markerek s t rzsek

Élesztő genetika: markerek és törzsek

  • A genetikai bélyegekkel (markerek) követhetjük a kromoszómákat a genetikai keresztezéseknél és szelektálhatjuk a diploidokat. Ezek alapján szelektálhatjuk a transzformánsokat plazmiddal történő transzformáció, vagy a genomba történő gén integráció után

  • Gyakori genetikai bélyeg az auxotrófia: HIS3, URA3, TRP1, LEU2, LYS2, ADE2

  • Azade2 mutáció nagyon hasznos, specifikus tulajdonsága van: a sejtek pirosak lesznek

  • Az élesztő genetika első markerei fermentációs markerek voltak, vagyis néhány szubsztrát hasznosítását kódoló gének: SUC, MAL, GAL

  • A SUC gének (SUC1-7) invertázt kódolnak (periplazmás enzim) és különböző élesztő törzsekben különböző kromoszómákra térképeződnek (telomer lokáció)

  • MALlokuszok (MAL1-6) három gént kódolnak: maltáz, maltóz transzporter és egy transzkripciós aktivátor; szintén telomer lokáció

  • GAL gének a galaktóz felvételt és a glükóz-6-foszfáttá konvertáló enzimeket kódolják

  • Mint azE. coli- nál itt is használunk néhány antibiotikum rezisztencia gént transzformácóknál: kanamicin rezisztencia, kanR

  • Sok élesztő törzset használnak a laboratóriumokban: W303-1A, S288C, S1278b, SK1, BY4741....

  • Sajátos tulajdonságaik nagyon különbözhetnek és különböznek a vad, vagy az ipari törzsektől

  • Egy kedvenc törzs, a W303-1A teljes genotípusa a következő: MATa leu2-3/112 ura3-1 trp1-1 his3-11/15 ade2-1can1-100 GAL SUC2mal0


Leszt genetika t rzsek keresztez se

Élesztő genetika: törzsek keresztezése

  • Az élesztő genetika azon a lehetőségen alapul, hogy hogy két ellentétes párosítási típusú és eltérő mutációkat hordozó haploid törzset keresztezni lehet és diploid törzset kapunk

  • A diploid törzset aztán már vizsgálni lehet, hogy például a haploid törzsek mutációja ugyanabban a génben, vagy pedig más génekben van-e

  • A diploid spóráztatható, tetrádokat képez, a tetrádok mikromanipulátorral szétszedhetők, a spórák különálló telepeket képeznek, amelyek már tovább vizsgálhatók

  • A múltban rengeteg ilyen keresztezést végeztek, hogy megállapíthassák a gének elhelyezkedését a kromoszómákon: meghatározták a két mutáció rekombinációs gyakoriságát (mindkét mutáció egy spórában, vagy pedig mutáció nélküli spóra), ami a genetikai távolság mérésére alkalmas

  • A szekvencia meghatározása előtti utolsó géntérkép több mint 1000 gént tartalmazott és nagyon pontosnak bizonyult, ami az élesztő fantasztikus rekombinációs hajlandóságának is köszönhető

  • Manapság a genetikai keresztezést (genetic cross) új mutánskombinációk elkészítéséhez használják, pl. kettős, háromszoros, négyszeres….. mutánsok, ezért is jó, ha ismerjük a genetikai keresztezések és a gén szegregáció néhány alapelvét

  • A genom szekvencia ismeretében sem nélkülözhetjük az új mutánsok előállítását és screenelését, például azért, hogy találjunk a már ismert gének mellett újakat is amelyek részt vesznek ugyanabban az útvonalban. Az új mutáns genetikai analízise az első és nélkülözhetetlen lépése a jellemzésnek


Leszt genetika t rzsek kersztez se

Élesztő genetika: törzsek kersztezése

  • Hogy két törzs kereszteződjön, öszzekeverjük agar táptalajon és hagyjuk, hogy párosodjanak, pl.MATa leu2 URA3 x MATalpha LEU2 ura3

  • A diploid sejteket, mert mindkét komplementáló markerre heterozigóták lesznek, leucin és uracil mentes táptalajon szelektálhatjuk

  • A diploidok spóráztató táptalajon növesztve néhány nap múlva aszkuszokat (tetrád) képeznek

  • A spórázás nitrogén éhezés mellett indul meg, pl. KAc táptalajon

  • Az aszkusz fala specifikus enzimmel (pl. csiga gyomorból) emészthető és spórákat mikromanipulátorral elkülöníthetjük agar táptalajon

  • Csírázás után a spórák telepeket képeznek és egyenként vizsgálhatóak

  • Ez azt jelenti, hogy a meiózis utáni utódok közvetlenül vizsgálhatók (az egy sejt előnye)

  • Gyakorlott genetikus már a növekedési erély alapján meg tudja mondani, hogy a mutációk hogyan váltak szét, mert a kettős mutáns gyakran lassabban nő, mint bármelyik egyszeres

  • Egyébkent meg, a spórákból növekvő telepeket különböző táptalajokra replikázzuk, hogy meghatározhassuk tulajdonságaikat és követhessük a genetikai bélyeget


Leszt genetika t rzsek keresztez se1

Élesztő genetika: törzsek keresztezése

  • A spórák mating típusát úgy határozhatjuk meg, hogy komplementáló markerű teszt törzs pázsitjára replikázzuk, hagyjuk hogy párosodjanak, majd a diploidokat szelektív táptalajra replikázzuk: csak azok nőnek, amelyek párosodtak, tehát a teszt törzzsel ellentétes tipusúak voltak

  • Egy genetikai keresztezés jegyzőkönyve két NaCl-ra érzékeny két törzs keresztezése után a lenti táblázathoz hasonló

  • A markereket párosával összehasonlítva, sajátos mintázat alakul ki ott, ahol pl. mind a négy spóra különböző, vagy pedig két spórának ugyanaz a marker kombinációja; hogyan lehet ezt interpretálni?

TetradSporeMATleuurahisSUCNaCl

1Aa++---

1Balpha+-+--

1Ca---+-

1Dalpha-++++

2Aa-----

2Ba+++++

2Calpha+-+--

2Dalpha-+-+-


Leszt genetika mei zis

Élesztő genetika: meiózis

  • Először azt kell összegeznünk, hogy mi is történik a meiózisban: az élesztő tetrád analízis nem más, mint közvetlenül megfigyelni a meiózis eredményét

  • A diploid 2n, ennélfogva kromoszóma párjai vannak

  • A DNS replikáció mindkét kromoszómáról két azonos kromatidát eredményez

  • A kromoszómák párban vannak és közöttük történhet rekombináció

  • Majd az első meiotikus osztódás elválasztja a kromoszómákat egymástól

  • A második pedig a kromatidákat is, vagyis mindegyik spóra lényegében egy kromatidát jelent


Leszt genetika a keresztez s eredm nye

LEU2

ura3

ura3

LEU2

leu2

URA3

URA3

leu2

Élesztő genetika: a keresztezés eredménye

  • Képzeljük el, hogy aLEU2és azURA3egymáshoz közel vannak ugyanazon a kromoszómán

LEU2 ura3

LEU2 ura3

leu2 URA3

leu2 URA3

  • Abban a valószínű esetben, ha a két marker között nem következett be cross-over, minden haploid spóra úgy fog kinézni, mint a szülői haploid törzsek

  • Csak két típusú spórát kapunk, (leu+ ura-) és (leu- ura+) spórákat

  • Ezért az ilyen tetrádot szülői ditipusnak nevezzük (parental ditype)PD


Leszt genetika cross over

LEU2

ura3

ura3

LEU2

leu2

URA3

URA3

leu2

Élesztő genetika: cross over

  • Most azt képzeljük el, hogy a LEU2ésURA3egymáshoz közel vannak ugyanazon a kromoszómán és közöttük átkereszteződés, rekombináció következik be

LEU2 ura3

LEU2 URA3

leu2 ura3

leu2 URA3

  • Ebben az esetben most is kapunk szülői típusú spórákat, de olyanokat is, amelyek a két marker új kombinációit tartalmazzák

  • Négy különböző spóra típust kapunk

  • Ezért az ilyen tetrád a tetratípus (tetratype) T


Leszt genetika k t cross over

LEU2

ura3

ura3

LEU2

leu2

URA3

URA3

leu2

Élesztő genetika: két cross over

  • ALEU2és azURA3 gének most is közel és ugyanazon a kromoszómán vannak, de két cross over lesz köztük, úgy hogy mind a négy DNS szál részt vesz a folyamatban

LEU2 URA3

LEU2 URA3

leu2 ura3

leu2 ura3

  • Ebben az esetben csak olyan spórákat kapunk, amelyek különböznek a szülői haploid típusoktól

  • Két különböző típusú spórát kapunk

  • Ezért az ilyen tetrád a nem szülői ditipus(non parental ditype)NPD

  • A közeli kapcsoltság miatt az a legvalószínűbb, hogy nem lesz cross over és a legkevésbé valószínű az, hogy két cross over is lesz, ezért a tetrádok megoszlása PD > T > NPD, és relatív számokat a térképtávolság kiszámítására használhatjuk

  • Hogy a mutációk új kombinációit előállíthassuk (mint pl. leu2 ura3)annál több tetrádot kell megvizsgálnunk, minél közelebb van a két gén egymáshoz és ezt a fizikai távolság (kb-ban) alapján becsülhetjük, ami nagyon jól korrelál a genetikai távolsággal ( cM, centi Morgan). Két közeli gén esetében (1 cM ~ 1% rekombináns spóra) minimum 25 tetrádot kell statisztikailag elemezni,


Keresztez s k l nb z kromosz m kon l v markerekkel

LEU2

ura3

ura3

LEU2

leu2

URA3

URA3

leu2

Keresztezés különböző kromoszómákon lévő markerekkel

  • Most azt képzeljük el, hogy a LEU2és azURA3különböző kromoszómákon vannak

LEU2 ura3

LEU2 URA3

LEU2 ura3

LEU2 URA3

leu2 URA3

leu2 ura3

leu2 URA3

leu2 ura3

  • A különböző kromoszómák az első meiotikus osztódás során véletlen szerűen kerülnek be az utód sejtekbe

  • Ezért a két tetrád típus egyforma gyakoriságú lesz, a szülői P és nem szülői ditípus NPD

  • Tehát a kapcsolt és a nem kapcsolt gének könnyen megkülönböztethetők tetrád analízissel, mert a nem kapcsolt gének esetében a PD=NPD, míg a kapcsolt géneknél PD>>NPD


Keresztez s k l nb z kromosz m kon l v markerekkel1

LEU2

ura3

ura3

LEU2

leu2

URA3

URA3

leu2

Keresztezés különböző kromoszómákon lévő markerekkel

  • Legyen most aLEU2és azURA3különböző kromoszómán és crossing over következik be a centromer és a marker közötti részen

LEU2 ura3

LEU2 URA3

leu2 ura3

leu2 URA3

  • Most azURA3eltérő alléljei csak a második meiotikus osztódás után válnak szét

  • Az eredmény egy tetra típusú tetrád

  • A fenti helyzet azt is jelenti, hogy ha a markerek a centromertől távol vannak, akkor sok, ha pedig közel, akkor kevés T tetrád lesz

  • Mi lesz az eredménye a kettős cross overnek négy vagy három szál esetén?

