ENZIMAS Substâncias orgânicas de estrutura complexa geradas no interior da célula aceleram reações químicas que ocorr

1. ENZIMAS • Substâncias orgânicas de estrutura complexa geradas no interior da célula • aceleram reações químicas que ocorrem em sistemas biológicos. • Podem ser encontradas em células animais ou de plantas, bem como em microorganismos.

2. Quimicamente, são proteínas globulares constituídas de longas cadeias de aminoácidos unidas por ligações peptídicas

3. 20 aminoácidos comumente encontrados nas proteínas: Cadeia com menos de 50 AA peptídeos. Proteínas cadeias maiores

4. ESTRUTURA TRIDIMENSIONAL • Podem ter 4 tipos de estrutura • Estrutura primária: - mais simples e mais importante, pois dele deriva todo o arranjo espacial da molécula - é somente a seqüência dos aminoácidos, sem se preocupar com a orientação espacial

5. Estrutura secundária • rotação das ligações entre os carbonos dos aminoácidos de seus grupamentos amina e carboxila. • Alfa-hélice: • forma mais comum; • hélice em espiral - as cadeias laterais dos se distribuem para fora da hélice; • - ponte H.

6. Folha beta ou folha pregueada. • - arranjados em paralelo ou no sentido anti-paralelo.

7. Estrutura terciária • resulta do enrolamento da hélice ou da folha pregueada, • estabilizada por pontes de hidrogênio e pontes de enxofre, - têm seqüências de aminoácidos diferentes, refletindo estruturas e funções diferentes, - Forças fracas, podem ser facilmente quebradas – desnaturação

8. Estrutura quaternária • possuem duas ou mais cadeias polipeptídicas. • a estrutura tridimensional destas é a estrutura quaternária. • - Ex: hemoglobina - sua estrutura é formada por quatro cadeias polipeptídicas

9. Estreita relação entre a estrutura da enzima e sua função: • são altamente específicas • somente certos substratos sofrem sua ação e unicamente um tipo de reação ocorre, sem reações colaterais ou produtos derivados, • se sua estrutura mudar – não catalisa mais aquele substrato • Como isso ocorre?

10. O substrato liga-se à enzima através do sítio ativo, local onde ocorrerá a reação catalisada pela enzima. • SÍTIO ATIVO • resíduos de aminoácidos capazes de interagir com o substrato e formação do produto. • Estes resíduos denominam-se grupos catalíticos

11. Asp Ser His Representação esquemática da estrutura tridimensional da lipase de Pseudomonas cepacia.

12. Teoria da “chave-fechadura” proposta por Emil Fischer • O sítio ativo possui uma conformação cujos grupos ligantes R dos aminoácidos estão corretamente posicionados, e sua conformação é complementar a estrutura do substrato

13. Modelo do “encaixe induzido”, proposto por Koshland • o sítio ativo é uma região flexível cuja forma pode ser induzida para alojar compostos estruturalmente semelhantes.

14. Vantagens de utilizá-las como catalisadores: aumentam de várias ordens de grandeza a velocidade das reações, as reações ocorrem em condições suaves de temperatura, pressão, e em meio de pH e concentração salina praticamente constantes, são altamente específicas e capazes de diferenciar estereoisômeros de certos compostos, sem formar subprodutos, têm capacidade de regular processos, como aceleram a velocidade da reação sem alterar o equilíbrio termodinâmico, elas podem catalisar um grande número de reações.

15. União Internacional de Bioquímica e Biologia Molecular (UIBBM) • classificadas em seis grandes grupos, de acordo com o tipo de reação envolvida • Cada enzima descrita recebe um número de classificação, conhecido por “E.C.”, que é composto por 4 dígitos: • 1. Classe • 2. Sub-classe dentro da classe • 3. grupos químicos específicos que participam da reação. • 4. a enzima, propriamente dita

16. Classificação das Enzimas - UIBBM Classe Tipo de Reação Subclasse 1 Oxidoredutases Transferência de elétrons ou Hidrogenases, oxidases, remoção de hidrogênio peroxidases, etc 2 Transferases Reações de transferência de Transaldolases, grupos transcetolases, etc 3 lipases Hidrolases Reações de hidró lise Estearases, , peptidases, fosfatases, etc 4 Liases Reações de adição de grupos Descarboxilases, a dupla ligação ou formação cetoácidoliases, hidroliases, pectato liase de duplas ligações por remoção de grupos 5 Isomerases Transferência de grupos Racemases, epimerases, dentro da moléc ula para oxirredutases, mutase, etc produzir isômeros 6 Ligases Formação e clivagem de ligações C - O, C - S, C - C e C - N e ésteres de fosfato

