Electroforesis capilar
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Electroforesis Capilar. Electroforesis. Definición: Técnica de separación de moléculas iónicas, de acuerdo a su tamaño y carga, en un campo eléctrico. Electroforesis. v. +. -. q. Campo eléctrico E. Fuerza eléctrica Eq = fv E = campo eléctrico q = partícula cargada

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Presentation Transcript

Electroforesis
Electroforesis

Definición:

Técnica de separación de moléculas iónicas, de acuerdo a su tamaño y carga, en un campoeléctrico.


Electroforesis

v

+

-

q

Campo eléctrico E

Fuerza eléctrica

Eq = fv

E = campo eléctrico

q = partícula cargada

f = coeficiente de fricción

v = velocidad

Movilidad

u = v/E

u = movilidad

Tamaño y forma de la partícula



Electroforesis1
Electroforesis

Parámetros que influyen en la movilidad electroforética

  • Campo eléctrico

  • Temperatura

  • Viscosidad

  • Fuerza iónica

  • pH

  • Carga del soluto

  • Forma y tamaño del los iones


Electroforesis

Instrumentación básica

Fase estacionaria:

Solutos no iónicos (sacarosa, glicerol)

Soporte semisólido (papel, acetato de celulosa, almidón, poliacrilamida, agarosa)

“Fase móvil”:

Fuente de poder que suministre voltajes de 20 V/cm - 200 V/cm


Electroforesis

Instrumentación básica


Electroforesis

Aplicaciones

Método de separación de:

Proteínas

Ácidos nucleicos

Biomoléculas (insulina, lipoproteínas, enzimas)

Permite determinar:

Peso molecular de proteínas

Punto isoeléctico

Distinguir moléculas por su carga neta


Electroforesis capilar1
Electroforesis Capilar

Desventajas de la electroforesis convencional

Generación de calor debido al voltaje aplicado limitando la resolución

Tiempos de análisis largos

Análisis cuantitativo impreciso

Difícil de automatizar

Voltaje limitado 20 – 200 v/cm



Antecedentes hist ricos
Antecedentes Históricos

Electroforesis Capilar

(1967) Hjerten usa capilares milimétricos para separar iones cargados eléctricamente, favoreciendo así la disipación del calor generado

(1979) Virtamen y Makkers: desarrollan separaciones electroforéticas en capilares de 200 μm

(1980) Jorgenson y Lukacs generan capilares de silica fundida con diámetros 75 μm. Surge la EC la cual opera a voltajes de 400 – 500 v/cm en cámaras refrigeradas con aire.


Electroforesis Capilar

Ventajas frente HPLC

Tamaño de muestra: 1 – 10 nL

Tiempos de análisis cortos, 10 – 40 min

N = 100 000 – 200 000

Mínimo ensanchamiento de picos

Consumo de reactivos reducido



Electroforesis Capilar

Definición:

Nanotécnica de separación de moléculas cargadas, en el seno de una solución amortiguadora contenida dentro de un capilar.


Electroforesis Capilar

Fundamento:

La técnica se basa en la migración diferencial de las partículas cargadas, en sentido y velocidad en un campo eléctrico


Electroforesis Capilar

Conceptosbásicos

Velocidad de migración

v= μe ·E

V = velocidad lineal del ión

μe = velocidad electroforética de un ión

E = campo eléctrico aplicado (V/cm)


Electroforesis Capilar

Conceptosbásicos

Velocidad electroforética

μe= qE/6πηr

q= carga de un ión

r = radio de un ión

E = campo eléctrico aplicado (V/cm)

η = viscosidad de la disolución


Electroforesis Capilar

Conceptosbásicos

Velocidad electroosmótica

μeo= movilidad electroosmótica

Veo

Veo = μeo E

3 4 5 6 7 8

pH


Electroforesis Capilar

Velocidad electroosmótica

V eo= μeo E

Doble capa eléctrica

SiO-

Zona difusa


Electroforesis Capilar

Velocidad electroosmótico

V = μeo E

Dependerá de:

pH, a pH altos el flujo será mayor que a pH ácidos

Fuerza iónica, a mayor fuerza iónica se reduce el flujo electroosmótico


Electroforesis Capilar

Velocidad total del ión

Vtotal= (μe + μeo )E= Ve + Veo

V electroosmótica

V Total = ve + veo

V electroforética

++

++

+

+

-

-

- -

- -

V Total = veo - ve


Electroforesis Capilar

Electroferograma:

Grafico resultante de una electroforesis capilar

Señal

- -

++

+

-

Tiempo


Electroforesis Capilar

Tiempo de migración

t = L2/μtotal

L = Longitud de la columna

μtotal = μe + μeo


Electroforesis Capilar

Eficiencia de la Electroforesis Capilar

N = μtotal V/2D

3

D = coeficiente de difusión del soluto en cm2 s-1

V = voltaje aplicado

> potencial aplicado mayor es N

2

N (x10-5)

1

0

KV

10

20

30


Electroforesis Capilar

Resolución

R = 2(t2-t1)/W1 +W2


Electroforesis Capilar

Electroferograma

Representación gráfica de las especias separadas

por electroforesis capilar.