  • A kettős cross over valószínűsége miatt a különböző tetrád típusok aránya nem kapcsolt gének esetében, amelyek nem kapcsoltak a centromerrel sem, a következő: 1:1:4 a PD:NPD:T-re

  • Ez azt is jelenti, hogy négy spórából egy lesz rekombináns, vagyis annak érdekében, hogy a gének (leu2 ura3) új kombinációját megkapjuk, elég egy tetrádot elemezni statisztikusan


Leszt genetika mut ns k sz t s

Élesztő genetika: mutáns készítés

  • Az olyan mutációk, amelyek erősítik, vagy megszüntetik egy bizonyos fehérje funkcióját, nagyon hasznosak a sejt rendszerek vizsgálatánál

  • A mutációk fenotípusa, a mutáns tulajdonságai, sokat elárulhatnak egy gén, egy fehérje, vagy egy útvonal funkciójáról

  • Ez a megközelítés a szekvencia ismeretében és a teljes deléciós szet birtokában is igaz: a pontmutánsoknak más tulajdonságai lehetnek, mint a deléciós mutánsoknak

  • Véletlen, vagy célzott mutációk:

    • Random mutagenezissel a gének kapcsolatát keressük bizonyos funkcióval/szereppel; új géneket, vagy ismert gének új funkcióját azonosíthatjuk

    • Véletlen mutagenezisnél az egész genom a célpont

    • Véletlen mutagenezis lehetséges egy bizonyos fehérje esetében is, a génjét in vitro mutagenizáljuk; ebben az esetben a funkcionális doméneket azonosítjuk

    • Célzott mutageneziskor kiütünk, vagy megváltoztatunk egy bizonyos gént in vitro, vagy in vivo módszerekkel

  • Indukált, vagy spontán mutációk

    • A sejteket mutagénnel kezelve mutációkat indukálhatunk; ilyenkor persze több mutáció is kialakulhat sejtenként

    • Spontán mutáció „csak úgy” is bekövetkezhet, ilyenkor nagy valószínűséggel csak egy mutáció lesz a sejtben


Leszt genetika mut ns keres s

Élesztő genetika: mutáns keresés

  • Szűrés (screening), vagy szelekció

    • Mutáns szűréskor az ember egyenként teszteli a klónokat, hogy megtalálja az érdekes mutánsokat

    • Ezért egyszerre sok sejtet széleszt és megpróbálja megtalálni azokat, amelyek replikázás után nem nőnek bizonyos táptalajokon, vagy más a színük, vagy az alakjuk

    • Screeninghez általában indukáljuk a mutációkat, hogy növeljük a gyakoriságukat

    • De: a screeninghez petri csészék százai kellenek és általában több mint 10 000 telepet kell vizsgálni

  • Egy új szelekciós rendszer kifejlesztése a genetikai analízis művészete

    • Ha szelektáljuk a mutánst, akkor olyan körülményeket teremtünk, hogy a mutáns fenotípusnak növekedési előnye legyen

    • Más szavakkal kifejezve, az a feladat, hogy olyan körülményeket állítsunk elő és/vagy olyan törzseket, hogy a mutáns tudjon szaporodni, a vad típus pedig ne

    • Az elegáns szelekciós rendszer lehetővé teszi, hogy spontán mutánsokat izoláljunk, mert 108sejtet könnyedén széleszthetünk egy lemezre

    • A szelekciós rendszerek gyakran inhibítor-rezisztencián alapulnak

YPD

YPD + 0.4M NaCl

Wild type

hog1D

sko1D

aca1D aca2D

hog1D sko1D

hog1D aca1D

aca2D

hog1D sko1D

aca1D aca2D

YPD + 0.4M NaCl

YPD

Wild type

aca2D

hog1D

hog1D aca2D


Leszt genetika mut nsok jellemz se

Élesztő genetika: mutánsok jellemzése

  • Ha már izoláltuk a mutánsokat, akkor azokat jellemezni kell és azonosítani kell az érintett géneket; a következők szerint

  • Részletes fenotípus analízis, vagyis más, nem csak a szűrés/szelekció során használt fenotípusok vizsgálata

  • Ki kell mutatni, hogy a mutáns domináns-e, vagy recesszív

  • A mutánsokat komplementációs csoportokba kell rendezni. Egy komplementációs csoport általában egy gént jelent.

  • A gén klónozása komplementációval.


Domin ns s recessz v fenot pus

MUT1

MUT1

mut1

mut1

Domináns és recesszív fenotípus

  • A domináns, vagy recesszív karakter felderíthető, ha a mutánst vad típussal keresztezzük, hogy diploid sejtet képezzenek

  • Az ilyen diploidok heterozigóták, mert az egyik kromoszómájukon a vad allél, a másikon pedig az érintett mutáns allél van

  • A mutáció domináns, ha a mutáns fenotípus nyilvánul meg a heterozigóta sejtekben. A diploid fenotípusa ugyanolyan, mint a haploid mutánsé

  • Egy mutáció recesszív, ha a vad típusú fenotípus nyilvánul meg a heterozigóta diploidban. A diploid fenotípusa olyan, mint a vad típus.

Recesszív: vad fenotípus

Domináns: mutáns fenotípus


Domin ns s recessz v mut ci

MUT1

MUT1

mut1

mut1

Domináns és recesszív mutáció

  • Domináns karakter számos ok miatt lehet, amelyek segíthetnek a géntermék szerepének felderítésében:

    • A mutáció funkció nyerést okoz (gain of function), azaz a szabályozó fehérje akkor is működik, ha nincs a szokásos stimuláció

    • A géntermék homo-oligomerként működik és a nem-funkcionális monomer az egész komplex működését elrontja

    • Az egyetlen vad típusú allél kevés a vad típusú fenotípushoz, azaz nincs elég működőképes géntermék (nagyon ritka)

  • A recesszív karaktert gyakran a géntermék funkció vesztése (loss of function) okozza.

  • Ez azt is jelenti, hogy a recesszív mutáció sokkal gyakoribb, mert könnyebb valamit elrontani, mint előállítani

  • Mutánsunk további genetikai analízise a domináns/recesszív jellegtől függ, ezért is ez az első lépés

  • Aztán még, hasznos, ha a diploid tetrád analízisét elvégezzük, hogy kiderítsük, hogy a mutáns fenotípust egyetlen mutáció okozta-e; a fenotípusok 2:2 arányban szegregálnak legalább tíz megvizsgált tetrádban; ez különösen fontos, ha indukáltuk a mutációt.

Recesszív: vad fenotípus

Domináns: mutáns fenotípus


Komplement ci s csoportok

mut1

MUT1

mut2

mut2

mut1

MUT1

mut1

mut1

MUT2

MUT2

mut1

mut1

Komplementációs csoportok

MUT1 –nek nincs

működő génterméke

  • Bizonyos fenotípusú mutánsok szelekciója/screeningje és a domináns/recesszív jelleg meghatározása után tudni szeretnénk, hogy az izolált mutánsok azonos, vagy különböző génekben érintettek-e

  • Recesszív mutációkra ezt komplementációs analízissel derítjük ki

  • Ehhez eltérő párosodási típusú mutánsok kellenek, hogy diploidokat állíthassunk elő (ezt úgy érhetjük el, hogy a mutánsokat már eleve más párosodási csoportba tarozó és komplementáló markerű törzsből készítjük)

  • A mutánsokkal aztán minden lehetséges kombinációban diploidokat képeztetünk; ami azt jelenti, hogy ha pl. 12 a-típusú és 9 alfa-típusú mutánsunk van, akkor 9x12=108 kersztezés lehetséges.

  • Ha két mutánsunknak recesszív a mutációja egy és ugyanazon génben, akkor a diploid szintén mutáns fenotípusú lesz

  • Ha a két haploid recesszív mutációja két különböző, de ugyanolyan fenotípust okozó génben van, akkor a mutánsok komplementálják egymást és a diploid vad fenotípusú lesz.

