Plāzmīdu DNS superspiralizācijas ietekmē uz tājās klonētu gēnu ekspresijas līmeni
This presentation is the property of its rightful owner.
Sponsored Links
1 / 18

Gredzenveida divpavedienu plazmīdu DNS molekulas baktēriju šūnā pastāv superspiralizētā formā. PowerPoint PPT Presentation


  • 119 Views
  • Uploaded on
  • Presentation posted in: General

Plāzmīdu DNS superspiralizācijas ietekmē uz tājās klonētu gēnu ekspresijas līmeni Escherichia coli šūnās Jana Sočņeva Gaļina Makarenkova Irina Sominska LU MIKROBIOLOĢIJAS UN BIOTEHNOLOĢIJAS KATEDRA LU BIOMĒDICINAS STUDIJU UN PĒTĪJUMU CENTRS.

Download Presentation

Gredzenveida divpavedienu plazmīdu DNS molekulas baktēriju šūnā pastāv superspiralizētā formā.

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation

Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author.While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server.


- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - E N D - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

Presentation Transcript


Gredzenveida divpavedienu plazm du dns molekulas bakt riju n past v superspiraliz t form

Plāzmīdu DNS superspiralizācijas ietekmē uz tājās klonētu gēnu ekspresijas līmeni Escherichia coli šūnās

Jana Sočņeva

Gaļina Makarenkova

Irina Sominska

LU MIKROBIOLOĢIJAS UN BIOTEHNOLOĢIJAS KATEDRA

LU BIOMĒDICINAS STUDIJU UN PĒTĪJUMU CENTRS


Gredzenveida divpavedienu plazm du dns molekulas bakt riju n past v superspiraliz t form

Lai gan DNS divpavedienu struktūra tika noskaidrota jau pirms piecdesmit gadiem, priekšstati par tās topoloģijas lomu šūnā notiekošo procesu regulācijā veidojās samērā nesen.


Gredzenveida divpavedienu plazm du dns molekulas bakt riju n past v superspiraliz t form

  • Gredzenveida divpavedienu plazmīdu DNS molekulas baktēriju šūnā pastāv superspiralizētā formā.

  • DNS superspiralizācija var but pozitīva un negatīva. .

  • Superpiralizācijas pakāpe var mainīties:

  • DNS replikācijas laikā

  • topoizomerāžu iedarbības

    rezultāta

  • DNS molekulai apvijoties

    ap proteīniem – piemērām RNS

    polimerāzi.


Gredzenveida divpavedienu plazm du dns molekulas bakt riju n past v superspiraliz t form

  • DNS superspiralizācijai ir liela loma daudzos šūnā notiekošajos procesos.

  • Transkripcijas un replikācijas laikā plazmīdu DNS superspiralizācijas pakāpe mainās =plazmīdu superspiralizācijas

    pakāpe ietekmē gēnu ekspresijas līmeni baktēriju šūnās.

  • Tomēr DNS superspiralizācijas izmaiņas biotehnoloģiskiem mērķiem izmantojamās baktēriju kultūrās ir maz pētītas.


Gredzenveida divpavedienu plazm du dns molekulas bakt riju n past v superspiraliz t form

  • DNS superspiralizācija E. coli šūnās tiek regulēta kā kopējas šūnas homeostāzes daļa.

  • Rekombinanatajos baktēriju celmos kuri tiek izmantoti dažadu svarīgu un vajadzīgu proteinu ražošanai bieži novērojamas nekontrolētas klonēto proteīnu gēnu ekspresijas izmaiņas, kuras nav saistītas:

    • ar plazmīdasmutācijām;

    • ar saimniekšūnas mutācijām

    • ar būtiskām izmaiņām šūnu augšanas fizioloģiskajos raksturlielumos.


Gredzenveida divpavedienu plazm du dns molekulas bakt riju n past v superspiraliz t form

  • Par modeļobjektu pētnieciska darba izstrādāšani tika izmantoti klonētucilvēkainterferona IFN – a5

  • gēnu nesošas plazmīdas - pIF564

  • delēciju varianti, kuru interferona

  • sintēzes spējas savstarpēji būtiski atšķīrās.

  • IFN – a5 gēnu izolēja no hromosomālās DNS bibliotēkas kā zondi izmantojot nepilnīgas cDNS klonu (K.Henco, J. Brosius 1985).

  • Šī darba mērķis bija noskaidrot, vai plazmīdu DNS superspiralizācijas pakāpe ietekmē rekombinanta cilvēka interferona IFN – a5 sintēzi baktērijas Escherichia coli šūnas.


