testov n toxicity pr myslov ch chemik li ii senzibilizace k e a genotoxicita
Download
Skip this Video
Download Presentation
Testování toxicity průmyslových chemikálií II – senzibilizace kůže a genotoxicita

Loading in 2 Seconds...

play fullscreen
1 / 22

Testování toxicity průmyslových chemikálií II – senzibilizace kůže a genotoxicita - PowerPoint PPT Presentation


  • 113 Views
  • Uploaded on

Testování toxicity průmyslových chemikálií II – senzibilizace kůže a genotoxicita. Průmyslová toxikologie (C867). Senzibilizace kůže (alergická kontaktní dermatitida ACT). Testovací metody. LLNA – Local Lymph Node Assay (Test regionálních mízních uzlin) - OECD 429

loader
I am the owner, or an agent authorized to act on behalf of the owner, of the copyrighted work described.
capcha
Download Presentation

PowerPoint Slideshow about ' Testování toxicity průmyslových chemikálií II – senzibilizace kůže a genotoxicita' - kynan


An Image/Link below is provided (as is) to download presentation

Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author.While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server.


- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - E N D - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
Presentation Transcript
testov n toxicity pr myslov ch chemik li ii senzibilizace k e a genotoxicita

Testování toxicity průmyslových chemikálií II – senzibilizace kůže a genotoxicita

Průmyslová toxikologie (C867)

senzibilizace k e alergick kontaktn dermatitida act
Senzibilizace kůže (alergická kontaktní dermatitida ACT)

Testovací metody

  • LLNA – Local Lymph Node Assay (Test regionálních mízních uzlin) - OECD 429
  • GMPT - Maximalizační test na morčatech - OECD 406
senzibilizace k e alergick kontaktn dermatitida act1
Senzibilizace kůže (alergická kontaktní dermatitida ACT)

LLNA – OECD 429

  • Vyvolání alergické reakce vyžaduje aktivaci a následnou expanzi T-lymfocytů
  • Střet kůže se senzibilizátorem vyvolá transport antigenů z kůže do lymfatických uzlin
  • Antigenem řízená aktivace T-lymfocytů má za následek dělení a diferenciaci alergen-specifických T-lymfocytů
  • Nárůst počtu T-lymfocytů je měřitelným ukazatelem reakce organismu na kontakt s látkou mající senzibilizační potenciále
senzibilizace k e alergick kontaktn dermatitida act2
Senzibilizace kůže (alergická kontaktní dermatitida ACT)

LLNA – OECD 429

  • Pokusná zvířata – samice myší staré 8 – 12 týdnů, kmen BALB/c, NMRI

Postup

  • testovaná látka – 3 různé koncentrace
  • negativní kontrola – aceton/olivový olej, dimethysulfoxid aj.
  • pozitivní kontrola - dinitrochlorbenzen aj.
senzibilizace k e alergick kontaktn dermatitida act3
Senzibilizace kůže (alergická kontaktní dermatitida ACT)

LLNA – OECD 429

DEN 1 – 3

  • aplikace test. látky na dorsální stranu obou uší , aplikační objem 25 mLna ucho

DEN 6

  • aplikace fyziologického roztoku obsahujícího předepsané množství radionuklidu
    • (3H thymidinnebo 125I deoxyuridin)
  • 5 hodin po aplikaci utracení zvířat a odběr uzlin
senzibilizace k e alergick kontaktn dermatitida act6
Senzibilizace kůže (alergická kontaktní dermatitida ACT)

LLNA – OECD 429

Vyhodnocení

  • Příprava buněčné suspenze
  • Měření inkorporované aktivity v dpm

Výpočet Indexu stimulace:

  • průměrná hodnota dpm exponované skupiny/ průměrná hodnota dpm kontrolní skupiny
  • je-li IS větší nebo roven 3 je látka považována za senzibilizující.
  • dávková závislost
senzibilizace k e alergick kontaktn dermatitida act7
Senzibilizace kůže (alergická kontaktní dermatitida ACT)

GMPT - OECD 406

  • Indukční fáze:
  • kontaktem kůže se senzibilizátorem jsou aktivovány T-lymfocyty a dochází k jejich proliferaci (jako u testu LLNA)
  • Provokační fáze:
  • opakovaným kontaktem se senzibilizátorem je u zvířete vyvolána alergická reakce – kontaktní dermatitida

Pokusná zvířata:

  • albinotická morčata obou pohlaví, váha 150 – 250 g, kmen BFC, ve studii 30 zvířat (20 exponovaných + 10 kontrolních)
senzibilizace k e alergick kontaktn dermatitida act8
Senzibilizace kůže (alergická kontaktní dermatitida ACT)

Metodika:

  • DEN 1 - indukční expozice intradermální
  • DEN 7- lokální indukce dermální
  • DEN 21- provokace
  • DEN 23 a 24 – odečet kožní reakce

GMPT - OECD 406

  • Vyhodnocení:
  • 24 a 48 hodin po aplikaci se vyhodnotí kožní reakce (zarudnutí, otok)
  • Porovnává se reakce kůže exponované testovanou látkou a reakce kůže exponované vehikulem
  • Pozitivní výsledek = 30% morčat má pozitivní reakci na kůži tj. zarudnutí případně otok
senzibilizace k e alergick kontaktn dermatitida act9
Senzibilizace kůže (alergická kontaktní dermatitida ACT)

Porovnání GPMT a LLNA testu

GMPT :

  • Manipulace: holení, injekční aplikace, opakovaná bandáž
  • Test trvá 25 dní
  • Výsledek = subjektivní hodnocení

LLNA:

  • Manipulace: přímá aplikace test. látky neinvazivní formou
  • Test trvá 6 dnů
  • Výsledek = číslo
  • U některých látek nelze použít
genotoxicita
Genotoxicita
  • Studie poskytují informace o možných genotoxických vlastnostech látek tj. o schopnosti způsobovat změny genetického materiálu - mutace

Rozdělení mutací

  • genové - změny v molekule DNA
  • chromozomální - chromozomální aberace (změny struktury a tvaru chromozómu)
  • genomové - změny v chromozomálním počtu
  • nechromozomální - mimojaderné
genotoxicita testovac metody
Genotoxicita - testovací metody
  • Mutagenita - test chromozómových aberací u savčích buněk in vitro
  • Mutagenita - test chromozómových aberací v kostní dřeni savců in vivo
  • Mutagenita in vivo mikronukleus test v savčích erytrocytech
  • Mutagenita-test reverzních mutací u baktérií
  • Genové mutace-Saccharomyces cerevisiae
  • Mitotické rekombinace Saccharomyces cerevisiae
  • Mutagenita-test genových mutací v savčích buňkách in vitro
  • Poškození DNA reparace- neplánovaná syntéza DNA-savčí buňky in vitro
  • SCE - výměna sesterských chromatid in vitro
  • Recesivní letální mutace vázané na pohlaví u Drosophilla melanogaster
  • Test transformace savčích buněk in vitro
  • Dominantní letální test u hlodavců
mutagenita test reverzn ch mutac u bakt ri oecd 471
Mutagenita - test reverzních mutací u baktérií – OECD 471
  • Detekce genových mutací – mutace v genu pro syntézu aminokyselin His (Trp)
    • zkouška pro počáteční vyšetření genotoxické aktivity
    • pět kmenů bakterií je vystaveno působení zkoušené látky za přítomnosti i bez přítomnosti metabolického aktivačního systému
    • aktivační systém – posmitochondrionální frakce z jater hlodavců ošetřených prostředkem indukujícím enzymy
  • Kontrola počtu narostlých kolonií po 48-72 hod – porovnání počtu kolonií revertantů (v přítomnosti testované látky) s počtem kolonií spontánních revertantů (NK)
mutagenita test chromoz mov ch aberac u sav ch bun k in vitro oecd 473
Mutagenita - test chromozómových aberací u savčích buněk in vitro – OECD 473
  • Identifikace látek způsobující strukturní chromozomové aberace = změny ve struktuře nebo počtu chromozomů
    • zjištění možných mutagenů a karcinogenů u savců

Základní rozdělení aberací:

  • Chromatidového typu
  • Chromozomového typu
  • Pro test se používají stabilizované buněčné linie, buněčné kmeny nebo primární buněčné kultury
mutagenita test chromoz mov ch aberac u sav ch bun k in vitro oecd 4731
Mutagenita - test chromozómových aberací u savčích buněk in vitro – OECD 473
  • Kultury jsou vystaveny zkoušené látce (a to s metabolickou aktivací i bez ní), v předem stanovených intervalech se přidává látka zastavující metafázi (např. Kolchicin)
  • Hodnocení přítomnosti chromozomových aberací - nejméně 200 mitóz (46±2 centromery)
  • Stanoven Mitotický index - buňky v metafázi : celkový počet buněk v populaci
  • Procento aberentních buněk vůči negativní kontrole
mutagenita test chromoz mov ch aberac u sav ch bun k in vitro oecd 4732
Mutagenita - test chromozómových aberací u savčích buněk in vitro – OECD 473

Chromozomový zlom

Chromozomové aberace - příklady

Prstencový chromozom (kruhový fragment)

mutagenita test chromoz mov ch aberac u sav ch bun k in vitro oecd 4733
Mutagenita - test chromozómových aberací u savčích buněk in vitro – OECD 473

Acentrický fragment

Chromozomové aberace - příklady

Dicentrický chromozom

mutagenita in vivo mikronukleus test v sav ch erytrocytech oecd 474
Mutagenita – in vivo mikronukleus test v savčích erytrocytech - OECD 474
  • Mikronukleus test zjišťuje poškození, jež testovaná látka způsobuje v chromozómech nebo mitotickém aparátu erytroblastů.
  • Výsledkem cytogenetického poškození je vznik mikrojader – chromozómových fragmentů v erytrocytech a současně změna v poměru zralých a nezralých erytrocytů v kostní dřeni.
  • Pro tento test existuje in vitro metoda – v současné době je ve fázi schvalování
  • Metodika in vivo – pokusné zvíře potkan
    • testovaná látka v 1 – 3 koncentracích
    • negativní kontrola + pozitivní kontrola
    • jednorázová aplikace
    • vyšetření kostní dřeně 24 a 48 hodin po aplikaci
mutagenita in vivo mikronukleus test v sav ch erytrocytech oecd 4741
Mutagenita – in vivo mikronukleus test v savčích erytrocytech - OECD 474

Hodnocení kostní dřeně

Normochromní erytrocyt:

  • zralý erytrocyt, barvící se eosinofilně – červenooranžově

Polychromní erytrocyt:

  • nezralý erytrocyt, barvící se bazofilně - šedomodře

Mikrojádra:

  • fragmenty jádra vznikající během dělení buňky z chromozómů opožděných v dělení

Hodnocení

  • poměr zralých a nezralých erytrocytů
  • přítomnost nezralých erytrocytů s mikrojádry
mutagenita in vivo mikronukleus test v sav ch erytrocytech oecd 4742
Mutagenita – in vivo mikronukleus test v savčích erytrocytech - OECD 474

savčí buňky s mikrojádry – in vitro test - příklady

ad