  • Ezért, ha amut1és amut2két különböző komplementációs csoportot reprezentál, nagy valószínűséggel különböző géneket jelentenek

MUT1ésMUT2-nek

működő génterméke van


Leszt genetika s molekul ris biol gia

Intragénes komplementáció

  • Az intragénes komplementáció ugyan ritka, de előfordul

  • Két mutáns allél, mint pl. a mut1-1és amut1-2, a haploid sejtekben egyértelmű mutáns fenotípust okoz és recesszívek

  • A heterozigótamut1-1/mut1-2viszont (részben) vad típusú

  • Az a magyarázat, hogy a két mutáns fehérjetermék, a Mut1-1p és a Mut1-2p olyan heteromert képeznek, amelyik egy kicsit működik

  • Ezt néhány metabolizmus enzim esetében tudták jól kimutani (ILV1, egy feedback szabályozott enzim az aminosav bioszintézisben)

  • Az intragénes komplementáció jelensége azt mutatja, hogy a géntermék oligomerként funkcionál

  • Az ”ellentéte”, a nem-alléles nem komplementáció is előfordulhat természetesen: két recesszív mutáció két különböző génben nem komplementálnak. Ez akkor fordulhat elő, ha a két géntermék ugyanabban a folyamatban, vagy komplexben vesz résztés két működő allél kevés a teljes működőképességhez

MUT1 –nek nincs

működő génterméke

mut1-1

mut1-1

mut1-2

mut1-2

De aMut1-1p és Mut1-2p heteromer

lehet működőképes


Kl noz s leszt ben

Klónozás élesztőben

  • Az élesztő molekuláris genetika 1978-ban kezdődött, amikor a S. cerevisiae–t sikeresen transzformálták idegen DNS-sel

  • Számtalan transzformációs módszer van, de a legjobb is legalább három nagyságrenddel rosszabb hatékonyságú, mint az E. colitranszformáció

  • Az élesztőben replikálódó plazmidok kópiaszáma egy és ötven között van sejtenként

  • Az élesztő többféle plazmidot is elvisel egyszerre. Ez komplikálhatja a génkönyvtárakból való klónozást. Ez ugyanakkor nagyon hasznos, ha két plazmiddal egyszerre akarjuk transzformálni az élesztőt, pl. a plazmid shuffling módszer esetében

  • A plazmid tisztítás élesztőből és a klónozás élesztőben nem hatékony

  • Ezért az E. coli-t használjuk plazmid termelésre:

  • A plazmidokat in vitro készítjük,

    E. coli-t transzformálunk,

    ellenőrizzük a konstrukciót

    a baktériumban termeltetjük a plazmidot

    és végül transzformáljuk az élesztőt

  • Ezért úgynevezett élesztő- E. coli ingázó vektorokkal (shuttle vector) dolgozunk

  • Ugyanakkor az élesztő homológ rekombináiós rendszere nagyon hatékony és megbízható, amit kihasználhatunk a klónozásnál


Leszt e coli ing z vektorok

Élesztő-E. coliingázó vektorok

  • Integrálódó plazmidok (YIp) felépítése

    • E. coli vektor alap, mint a pBR322, pUC19, pBLUESCRIPT

    • Élesztő szelekciós marker (URA3, HIS3, TRP1, LEU2)

  • Nincs élesztő replikációs origó

  • Ezért csak a genomba való beépülés után tarthatók fenn

R I (2)

Eco

I (28)

Cla

LI (5217)

d III (33)

Apa

Hin

Amp-rezisztencia

H I (379)

Bam

I (4795)

Pst

Tet-rezisztencia

YIp5

5541bp

LI (3971)

Apa

I (1644)

Pst

PMB1

I (1867)

Nco

LI (3473)

URA3

Apa

I (2541)

Ava

I (2541)

Xma

YIp5: pBR322 +URA3 gén

I (2543)

Sma


Plazmid be p l s az leszt genomba

Plazmid beépülés az élesztő genomba

  • A beépülés homológ rekombinációval történik, ez azt jelenti, hogy az olyan plazmidok, mint pl. az Ylp5 az URA3 lokuszba integrálódik

  • A bépülés eredményeként a célszekvencia megkettőződik

  • A duplikálódott DNS határolja a vektort

  • Ha a plazmidban több mint egy élesztő gén van, akkor az egyik gént enzimmel hasítva célzottan abba a génbe irányíthatjuk a plazmidot: a lineáris DNS rekombinációs hajlama igen nagy

  • Az integrálódott plazmid nagyon stabilan a helyén marad, bár a duplikálódott szekvenciáknál néha rekombinációval ki is hurkolódhat

plazmid

URA3

X

genom

ura3

X

genom

ura3

URA3


Leszt e coli ing z vektorok1

Élesztő-E. coliingázó vektorok

  • A replikatív episzómás plazmidok (YEp) felépítése

    • E. coli vektor alap(pBR322, pUC19, pBLUESCRIPT)

    • Élesztő szelekciós bélyeg(URA3, HIS3, TRP1, LEU2)

  • Az élesztő 2μ-os plazmid replikációs origó

  • Viszonylag stabilan 20-50 kópia sejtenként

  • Kópiaszámuk növelhető 200/sejt-re a részlegesen defektív LEU2 gén felhasználásával

LI (7445)

R I (2)

Apa

Eco

Amp-rezisztencia

d III (106)

Hin

I (7023)

Pst

2μ ORI

I (1391)

Ava

LI (6199)

Apa

PMB1

YEp24

I (2001)

Pst

7769bp

LI (5701)

R I (2242)

Apa

Eco

I (2268)

Cla

d III (2273)

Hin

I (2482)

Pst

I (4835)

I (2705)

Ava

Nco

URA3

I (3379)

Xma

Tet-rezisztencia

I (3379)

Ava

I (3381)

Sma

d III (3439)

Hin

H I (3785)

Bam

YEp24: pBR322 +URA3 gén, + 2μ origó


Leszt e coli ing z vektorok2

R I (2)

Eco

LI (7626)

I (28)

Apa

Cla

Amp-resistance

d III (33)

Hin

I (7204)

H I (379)

Pst

Bam

Tet-resistance

POLY

LI (6380)

I (1644)

Apa

Pst

PMB1

I (1867)

Nco

YCp50

LI (5882)

Apa

URA3

7950bp

LI (5457)

I (2541)

Apa

Xma

I (5451)

I (2541)

Pst

Ava

ARS1

I (2543)

Sma

POLY

I (4703)

Ava

CEN4

Élesztő-E. coliingázó vektorok

  • A replikatív centromerás plazmidok (YCp) felépítése

    • E. coli vektor alap(pBR322, pUC19, pBLUESCRIPT)

    • Élesztő szelekciós bélyeg(URA3, HIS3, TRP1, LEU2)

  • És még egy élesztő kromoszóma replikációs origó, ARS (autonomously replicating sequence)

  • Valamint egy élesztő kromoszóma centromeron (CEN)

  • Ezért stabilak, egy kópia sejtenként

YCp50: pBR322 +URA3 gén, + CEN4, + ARS1


Leszt e coli ing z vektorok3

Élesztő-E. coliingázó vektorok

  • YIp típusú csak integrációra

  • YCp kis kópiaszám, expresszióra

  • YEp túltermeltetésre

  • Plazmid sorozatok

  • E. coliklónozó vektor alap

  • Egy, vagy több élesztő szelekciós bélyeg

  • Alap típusok YIp, YCp ésYEp


Komplement ci s kl noz s

Komplementációs klónozás

  • Amikor már izoláltuk és komplementációs csoportokba rendeztük a mutánsokat, a génről még mindig nem sokat tudunk ( és ez gyakran még most, a teljes genom szekvencia ismeretében is így van!)

  • A génazonosításához klónozzuk egy génkönyvtárból a mutáció komplementációjával

  • A génkönyvtár egy olyan nagy plazmid populáció, ahol a plazmidokban az élesztő genom DNS-ének különböző fragmentumai vannak, amelyek összességében a teljes élesztő genomot reprezentálják

  • A génkönyvtárat úgy készítjük, hogy a teljes élesztő DNS-t pl. a gyakori hasító hellyel rendelkező Sau3A-val (GATC) csak részlegesen emésztjük; így egymással átfedő DNS fragmentumokat kapunk, ami biztosítja, hogy minden génből legyen működőképes génünk; a Sau3A fragmentumokat a kompatibilis BamHI-el (GGATCC) emésztett vektorba ligáljuk; minden élesztő könyvtárat hasonló elven készítettek

  • Ha klónozott DNS fragmentumok átlagos mérete 5-9 kbp, a genom egyszeres reprezentációja 2 000 plazmidban van és 10 000 plazmidban több mint 90%-os valószínűséggel az összes gén működőképesen található meg

  • A teljes könyvtárral transzformáljuk a mutánsunkat

  • A transzformált sejteket a vad fenotípus helyreállítására szűrjük, vagy szelektáljuk

  • A pozitív klónokból plazmidot izolálunk és ezekkel E. coli-t transzformálunk és tovább vizsgáljuk; a szekvencia igazolja a klónunkat

  • Klónunkkal újra transzformáljuk a mutáns élesztőt és ezzel igazoljuk, hogy a plazmid valóban tartalmazza a komplementáló gént; ez azért szükséges, mert az élesztő többféle plazmidot is képes felvenni


Komplement ci s kl noz s1

Komplementációs klónozás

  • A komplementációs klónozás nagyon egyszerűnek és üdvözítőnek tűnik, de azért jó néhány gond lehet vele

  • Először is, csak recesszív mutánsokkal lesz sikeres

  • Domináns mutáns gének klónozásához minden egyes mutánsunkból génkönyvtárat kell készíteni és ezekkel transzformáljuk a vad típusú törzset; a mutáns fenotípusra szűrjük/szelektáljuk a transzformánsokat

  • Továbbá, egy mutáció komplementációja nem biztos, hogy azt jelenti, hogy valóban a klónozott génünk az ami komplementálja a mutánsunk hibáját – ez lehet egy sokkópiás szupresszor is

  • Ez előfordulhat a centromerás vektorokkal is, mert a szelekciós nyomás ezeknek a plazmidoknak is föltornázhatja a kópiaszámát

  • A sokkópiás szupresszor egy olyan gén, amelyik felülkerekedik a mutáns hibáján, ha nagy mértékben megnyilvánul; ez gyakori jelenség