Darba gait tika str d ts ar

E.coli TG1 un XL Blue MR celmiem

pIF564 plazmīdu

un tas delēcijas variantiem

pIF693, pIF724

pIF728, pIF731,

pIF733, pIF736,

pIF803, pIF818,

Darba gaitā tika strādāts ar:

pIF564


Plazm du superspiraliz cijas bl vuma m r jumi

Plazmīdu superspiralizācijas blīvuma mērījumi

XL pIF693

6h 10h 24h

TG1 pIF693

6h 10h 24h


Gredzenveida divpavedienu plazm du dns molekulas bakt riju n past v superspiraliz t form

Plazmīdas pIF564 un tas delēciju variantu DNS superspiralizāciju ietekmē:

Baktēriju saimniekšūnu ģenētiskais fons un fizioloģiskais stāvoklis


Gredzenveida divpavedienu plazm du dns molekulas bakt riju n past v superspiraliz t form

  • Novērota korelācija starp rekombinanto plazmīdu superspiralizāciju un IFN - 5 proteīna ekspresijas līmeni – proteīns tiek sintezēts E. coli TG1 celmā, kur plazmīdas ir vairāk superspiralizētas un lielākā skaitā neka XL Blue MR celmā, kur IFN sintēze praktiski nav novērojama


Gredzenveida divpavedienu plazm du dns molekulas bakt riju n past v superspiraliz t form

  • Proteīna uzkrāšanas notiek sākot ar 15 – 24 stundu, sintēze efektīvāk notiek šūnās, kur plazmīdas šajā laikā ir vairāk relaksētas nekā šūnās, kur plazmīdas ir ilgāk saglabājušas lielu superspiralizācijas blīvumu

Rekombinānto plazmīdu

superspiralizācijas izmaiņas (Rf)

E. coliTG1 augšanas ciklā

Rekombinanta IFN - α5 produktivitāte

Tg1 celmā kultūras augšanas ciklā


Gredzenveida divpavedienu plazm du dns molekulas bakt riju n past v superspiraliz t form

Ievērojot to, ka pētītās plazmīdas izmantotie replikācijas un gēnu ekspresijas regulācijas elementi ir identiski, var secināt, ka gēnu ekspresijas efektivitātes atšķirības vienā un tajā baktēriju celmā ir atkarīgas no replikona topoloģijas (superspiralizācijas) īpatnībām. 


Gredzenveida divpavedienu plazm du dns molekulas bakt riju n past v superspiraliz t form

  • Par modeli tālākiem pētījumiem DNS superspiralizācijas lomas noskaidrošanai uz klonēto gēnu ekspresiju tika izvēlēts HBVc antigēna gēns.

HBV kora proteina - HBVc

  • Šīs proteīns spontāni savācas un veido 27nm kora daļiņas pat bez citu HBV proteīnu klātbūtnes.

  • Šīs HBc proteīns ir imunogēns un inducē organisma augstu anti-HBc titru HBV infekcijas laikā ka arī imunizējot dzīvniekus.


Gredzenveida divpavedienu plazm du dns molekulas bakt riju n past v superspiraliz t form

HBV - Kora proteins - HBc


Gredzenveida divpavedienu plazm du dns molekulas bakt riju n past v superspiraliz t form

  • Darbā tika izmantots HBc pilna garuma savvaļas fenotipa un HBc saīsinātais gēna variants.

  • Tie tika veiksmīgi ieklonēts pTVI un pIF693 (labākās IFN - 5 producēts) plazmīdas EcoRI saitā, IFN - 5 vietā. Ka rezultāta tika iegūtās jaunas konstrukcija.

  • Tika pārbaudīts arī HBc pilna un HBc saīsināta ekspresijas līmenis E. coli TG1 celmā.


Gredzenveida divpavedienu plazm du dns molekulas bakt riju n past v superspiraliz t form

Iegūto plazmīdu restrikcijas kartes

pTVI+HBc full

pTVI+HBc short

pHBc-JA-3

pHBc-JA-1

HBc full

HBc short

pIF693+HBc full

pIF693+HBc short

pHBc-JA-2

pHBc-JA-4

HBc short

HBc full


Gredzenveida divpavedienu plazm du dns molekulas bakt riju n past v superspiraliz t form

HBc proteīna analīze SDS – PAA elektroforēzes gelā

Kont. JA-1 JA-1 JA-2 JA-2 JA-3 JA-3 JA-4

20.kDa

14 kDa

HBc pilna garuma 22kDa HBc saisinātais variants 15kDa


Gredzenveida divpavedienu plazm du dns molekulas bakt riju n past v superspiraliz t form

Paldies par uzmanību!


  • Login