Electroforesis Capilar

Instrumentación básica

Capilar de silicie


Electroforesis Capilar

Capilar

Silice fundida recubierto de

Poliimida

Longitud: 20 – 100 cm

Diámetro interno: 20 – 200 μm


Electroforesis Capilar

Soluciones llenado del capilar

Buffer de Fosfatos

Buffer de Boratos

Solución de Cromato


Electroforesis Capilar

Sistema de detección

Detector Limite detección

UV/Vis 10-5 – 10-6 moles

Fluorescencia 10-7 – 10-9

Amperométrico 10-10 – 10-11

Conductividad 10-7 – 10-8

Espectrometría de masas 10-8 – 10-9


Electroforesis Capilar

Tratamiento preliminar de la muestra

Las muestras deben ser previamente centrifugadas y/o filtradas en filtros de 0.22 - 45 μm


Electroforesis Capilar

Métodos hidrodinámicos de inyección

Vacío

Presión

Muestra

Muestra

Efecto sifón

Muestra


Electroforesis Capilar

Método electrocinético de inyección

Muestra

1/3 – 1/5 Voltaje de separación


Electroforesis Capilar

Modos de separación

Electroforesis Capilar de Zona (CZE)

Electroforesis Capilar de Gel (CGE)

Isoelectroenfoque Capilar (CIEF)

Isotacoforesis Capilar (CITP)


Electroforesis Capilar

Electroforesis Capilar de Zona (CZE)

El capilar esta lleno con una solución buffer

La separación de los iones esta influenciada por el flujo electroosmótico

Uso de aditivos o modificadores de flujo electroosmótico: detergentes catiónicos


Electroforesis Capilar

Electroforesis Capilar de Zona (CZE)

Cátodo

Ánodo

Buffer

Buffer

Buffer

Buffer

3

2

1


Electroforesis Capilar

Aplicaciones CZE

Separación de iones


Electroforesis Capilar

Aplicaciones CZE

Antiinflamatorios


Electroforesis Capilar

Aplicaciones CZE

Proteínas


Electroforesis Capilar

Electroforesis Capilar en Gel (CGE)

Capilares rellenos con un gel

Gel covalentemente unido a la silica

(Poliacrilamida, agarosa, polietilenglicol)

Gel libre en el capilar

Separación esta basada en el tamaño

Separación de grandes moléculas como fragmentos de ADN, oligonucleótidos, proteínas


Electroforesis Capilar

Electroforesis Capilar en Gel (CGE)

( + )

( - )

+

++

++

Gel

Migración


Electroforesis Capilar

Isoelectroenfoque (CIEF)

Separación de aminoácidos anfóteros

La matriz presenta un gradiente de pH

Determinación de punto isoeléctrico de proteínas

Orden de migración. 1º proteínas más alcalinas seguidas de las ácidas


Electroforesis Capilar

Isoelectroenfoque (CIEF)

Cátodo

Ánodo

H+

OH-

p3

p1

p2

Gradiente de pH


Electroforesis Capilar

Puntos isoléctricos de proteínas


Electroforesis Capilar

Isoelectroenfoque de proteínas


Electroforesis Capilar

Skoog 5ª Ed .Principios de análisis instrumental

QD79 15 S5.68

Galen W. Ewing Analytical Instrumental Hadbook. Cap. 25

QH 345 C.527

Rubinson and Rubinson.Química Analítica Contemporánea. Cap. 14.


Electroforesis Capilar

Isotacoforesis Capliar (CITP)

Separación independiente de iones o cationes

Utiliza un buffer discontinúo

La muestra se aplica entre dos buffer


Electroforesis Capilar

Isotacoforesis Capilar (CITP)

Buffer baja movilidad

Ánodo

Buffer elevada movilidad

Cátodo

1

2

3


Electroforesis Capilar

Aplicaciones

Análisis inorgánicos

Ácidos orgánicos

Aminoácidos, péptidos y proteínas

Ácidos nucleicos y oligonucleotidos

Carbohidratos y oligosacáridos

Clínica

Farmacología


Electroforesis Capilar

Principios de análisis instrumental

Skoog 5ª Ed QD79 15 S5.68

Analytical Instrumental Hadbook. Cap. 25

Galen W. Ewing

QH 345 C.527