  • Ez valóban olyan gyakori jelenség, hogy bizonyos mutánsokkal elkezdve új géneket klónozhatunk (még erre visszatérünk)

  • Azt kimutatni, hogy a klónozott génünk az egyetlen, amelyik hibás a mutánsunkban, úgy lehet, hogy a klónozott génünket templátként használva, homológ rekombinációval deléciós mutánsokat készítünk

  • Ha az eredeti és a deléciós mutáns is ugyanazt a fenotípus mutatja, akkor ez jó bizonyíték arra, hogy a két gén azonos

  • Végső bizonyítékot a két mutáns keresztezéséből kaphatunk; ha a diploid is mutáns fenotípusú és a diploidból izolált valamennyi spóra is, ez már bizonyítja a két gén azonosságát

  • A gének deléciója homológ rekombinációval az egyik leghatékonyabb technika az élesztő esetében és ez is az egyik ok, amiért az élesztő ilyen népszerű


Komplement ci s kl noz s2

mut1D

MUT1

mut2

mut2

mut1D

MUT1

mut1

MUT2

MUT2

mut1

Komplementációs klónozás

  • Ha az eredeti mutáns és a deléciós mutánsnak ugyanaz a fenotípusa, akkor ez jó bizonyíték arra, hogy a két gén azonos

  • A végső bizonyítékot a két mutáns keresztezése szolgáltatja; ha a diploid mutáns fenotípusú (vagyis nincs komplementáció az eredeti és a deléciós mutáns között) biztosak lehetünk abban, hogy a klónozott génünk az amelyik eredetileg elromlott

  • A 100%-os bizonyosság kedvéért spóráztatjuk a diploidot és néhányszor tíz tetrádot megvizsgálunk: minden spóra mutáns fenotípusú kell legyen

  • A gének deléciója homológ rekombinációval az egyik leghatékonyabb technika az élesztő esetében és ez is az egyik ok, amiért az élesztő ilyen népszerű

MUT1 génnek nincs

funkcionális génterméke

MUT1és MUT2gének

funkcionális géntermék

mut1D

mut1D


Egy leszt g n del ci ja

YFG1

Kedvenc génje egy plazmidban

Kedvenc génje a plazmidban,

az ORF a mrker génre cserélve

URA3

URA3

X

X

Rekombináció az élesztőben

Egy élesztő gén deléciója

  • A klónozott gén felhasználásával a nyitott leolvasási keretetből in vitro kivágunk egy darabot és kicseréljük egy marker génre

  • A marker génünket így az eredeti génünkből származó szekvenciák határolják

  • Ezzel a DNS-sel transzformáljuk az élesztőt, ahol homológ rekombinációval a kromoszómán lévő gén erre cserélődik ki; a transzformánsokat a marker génre szelektáljuk

  • Ezt követően Southern blot-tal (DNS-DNS hibridizálással), vagy PCR-rel és az élesztő törzs fenotípusának vizsgálatával igazoljuk a deléciót

  • A módszer igen megbízható és 1µg DNS-sel biztosan kapunk néhány transzformánst. Ugyanez növény-, vagy állat-sejtekkel eltarthat néhány évig.

in vitro

Kedvenc génje

eltávolítva a genomból

in vivo

URA3


Egy leszt g n del ci ja1

Egy élesztő gén deléciója

  • Több lehetőségünk is van a transzformáló DNS elkészítésére, mármint hogy a markert a YFG1génből származó szekvenciák fogják közre

    • Elkészíthető restrikciós endonukleázokkal (RE) és ligálással

    • Ekészíthető: PCR/restrikció/ligálás; az egész plazmid amplifikálható PCR-rel az ORF kivételével; a PCR primerekkel generálhatjuk a marker gén klónozására alkalmas RE hasító helyet

    • Elkészíthető csak PCR-rel, minden klónozási lépés nélkül; két külön PCR reakcióban amplifikáljuk a YFG1 határoló szakaszait és a második körben ezeket használjuk primerként a marker gén sokszorozáshoz, a primereket természetesen ennek megfelelően kell megtervezni (lásd lent)

    • Elkészíthető hosszú PCR primerekkel, melyekkel csak a markert amplifikáljuk, a rekombináció pedig a primer szekvenciáknál következik be; 30 bp már elegendő a rekombinációhoz; ilyen esetekben heterológ marker ajánlott, hogy a beépülés a megfelelő helyre történjen

    • A két utóbbi módszerhez nem szükséges a klónozott gén!! Egy gén deléciója így csak néhány nap.

Először PCR-rel amplifikáljuk a

kedvenc génünk határoló szakaszait

YFG1

Majd a markert amplifikáljuk

URA3

URA3

A kész PCR termék kész

a transzformációra


Okos g n del ci

lacZ

URA3

YFG1

Diploid sejt

Okos gén deléció

  • Az alkalmazott marker kazettától függően, nagyon okosan készíthetjük el a deléciós/megszakításos (gene disruption) mutánsunkat, a későbbi alkalmazásokhoz

  • Például, ha a marker kazettánk tartalmazza a lacZ riporter gént, akkor pontos fúziót tudunk előidézni azért, hogy a riporter gént a YFG1 promótere szabályozza

  • Ha ilyen konstrukcióval készítünk deléciót egy diploidban, akkor vizsgálhatjuk a gén megnyilvánulását a diploidban a β-galaktozidáz enzim aktivitásának mérésével és spóráztatás után a mutáns fenotípust a haploid utódokban.

  • Hasonló módon meg is jelölhetünk egy gént (gene tagging). Ha például a kazettát frame-ben építjük be az ORF valamelyik végéhez, akkor fúziós fehérjéket kapunk, LacZ, GFP, vagy immuno-tag jelöléssel a fehérjénk kimutatásához, vagy tisztításához


Okos g n del ci1

Hasonló módon meg is jelölhetünk egy gént (gene tagging). Ha például a kazettát frame-ben építjük be az ORF valamelyik végéhez, akkor fúziós fehérjéket kapunk, LaZ, GFP, vagy immuno-tag jelöléssel a fehérjénk kimutatásához, vagy tisztításához

Már elkészítették azokat az élesztő törzseket, amelyekben a géneket GFP, vagy TAP-tag-el jelölték

YFG1

GFP

URA3

Okos gén deléció


Leszt genetika s molekul ris biol gia

Okos gén deléció

  • Van néhány lehetőség arra, hogy úgy készítsünk deléciós törzseket, hogy ne maradjon utána nyom, azaz marker gén nélkül

  • Ez akkor nagyon fontos, ha a markert újra használni akarjuk, azért, hogy sok deléciót készíthessünk egy és ugyanazon törzsben ( vannak olyan törzsek, amelyekben több mint húsz deléció van)

  • Különösen fontos ez az ipari törzsekben; amikor is számít, hogy fölösleges idegen DNS ne maradjon vissza a folyamat végén

  • Az összes ilyen módszer is a homológ rekombinációt használja ki másodjára, hogy az integrálódott DNS kihurkolódjon

  • Erre jók példáula loxP-kanR-loxP kazetták; a két loxP kazetta közötti rekombinációt a Cre-rekombináz (külön plazmidon transzformálva) stimulálja; rekombináció után egyetlen loxP hely marad vissza (cre-lox a P1fágból)


Okos g n del ci2

Okos gén deléció

  • Nagyon hasznos az URA3 markerrel dolgozni, mert ennek jelenlétében lehet erre is, meg ellene is szelektálni

  • URA3–ra természetesen uracil mentes táptalajon szelektálunk

  • AzURA3ellen az 5-fluoro-orotic acid (5-FOA) droggal szelektálhatunk, ami az URA3 sejtekre toxikus

  • Egy példa:

URA3

plazmid

YFG1

genom

YFG1

URA3

Csak az YFG1 határoló szekvenciáit tartalmazó plazmid beépüéseduplikációt okoz;

a kék szekvenciák közötti rekombináióval a teljes plazmid és még az YFG1 gént kódoló régió is kihurkolódik


Hogyan dolgozzunk esszenci lis g nekkel

Hogyan dolgozzunk esszenciális génekkel?

  • Tárgyaltuk a kémiai és a célzott mutagenezist; kézenfekvő kérdés, hogy hogyan is izoláljunk és dolgozzunk olyan mutánsokkal, amelyekben a mutáció a sejt számára nélkülözhetetlen termékeket kódoló génekben van (és ilyen kb. a gének 1/3-a)? Az a mutáció ugyanis, amelyik tönkreteszi a géntermék fehérjét, megöli a sejtet és döglött sejttel nehéz dolgozni.

  • Kémiai mutagenezisnél kondicionális mutánsokat keresünk; általában hőérzékeny (ts) mutánsokat, ahol a géntermék alacsony hőmérsékleten működőképes, magas hőmérsékleten pedig nem; nagyos sok esszenciális sejtfunkciót ts mutánsokkal azonosítottak

  • Deléciós kísérletekben úgy döntjük el azt, hogy egy gén nélkülözhetetlen, hogy a deléciót diploid törzsben készítjük; és ha spóráztatás után csak két spóra lesz életképes és egyetlen élő spóra sem hordozza a markert, akkor elismerhetjük, hogy a gén esszenciális

  • Dolgozhatunk nélkülözhetetlen gének mutánsaival is. Elsősorban akkor, ha a mutánst olyan plazmiddal transzformáljuk, amelyik a kérdéses gént kondicionálisan expresszálja

  • Például, ha a plazmidban az esszenciális gént a GAL1 gén promótere működteti; ez a promóter bekapcsolható galaktózzal, glükózzal pedig kikapcsolható; ha glükózra váltunk, akkor legalábbis egy kis ideig vizsgálhatjuk a sejtek tulajdonságait …. és vizsgálhatjuk pusztulás közben (yfg1D pGAL1-YFG1)

  • Az in vitro készített pontmutánsok működését vizsgálandó, használhatjuk a plazmid shuffling technikát. Ilyenkor a mutánst először a vad típusú gént tartalmazó plazmiddal transzformáljuk, majd a mutáns génnel. A vad gént hordozó plazmidon kell legyen az URA3 mint szelektálható marker, amit aztán 5-FOA tartalmú táptalajra szélesztve a transzformánsokat arra kényszerítjük, hogy tűnjön el a sejtből. Ha a mutáns nő 5-FOA jelenlétében, akkor a mutáns allél működőképes (yfg1D pURA3::YFG1 pLEU2::yfg1-1).


A g n megszak t st l a transzpozon mutagenezisig

A gén-megszakítástól a transzpozon mutagenezisig

  • A gén deléció/megszakítás technikák egy lépéssel messzebbre vezetnek a véletlen kémiai mutagenezisnél

  • Ezért, mint már korábban tárgyaltuk, génkönyvtárat készítünk úgy, hogy a beépített élesztő DNS-t csak az élesztő genomot nagyon ritkán hasító NotI enzimmel vághassuk ki

  • Majd ezt a génkönyvtárat E. coli-ban transzpozonnal mutagenizáljuk, ahol is a Tn véletlenszerűen épül be az élesztő DNS-ekbe

  • Ezt követően a teljes NotI fragmentum keverékkel transzformáljuk az élesztőt és azt várjuk, hogy ott kicseréli a géneket; kb. 30 000 élesztő klón a genom több mint 90 %-át lefedi

  • Az ábrán lévő transzpozon egy igen jó konstrukció, mert a lox helyeknél részlegesen ki lehet vágni. A kivágódás után egy tag képződik, ami a géntermék lokalizációját teszi lehetővé.

  • TR: Tn3 terminális inverted repeat-ek

  • Xa: Xa faktor hasítás felismerő helye

  • loxR: lox hely, a Cre rekombináz célhelye

  • lacZ: 5'Δ lacZ gén b- galaktozidázt kódol

  • URA3 génS. cerevisiae-ből

  • tet: tetraciklin rezisztencia gén

  • res: Tn3 resolúciós helye a transzpozon intermedier megoldódásához

  • loxP: lox hely, a Cre rekombináz célhelye

  • 3xHA: Hemagglutinin (HA) tripla epitope tag


A g n megszak t st l a transzpozon mutagenezisig1

A gén-megszakítástól a transzpozon mutagenezisig

  • A Tn mutagenezis azért igen hasznos és kedvelt, mert a Tn-inzerciós gén nagyon könnyen azonosítható,

  • mert DNS-t tisztítunk a mutánsból és olyan enzimmel emésztjük, amelyik nem vág a transzpozonba

  • A képződött sok DNS fragmentumból csak kromoszómánként egy fogja tartalmazni a transzpozont, amit élesztő DNS fog közre

  • Ligálással gyűrűs plazmid DNS-t készítünk, E. coli-t transzformálunk és a plazmidot tovább vizsgáljuk

  • A transzpozonból az élesztő DNS felé mutató primerrel szekvenálunk és a genom szekvenciával összehasonlítva megtudhatjuk melyik génről van szó

  • Ez a módszer olyan jól működik, hogy összehasonlító géntérképezésre is felhasználták

  • Például, mostanában screeneltek 25000 Tn-mutánst több tulajdonságra és sok eddig még nem jellemzett stressz toleranciával kapcsolatos géntlokalizáltak

  • A transzpozon antibiotikum rezisztens származékai hasznos eszközei az ipari törzsek mutációjának és vizsgálatának


Kl noz s lyuk foltoz ssal gap repair

Klónozás lyuk foltozással(gap repair)

  • Az élesztő hatékony rekombinációs rendszerét több módon is felhasználhatjuk, hogy lyukas plazmid foltozással klónozzunk géneket

  • Az az alapja, hogy a lyukas, lineáris plazmid nem replikálodik az élesztő sejtekben, hacsak nem javítódik ki gyűrűs plazmiddá

  • A lyukat a kotranszformált (részben) homológ DNS foltozza be rekombinációval; ezt felhasználhatjuk mutációk generálására, pl. error-prone PCR-rel. Megemlítendő, hogy egyébként a résztvevő DNS daraboknak nem kell magából az élesztőből származni! Ez igen hatékonyan működik.

  • A genomi DNS-sel való rekombinációval és gén konverzióval is bekövetkezhet a javítás; ezt a genomi mutáns allél klónozására használhatjuk

Javító fragmentum

„lyukas” plazmid

YFG1

YFG1

„lyukas” plazmid

genomi kópia foltozza be a „lyukat”;a templát duplikálódik


Feh rj k lokaliz l sa a sejtben gfp

Fehérjék lokalizálása a sejtben: GFP

  • A zölden fluoreszkáló fehérjét (GFP) használják a fehérjék szisztematikus lokalizálására az élesztő sejtben

  • A GFP technológia nagy előnye, hogy élő sejtekben figyelhetjük meg a folyamatokat!

  • Általában a GFP-t kódoló szekvenciát a vizsgálandó gén kódoló régiójának valamelyik végéhez fúzionáltatjuk (transzlációs fúzió)

  • Ezt plazmidban és a genomban is elkészíthetjük

  • A konstrukció működőképességét a megfelelő deléciós mutáns komplementációjával vizsgáljuk

  • A GFP zölden világít a fluoreszcencia mikroszkópban és szubcelluláris helyzetét a különböző kompartmentek kontroll festése alapján állapíthatjuk meg.

  • Ma már többféle GFP variáns is van, eltérő kimutathatósági küszöb értékekkel és különböző színű fényemisszióval: CFB, BFP, RFP, YFP…

  • Ezzel lehetővé vált több fehérje szimultán megfigyelése a sejtben és még a fehérje-fehérje kölcsönhatások is vizsgálhatók


L pj nk tov bb m g g n izol l s

Lépjünk tovább: még gén izolálás

  • Eddig már beszéltünk arról, hogy hogyan készítünk különböző módon mutációt élesztőben:

    • random kémiai mutagenezis

    • random célzott mutagenezistranszpozonnal jelölt DNS-sel

    • élesztő gének célzott deléciója/inzerciója

  • és megismerkedtünk az élesztő gének vizsgálatának és konstruálásának néhány módszerével

    • fúzió riporter génnel a gén expresszió vizsgálatához

    • fúzió epitóppal, vagy GFP-vel a fehérje koncentráció, vagy a sejten belüli lokalizáció vizsgálatára

  • A genetikai analízis ereje abban a lehetőségben is megmutatkozik, hogy egy gént/mutánst felhasználhatunk további gének izolálására, amelyek ugyanabban, vagy párhuzamos, vagy azzal kapcsolatban lévő folyamatokban résztvevő fehérjéket kódolnak

  • Ugyanezek a genetikai megközelítések használhatók arra, hogy meghatározzuk különböző gének/fehérjék részvételét ugyanabban (vagy másik) sejtfolyamatban és hogy sorba rendezzük azokat, például egy jelátviteli útban

  • Ilyen továbblépési lehetőség a

    • Sokkópiás szupresszió

    • Szupresszor mutáció

    • Mesterséges letalitás (synthetic lethality)

    • Az élesztő kéthibrid rendszer

  • Ezeket a rendszereket többféle variációban lehet használni; az igazi szellemi teljesítmény az, hogy megtaláljuk azokat a körülményeket, amelyek lehetővé teszik a módszerek célravezető alkalmazását


Sz up resszorok

Szupresszorok

  • Definíció: egy mutáns reverziója azt jelenti, hogy az eredeti lézió (hiba) kijavítódik és ezért az eredeti, a vad típusú helyzet áll vissza; egy deléciós mutáns természetesen sohasem revertál

  • Definíció: a szupresszor egy gén, vagy mutáció, ami (részlegesen) felülkerekedik egy adottmutáció okozta hatáson; ezért a szupresszor egy másik helyen bekövetkező genetikai változás, ami valahogyan (részlegesen) helyreállítja a vad típusú helyzetet

  • A szupresszorok lehetnek intragénesek (génen belüliek), vagyis egy második mutáció ugyanabban a génben/fehérjében helyre tudja állítani (részlegesen) a géntermék működőképességét; ismételten, ez csak pontmutációk esetében igaz, deléciós mutánsokra nem

  • Sokkal gyakoribbak az extragénes (génen kívüli, gének közötti) szupresszorok és szó lesz a sokkópiás szupresszorokról és a szupresszor mutációkról

  • Hogy a szupresszor hogyan működik, az természetesen nagymértékben függ a vizsgálati rendszertől; a szupresszor működés vizsgálata rengeteg fontos információt szolgáltat

  • Elsősorban, a szupresszor, vagy aktiválja (vagy represszálja) az első mutáció által érintett rendszert valamilyen más módon, vagy pedig aktivál (vagy represszál) egy alternatív, részben redundáns rendszert

  • A szupresszorok nagyon hasznosak, de ugyanakkor bosszantóak is lehetnek: a gyengén növekvő élesztő mutánsok könnyen generálnak szupresszorokat, ezért az embernek óvatosnak kell lennie, ha ilyen mutánsokkal dolgozik


Sokk pi s szupresszi multi copy suppression

Sokkópiás szupresszió(multi-copy suppression)

  • A sokkópiás szupressziót egy gén túlműködése okozza, általában sokkópiás plazmidról, vagy egy „szokatlanul” erős promóterről (mutáció, áthelyeződés)

  • A sokkópiás (vagy géndózis) szupresszor egy gén, ami ha nagymértékben nyilvánul meg, akkor felülkerekedhet (részben) egy bizonyos mutáció okozta hatáson

  • A sokkópiás szupresszió, mint a génfelfedezés eszköze nagyon izgalmas eszköz: sohasem tudhatjuk, hogy mit találunk…

  • De általában azt várhatjuk, hogy olyan gén lesz, amelyiknek génterméke egy későbbi funkció ugyanabban az útvonalban, vagy pedig egy párhuzamos útvonalban

  • Az a szép benne, hogy azonnal megkapjuk a gént!

  • Az érvelést körüljárva: ha más genetikai kísérletekből tudjuk már, hogy két gén funkcionálisan kapcsolatban van, akkor a két fehérjét sorrendbe állíthatjuk episztázis analízissel: csak olyan gén terméke képes egy mutáció sokkópiás szupressziójára, amelyiknek terméke az útvonalban később működik

X

X

Két párhuzamos útvonalnak van egy, vagy több közös targetje.A párhuzamos útvonal expressziójának megnövekedése, ennek következtében a nagyobb aktivitás elegendő lehet a target aktíválásához.

Pbs2p és Hog1p ugyanabban az útvonalban vannak és Hog1p-t Pbs2p aktíválja. Túltermelt Hog1p-nek lehet elegendő aktivitása a szükséges funkcióhoz Pbs2p nélkül is

közös target


Szupresszor mut ci k

X

X

X

Sko1

Szupresszor mutációk

  • Egy extragénes szupresszor mutáció úgy változtat meg egy másik gént, hogy egy bizonyos mutáció hatásait, vagy egyik hatását megszünteti, felülkerekedik rajta

  • A sokkópiás szupresszióhoz hasonlóan számtalan lehetőség van arra, hogy bekövetkezzen és a végeredmény gyakran meglepő, de igen informatív

  • Tipikus szupresszor mutációk azok, amelyek egy, a primer lézió utáni gén termékét aktiválják ugyanabban az útvonalban; ezek általában funkció nyeréses mutációk és rendszerint dominánsak

  • Más tipikus mutációk esetében a mutáció kiüt egy downstream represszort ugyanabban, vagy pedig egy párhuzamos útvonalban: ezek a mutációk funkció vesztéses mutációk, recesszívek

  • A szupresszor mutáció aktiválhat, vagy inaktiválhat olyan útvonalakat/rendszereket amelyek valamilyen módon ugyanazt a fizológiai rendszer befolyásolják, mint a primer lézió

  • Ha az adott fehérje egy multimer komplex része és a primer mutáció egy pontmutáció, akkor a következő, az extragénes szupresszor mutáció eredménye az is lehet, hogy a fehérje kölcsönhatások ismét lehetségessé válnak, ezért ezzel a módszerrel kölcsönható fehérjéket is azonosíthatunk

Az útvonal végül inaktivál egy negatív szabályozót, pl. a Sko1prepresszort; a represszor kiütése miatt az útvonal aktív lesz; a mutáció nagy valószínűséggel recesszív

Pbs2p és Hog1p ugyanabban az útvonalban vannak és Hog1p-t Pbs2p aktíválja.

A mutáció miatt Hog1p aktív lesz aktiválás nélkül is és szupresszálja a pbs2primer mutációt; és valószinüleg domináns


Mesters ges szintetikus letalit s synthetic lethality

X

X

X

Közös célpont

Közös célpont

Mesterséges/szintetikus letalitás(synthetic lethality)

  • A mesterséges letalitás hatékony eszköz olyan gének azonosításához, amelyeknek termékei (egy útvonalban) párhuzamosan működnek azzal a génnel, amit a primer mutáció érintett. A két mutáns külön-külön életképes, de a kettős mutáns nem!!

  • A lényeg: a primer mutánst egy, a megfelelő gént tartalmazó plazmiddal transzformáljuk; a gént vagy a GAL1 promóter hajtja meg (galaktózon BE, glükózon KI), vagy pedig egy az 5-FOA-val ellenszelektálható URA3 markert is tartalmazza

  • Olyan mutációkra screenelünk aztán, amelyek lehetővé teszik azt, hogy az élesztő csak a plazmid jelenlétében tudjon szaporodni (azaz nem nő 5-FOA-án), vagy pedig csak akkor, ha a gén megnyilvánul (azaz nem glükózon)

  • Ez az alapelv olyan jó, hogy a mesterséges letalitás screeninget most már a teljes genommal csinálják, amihez a deléciós mutáns kollekciót használják: ez 4200 x 4200 keresztezést jelent, a spóráztatást és a tetrád analízist pedig robotok végzik

A két útvonal néhány közös célpontot szabályoz; a PBS2 muációja magában csak gyenge fenotípust eredményez. A párhuzamos útvonalban bekövetkező második mutációval már letális.


Leszt genetika s molekul ris biol gia

Episztázis I

(epistasis analysis)

X

X

Közös target

  • A szupresszor analízis és a mesterséges letalitás tárgyalása közben megismert fogalmak az alapjai a genetika egyik másik hatékony eszközének, az episztázis analízisnek

  • Bizonyos mértékben hasonlít a komplementációs analízishez (A mutáns kollekciónkban hány különböző gén okozza ugyanazt a fenotípust ?), az episztázis analízis azt kérdezi, hogy hány gén/fehérje van ugyanabban a genetikai rendszerben/útvonalban és milyen sorrendben működnek?

  • Az alapelképzelés az, hogy két mutációt kombinálunk ugyanabban a sejtben, azaz kettős mutánsokat készítünk; a kettős mutáns fenotípusa megmutathatja azt, hogy a két géntermék ugyanabban, vagy párhuzamos útvonalban dolgozik-e és megmutathatja az útvonalon belüli sorrendjüket..

  • Elsőként feltételezzük azt, hogy mind a négy fehérjének a mutánsai hasonló fenotípust, pl. mérsékelt só érzékenységet okoznak

  • Ha a hog1 és a pbs2 mutációkat kombináljuk egy hog1 pbs2 mutánsban, azt várhatjuk, hogy a kettős mutánsunk érzékenysége ugyanolyan mértékű lesz, mint bármelyik egyszeres mutánsé; arra következtethetünk, hogy ugyanabban az útvonalban működnek

  • Ha viszont a pbs2 és a cba1 mutációkat kombináljuk a pbs2 cba1 kettős mutánsban, a kettős mutánstól sokkal nagyobb érzékenységet várhatunk az egyszeres mutánsokhoz képest; arra következtethetünk, hogy a Pbs2p és a Cba1p másik, de párhuzamos útvonalak munkásai


Episzt zis ii

X

X

Sko1

Episztázis II

  • Feltételezzük most azt, hogy a PBS2 (és a HOG1) deléciója következtében az élesztő a nagy só koncentrációra érzékeny lesz, míg a SKO1 deléciója sóval szembeni nagyobb toleranciát okoz

  • Ha ezek a fehérjék ugyanabban az útvonalban szerepelnek, akkor a kettős mutánsok fenotípusaira különböző lehetőségek lesznek a pbs2 sko1 vagy a hog1 sko1 esetekben

  • Ha Sko1p követi Pbs2p-tés Hog1p-t, azt várhatjuk, hogy a kettős mutáns toleráns lesz, azaz fenotípusa ugyanolyan lesz, mint a sko1 egyszeres mutánsé: a sko1episztatikus („dominál fölötte”) pbs2-re és hog1-re (és ez is a helyzet)

  • Ha Sko1p megelőzi Hog1p-tés Pbs2p-t,azt várhatjuk, hogy apbs2 sko1és ahog1 sko1kettős mutánsok sóra érzékenyek lesznek


Episzt zis iii

X

X

Episztázis III

  • A sokkópiás szupresszió és az aktivációt okozó mutációk is az episztázis analízis hasznos eszközei

  • A fokozott expresszió okozta szupresszió csak olyan gén/fehérje esetében tapasztalható, amelyik a primer lézió után következik a folyamatban, mint az itt a Hog1p esetében látható; a PBS2 expresszió megnövelése nem szupresszálhatja a hog1Δmutációt

  • Hasonlóképpen, egy a HOG1-et aktiváló mutáció képes szupresszálni a pbs2Δmutánst, de a fordított eset nem lehetséges

  • Az episztázis koncepciót nagyon sok jelátviteli útvonal (signal transduction pathway) és celluláris rendszer analízisénél alkalmazták: ha a kettős mutáns fenotípusa hasonlít az egyik egyszeres mutánséhoz, akkor ennek génterméke a folyamat egy későbbi lépését katalizálja, azaz közelebb van a fiziológai hatáshoz


K thibrid rendszer two hybrid system

riporter gén

lexA

hely

Kéthibrid rendszer(two-hybrid system)

  • Az élesztő kéthibrid rendszer két fehérje kölcsönhatásának vizsgálatára alkalmas módszer az élesztő sejtben és alkalmas arra is, hogy egy már ismert fehérjéhez keressük meg az együttműködő partnert

  • Az eredeti változat a transzkripciós átírást használta, manapság már vannak más módszerek is.

  • A módszer olyan hatékony, hogy nem korlátozódik csak az élesztő fehérjékre; az együttműködő partnerek bármilyen organizmusból származhatnak; néhány verzióban nincs is élesztő szekvencia

  • A rendszer elvi alapja a transzkripciós aktivátorok modul rendszerű felépítése, amelyek kicserélhető DNS-kötő és transzkripciós aktivátor doménekből épülnek fel

  • Az érdekelt gént, a csalit (bait), egy DNS kötő doménhez fúzionáltatva klónozzuk, mint pl. amilyen az E. coli lexA fehérje

  • A potenciális kötődő partnert, a célt, vagy a prédát (prey), ami lehet könyvtár is, egy transzkripciós aktivátor doménhez fúzionáltatva klónozzuk, mint amilyen a VP16-é, ez egy vírus fehérje

  • A riporter gén, aminek egyetlen promótere a lexA kötőhely, csak akkor aktiválódik, ha a csali és a préda kapcsolódnak, kölcsönhatásba lépnek


Az leszt k thibrid rendszer alkalmaz sa

Az élesztő kéthibrid rendszer alkalmazása

  • Az élesztő kéthibrid rendszer alkalmazási lehetőségei hihetelenül széleskörűek

  • Két fehérje közötti kölcsönhatást tudunk vele kimutatni

  • A két fehérje kölcsönhatásában résztvevő domének és csoportok jellemzésére is alkalmas; ezt mutagenezissel és egy ellenszelektálható riporter gén, mint pl. az URA3 gén, felhasználásával lehet kivitelezni

  • A kölcsönható partnerek megkeresésére is alkalmas a rendszer

  • Két fehérje együttműködését szabályozó fehérjék izolálására

  • Két fehérje együttműködését gátló drog screenelésre

  • 6000 csali törzset kereszteznek 6000 préda törzzsel és genomi méretben térképezik az élesztőben együttműködő fehérjéket

  • stb................


Genetikai anal zis a hog tvonal

Genetikai analízis: A HOG útvonal

  • Az ozmózist érzékelő HOG útvonal jó példa arra, hogyan is működik a genetika eszköztára

  • A PBS2–őt és aHOG1–et egy só érzékenység screen- nel azonosították első lépésként

  • SLN1deléciója letális, ez a szenzor-hisztidin kináz az útvonal negatív szabályozója és a túl-aktiválása ártalmas

  • A downstream kinázokat recesszív szupresszor mutációkként azonosították

  • A fehérje foszfatázokat mint sokkópiás szupresszorokat találták meg

  • A cél géneket úgy tudták azonosítani, hogy deléciójuk különböző mértékben lehetővé tették a sin1 mutáns túlélését (vagy a gyakran használt ssk2ΔN mutánsét, amelyiknek hasonló hatása van)

  • Az SHO1 elágazás elemeit mint mesterséges letális ozmózis-érzékeny mutánsokként azonosították, egy ssk2 ssk22-vel kombinálva, amelyik nem érzékeny az ozmózisra

  • Az Rck2p és a Hog1p, valamint a Hog1p és a Hot1p fehérjék közötti kölcsönhatást kéthibrid screennel találták meg


A modell organizmusok

S. cerevisiae

S. pombe

Human

A modell organizmusok

  • ASaccharomyces cerevisiaeésSchizosaccharomyces pombeélesztők elismert modell organizmusai a molekuláris biológiának,

  • azért, mert azt remélhetjük, hogy bizonyos – de lehet, hogy a legtöbb – sejt rendszer az élesztőkben és az emberben hasonlóképpen működik, vagyis általában az eukariótákban

  • Ez természetesen csak bizonyos mértékig igaz, de sok alapvető molekuláris mechanizmus valóban konzerválódott; bizonyos elemek más összefüggésben a speciális körülmények közötti evolúciót mutatják meg

  • Az élesztők azért nem egyszerű humán sejtek

  • Egy másik korlát az, hogy az élesztők egysejtűek, ezért nincs meg bennük a komplexitás magasabb szintje, azaz a soksejtű organizmusoké

  • De jegyezzük meg, hogy vannak különböző típusú élesztő sejtek, amelyekben eltérő fehérje készlet nyilvánul meg és ezek a sejtek differenciálódását fémjelzik

  • Bár a S. cerevisiaeés a S. pombemindkettő élesztő, különböznek egymástól, mint ahogy különböznek az embertől is


Modell szerep eukari ta sejtciklus

Modell szerep: eukarióta sejtciklus

  • A legjobb példa, ahol az élesztő genetikai analízisével pillanthattunk be alapvető folyamatokba, az a sejtciklus szabályozása

  • Az eukarióta sejtciklusban négy különböző fázist különböztethetünk meg: G1, S, G2 és M

  • Továbbá, a sejtciklus folyamatában vannak döntő ellenőrzési pontok, ahol bizonyos események befejeződését ellenőrzi, mielőtt a következőt elkezdené

  • Ezen ellenőrzési pontok relatív fontossága faj-specifikus, a S. cerevisiae esetében a START ez a kritikus pont

  • A tápanyag hiány és a feromon okozza azt, hogy a sejtciklus ennél a pontnál lefékeződik

  • A sarjadzó élesztő kulcs tulajdonsága, hogy a sejtciklusnak ezt az állomását a sarj mérete, a sejt morfológiája mutatja

  • Ezt használták ki sok cdc gén sorrendjének meghatározására, aszerint, hogy a sejtciklus melyik lépését befolyásolják:: ezek a vizsgálatok alapozták meg a sejtciklus szabályozás genetikai analízisét

Az aktin citoszkeleton

a sejtciklusban


Jel tvitel signal transduction

Jelátvitel(signal transduction)

  • Az eukarióta sejtek közötti alapvető jelátviteli mechanizmusok jól konzerválódottak

  • Például, úgy tűnik, hogy az állatokban és a gombákban a cAMPmint másodlagos jel közvetíti a tápanyag szignálokat

  • Továbbá, minden eukarióta sejtben vannak közös jelző fehérje osztályok (signalling protein classes), mint a hormon receptorok egy típusa a G-fehérjével kapcsolt receptorok (G-protein coupled receptors); az élesztő feromon receptorai tartoznak ebbe az osztályba

  • Egy eukarióta jelző rendszer prototípus a MAP (mitogen activated protein) kináz kaszkád; rendszerint három protein kinázból álló modulok, és ezek általában a gén expressziót szabályozzák; a modult sok, különböző stimulust érzékelő jelző útvonal tartalmazza és ezért különböző érzékelő mechanizmus szabályozza

  • AS. cerevisiae–ben legalább hat ilyen útvonal van, amelyek együttesen szabályozzák a sejtmorfológiát, valamint a feromonra és a környezeti stresszre adott válaszokat

  • Az élesztő genetikai analízise nagyban hozzájárult és járul ahhoz, hogy megértsük, hogyan is működnek ezek a folyamatok

  • Természetesen vannak korlátai is a S. cerevisiaemodellnek, mert pl. fontos emlős receptor osztályok, mint pl. a tirozin kinázok, vagy a sejtmag receptorok, nincsenek az élesztőben


Szign l transzdukci

Szignál transzdukció


Alakv lt s morpholog y cal switch

Alakváltás(morpholog(y)/(cal) switch)

  • Már említettük, hogy az élesztő sejtek meg tudják változtatni az alakjukat

  • A váltáshoz tápanyag szignálok és egy MAP kináz útvonal kell; a cAMP-nek is van benne része

  • Az élesztő pszeudohifa váltás (vagy a haploidok invazív növekedése) a morfogenezis egy modell rendszere

  • A legfontosabb ebben az, hogy az alakváltás, összefüggésben van a patogenezissel (Candida albicans) és ezért alapmechanizmusait sokat vizsgálják

  • AS. cerevisiaeaz alakváltást és a poliszacharid bontó enzimek ko-expresszióját használja arra, hogy behatolhasson a növény szöveteibe


A g nexpresszi szab lyoz sa

A génexpresszió szabályozása

  • Az eukarióta transzkripció szabályozás alapjai jól konzerváltak és sok fehérje működik más fajokban is, mint pl. a már említett transzkripciós faktorok

  • A transzkripciót iniciáló gépezet felépítése is konzervált; sok, bár nem minden alegységnek van megfelelője az élesztőben és az emberben

  • A transzkripció aktiválás is konzervált, de néhány aktivátor osztály (prolinban- és glutaminban-gazdag) nem működik élesztőben

  • Bár az élesztő kromatin szerveződése sokkal egyszerűbb, néhány vonatkozásban hasonlóan vesz részt a génexpresszió szabályozásában

  • A génexpresszió szabályozása azt jelenti, hogy a szignáloknak és a molekuláknak keresztezniük kell a sejtmag membránt és ezek a mechanizmusok úgy tűnik, hogy jól konzerváltak


Vezikul ris transzport vesicular transport

Vezikuláris transzport(vesicular transport)

  • A vezikuláris transzport, vagyis az a mechanizmus, amelyik a fehérjék és a membránok közlekedését szabályozza, egy másik jól konzerválódott tulajdonság az eukariótákban

  • A hőérzékenysec mutánsokat annak megfelelően rendezték sorba, hogy hol áll meg a transzport (elektron mikroszkóppal) és ez volt a genetikai analízis kiinduló pontja

  • A vakuolumba történő transzportot és az endocitózist a genetikai analízis, a biokémia és a sejtbiológia módszereinek kombinálásával vizsgálták


Proteosz ma proteasome

Proteoszóma(proteasome)

  • A proteoszóma egy sok alegységből felépülő, az eukariótákban konzerválódott fehérje komplex

  • A citoplazmában és a sejtmagban is van és az ubikitinezett fehérjék lebontását szabályozza

  • A 26S proteoszóma egy 20S katalitikus és egy 19/22S szabályozó alegységből épül fel

  • A 20S proteoszóma 14 különböző fehérjéből áll és az összes ilyen élesztő gén már ismert

  • A 20S élesztő komplexet tisztították és meghatározták röntgen-diffrakciós szerkezetét


Meglep tulajdons gok

Meglepő tulajdonságok

  • Prionok

    • A kerge marha kór miatt kerültek az érdeklődés középpontjába

    • Az élesztőben is találtak két olyan rendszert, amelyek a prionok minden tulajdonságát mutatják!Ezek genetikai elemek, ismert gének alléljei, amelyek a nem-mendeli öröklésmenetet mutatják: a PSI+ (Sup35p) fehérje a transzláció terminációban vesz részt és az URE3 (Ure2p) ami a nitrogén metabolizmus egyik szabályozója

  • Öregedés

    • Ez leginkább a soksejtű organizmusokra jellemző folyamat

    • Az élesztő sejteknek előre meghatározott élettartama van, azaz az anyasejt néhány osztódás után elpusztul

    • Az öregedés folyamata az élesztőben sok hasonlóságot mutat az ember sejtjeinek öregedéséhez, mint például az rDNS gyűrűk felhalmozódása

    • Van egy „közös” gén isa WRN (Werner szindróma) az emberben és azSGS1az élesztőben; a gének homológok és mutációjuk mindkét organizmusban korai öregedést okoz

  • Sejttípus meghatározása

    • A korábban tárgyaltak szerint, az élesztő eltérő sejttípusokat képez, amit eltérő génexpressziós mintázat határoz meg


Funkcion lis genomika

Funkcionális genomika

  • A funkcionális genomika nincs igazán jól definiálva; napjainkban kialakuló technika, igen jól hangzó terminus technicus és sokakat arra késztet, hogy azt is átnevezzék ennek, amit már hosszú-hosszú évek óta csinálnak

  • Ha szigorúan vesszük, akkor azt jelentheti, hogy: „a korábban még nem jellemzett, a genom szekvencia alapján azonosított gének funkciójának meghatározása” a funkcionális genomika

  • Ez a szemlélet az élesztő esetében legalább két szisztematikus programra érvényes; ezek célja az összes, mind a 6200 ORF deléciós származékának előállítása (ez már elkészült) és ezek előzetes fenotípusos jellemzése

  • A funkcióra más módon is következtethetünk; pl. az élesztő kéthibrid rendszerrel a teljes fehérje kölcsönhatás térképet készítik

  • Transzpozon mutagenezissel jelölik (tagging) a fehérjéket, hogy meghatározzák sejten belüli elhelyezkedésüket

  • A működésre vonatkozó információk nyerhetők az expressziós analízisből is (transzkriptomika)

  • A megjelenő fehérjéket 2D gélelektroforézissel vizsgálják, így néhány ezer különböző élesztő fehérjét tudnak elválasztani (proteomika)

  • Mind a 6200 élesztő gén megnyilvánulásának vizsgálata elérhető közelségbe került és ez lehetővé teszi a körülményektől, vagy pedig bizonyos mutációktól függő, a transzkripcióban bekövetkező változások részletes megismerését


Transzkripci s profil transzkriptomika

Transzkripciós profil (transzkriptomika)

  • Az élesztő transzkripciós profilezése realitás és számos, ezt a technikát alkalmazó cikk jelent már meg

  • Az erre vonatkozó adatbázis a Stanford Egyetemen van

  • Egy másik, nagy kollekciót Rick Young laborjában készítettek el


Leszt genetika s molekul ris biol gia

A funkcionális genomikától a rendszer biológiájáig(systems biology)

  • A rendszerbiológia egy lépéssel tovább megy, mint a funkció analízis: a rendszerbiológia célja, hogy leírja az egész sejt működését az összes fehérjéjével együtt

  • Egy szűkebb definíció szerint, a rendszerbiológia egyesíti a matematikai és a kísérletes megközelítéseket a biológiai hálózatok és rendszerek jobb megértése érdekében

  • A rendszerbiológia multidiszciplináris szemléletmódja biológusok, mérnökök és matematikusok részvételét igényli

  • A rendszerbiológián belül két irány van: (1) leírni a sejt összes fehérjéjét összekötő hálózatot és (2) leírni a sejt dinamikus működését

  • Az összekötő hálózat rekonstrukciójához felhasználják az összes rendelkezésre álló adatot, hogy összeköthessék egymással a fehérjéket: genetikai tulajdonságok, génexpresszió, fehérje interakció

  • A dinamikus modellezés és kísérletezés arra irányul, hogy leírja a fő szabályait annak, hogyan is változik a metabolizmus és a jelátvitel a szaporodás, vagy a differenciálódás közben


Leszt biotechnol gia ferment ci s iparok

Élesztő biotechnológia: fermentációs iparok

  • Az élesztős fermentációs ipar, beleértve a sütő-, söripart, a bor készítést és az ipari alkohol gyártást, még ma is a BioTech ipar legnagyobb/jobb üzlete

  • Az ipari törzsekkel nehéz dolgozni, mert általában diploidok, poliploidok, vagy éppen aneuploidok; sok közülük fajok közötti hibrid

  • A fermentációs folyamatok fejlesztésénél sok esetben az élesztő biológiája a limitáló tényező; pedig az élesztő törzsek átalakítására sok lehetőség van

    • Bor élesztők: malonsav→tejsav koverziós képesség (malolactic fermentation), amit normál körülmények között a tejsav baktériumok végeznek (gyorsabb és sokkal megbízhatóbb fermentáció); a szűrést zavaró poliszacharidok bontása; az illatanyagokat glikozidos kötéssel tartalmazó szacharidok hidrolízise (gyümölcsös illat); a versengő baktériumok és élesztők elpusztításának képessége (tisztább fermentáció és jobb bor íz); ozmózis és alkohol tolerancia; jobb termelékenység és kevesebb melléktermék tárolás közben

    • Sörélesztő: poliszacharid bontó képesség ( jobb szűrhetőség és kisebb kalória tartalmú sör); csökkentett acetoin és butándiol termelés (érési idő csökkenése); jobb ozmotolerancia (nagy sűrűségű erjesztés → kisebb térfogat)

    • Szesz élesztő: jobb alkohol hozam (kevesebb glicerin) és tolerancia

    • Sütő élesztő: többféle cukor felhasználás egyszerre a katabolit represszió csökkentésével (jobb kovászosodás); fagyasztás tűrés a megkezdett fermentáció után (fagyasztott tészta); nagy ozmotolerancia (nagy cukor tartalmú tészta)

  • Az élelmiszeriparban megkísérlik a klasszikus genetikai (már ahol lehetséges) és a rekombináns DNS technikák párhuzamos alkalmazását; a közvélemény miatt eddig még nem alkalmazzák a génsebészeti beavatkozásokkal készült törzseket az élelmiszeriparban


Heterol g expresszi heterologous expression

Heterológ expresszió(heterologous expression)

  • Adott fehérje termelése bizonyos célokra:

    • Kutatásra: tisztítás és szerkezeti analízis

    • Iparban: enzimek termelése az élelmiszer- és a papíriparnak, vagy kutatásra és diagnosztikai feladatokra

    • Gyógyszeripar: vakcina, nem glikozilált fehérjék

  • Sokféle expressziós gazda van: baktériumok, élesztők

  • Az élesztők előnye, hogy meg tudják csinálni a fehérjék azonos (vagy nem) poszttranszlációs módosítását, mint pl. a glikozilezés (fajtánként változó)

  • Az élesztőben általában kisebb mértékű termelés érhető el: több mint 50% az E. coli rendszerben és az összes sejtfehérje nem több, mint 10-20 %-a a legjobb élesztő rendszerekben

  • Jelenleg a legtermelékenyebb ismert élesztő faj a Pichia pastoris, ez katabolizálja a metanolt és az egyik alkoholoxidáz génjének (AOX1) promótere igen erős és metanollal indukálható

  • A S. cerevisiae–ben általában a glikolitikus enzimeket kódoló gének promótereit használják, mint pl. a PGK1és a TPI1, vagy pedig szabályozható promótert, mint a GAL1 –é

  • A S. cerevisiaeelőnye, hogy molekuláris biológiája jól ismert és ezért jó genetikai screen alakítható ki a fehérje termelés növelésére és a termék kiválasztására


Heterol g expresszi leszt ben g n kl noz s s funkcion lis anal zis

Heterológ expresszió élesztőben: gén klónozás és funkcionális analízis

  • Az élesztő heterológ expressziót felhasználhatjuk más fajokból való funkcionális gén klónozásra

  • Egész sok emlős és növény gént klónoztak az élesztő mutánsok komplementációjával

  • Ehhez általában egy cDNS könyvtárat klónoznak egy élesztő expressziós vektorba, ahol a cDNS megnyilvánulását egy erős élesztő promóter biztosítja (pl. PGK1)

  • és ezt a könyvtárat használják az élesztő mutánsok komplementációjára

  • Különösen sikeres volt ez az eljárás növényi cDNS-sel, számos transzport és metabolikus gént klónoztak így


Heterol g expresszi leszt ben egyhibrid rendszer one hybrid system

Heterológ expresszió élesztőben: egyhibrid rendszer(one-hybrid system)

  • Az élesztő egyhibrid rendszer alapjában véve egy fél kéthibrid rendszer

  • Egy transzkripciós faktor génjének klónozásához egy olyan cDNS könyvtárat készítünk, amelyikben egy élesztő transzkripciós aktivációs doménhez vannak kapcsolva a klónozott gének és expresszálódnak élesztőben

  • Riporter rendszerként egy olyan hibrid gént használunk, amelyikben a kérdéses emlős, vagy növény promóter fragmentuma van

  • Ha a fúziós fehérjében van olyan DNS kötő domén, amelyik felismeri a heterológ promóter fragmentumot, akkor a riporter gén aktiválódik


Heterol g express z i leszt ben dr o g screening

Heterológ expresszió élesztőben : drog screening

  • Az élesztőt könnyen és jól szaporíthatjuk még mikrotitráló lemezekben is

  • Ez és a rekombináns DNS technikák és a heterológ expresszió alkalmazási lehetőségei miatt az élesztő jó alany arra, hogy nagy teljesítményű drog screenelést lehessen vele végezni

  • A humán drog célpontok egyik igen fontos osztálya a G-fehérével kapcsolt receptoroké (GPCR)

  • Az élesztő párosodási feromon válaszát is ilyen receptor szabályozza, a feromon receptorok GPCR-ek

  • Az útvonalat úgy alakították át, hogy humán GPCR szabályozza az útvonalat és, hogy az útvonal szabályozza a riporter gén megnyilvánulását

  • Ezt használták(ják) humán hormon agonista és antagonista vegyületek szűrésére, ezzel segítve a drogok tervezését

  • Az élesztőt használhatjuk első közelítésben a másodlagos, vagy mellék hatások tesztelésére is, lásd transzkriptomika


  • Login