17. Exemplo: Pectato Liase EC 4.2.2.2 EC 4.2.2.2 liase Pectato liase carbono-oxigênio liase ativa em polissacarídeos

18. COFATORES ENZIMÁTICOS E COENZIMAS • Cofatores: • um ou mais íons inorgânicos que podem ser necessários para a função de uma enzima.  • não estão ligados permanentemente à molécula da enzima mas, na ausência deles, a enzima é inativa.

19. Coenzimas: • compostos orgânicos, quase sempre derivados de vitaminas, • a fração protéica de uma enzima, na ausência do seu cofator, é chamada de apoenzima. • enzima + Cofator, chamamos de holoenzima.

20. IMOBILIZAÇÃO DE ENZIMAS As enzimas quando imobilizadas: retém sua configuração estrutural devido as ligações de hidrogênio que ocorrem na superfície do material dificuldade de vibração Aumento da estabilidade térmica.

21. O principal interesse em imobilizar uma enzima é obter um biocatalisador com atividade e estabilidade que não sejam afetadas durante o processo.

22. Vantagens da imobilização: aumenta a estabilidade das enzimas, baixo custo, facilita a separação e recuperação das enzimas, reutilização, possibilitando operações contínuas.

23. Tipos de Suporte • materiais inertes com pouca ou nenhuma interferência no comportamento cinético da enzima. • O suporte para ser efetivo na imobilização deve: • deixar a enzima acessível aos substratos, • manter a atividade por um longo período • possibilitar a regeneração do sistema suporte/enzima ao final do processo, sem que ocorra a perda da atividade enzimática.

24. Exemplos de suportes inertes

25. Métodos de Imobilização de Enzimas Enzima • Ligações cruzadas • Hexametilenodiamina e glutaraldeído • Confinamento em microcápsula • Gelatina, quitosana, alginato carragenana com cloreto de cálcio ou potássio • Confinamento em matriz • Polímeros naturais: gel de agar, caseinato de sódio • Orgonogéis de microemulsão óleo-água, aerogéis de sílica. • Ligações em suportes • Adsorção física: álcool polivinílico (PVA), xantana, quitosana, galactomanana, poli-oxido de etileno (PEO), poli(ácido acrílico) (Carbopol), nylon 6. • Adsorçção covalente: sílica, alumina, celulose, poli(etilenoglicol) (PEG), metoxi(polietilenoglicol)-p-nitrofenil carbonato. • Adsorção iônica: resinas de troca iônica: DEAE-sefadex, carboximetilcelulose, Dowex 66, duolite 568N) Solvente orgânico Água + enzima Sistema bifásico

26. Atividade Enzimática Atividade biológica capacidade que as enzimas possuem de reagir com determinados constituintes das células irá depender da estrutura da proteína

27. As medidas de [ ] em m/V, não tem aplicação para soluções enzimáticas • O que importa não é a massa, mas a atividade Conserva a massa protéica Proteínas desnaturadas Sem atividade catalítica

28. Dosagem: através da medida de sua atividade Avaliada pela velocidade da reação que a enzima catalisa ([S] ou [P]) uma amostra da solução contendo a enzima é incubada com [ ] de substratos (Vmáx.) Tempo (min.)

29. Atividade medida da velocidade de reação em condição inicial (velocidade constante) • A velocidade da reação é medida e expressa em Unidades (U). 1 U é a quantidade de enzima capaz de formar 1µmol de produto por minuto em condições ótimas

30. Métodos para a determinação da atividade de enzimas: • Conhecimento prévio da faixa de [ ] enzimática que permite obter uma variação linear da [P] (ou [S]) com o tempo. • Métodos para avaliar as [ ] das espécies: • Muito diretos: - Espectrofotometria, - Titulometria... • Menos diretos: - Medida da Viscosidade.

31. Exemplo: Determinar a atividade de pectinase (quebra a pectina): 1mL/L 0,1 mL Pectinase 0,1 mL solução enzima + 0,9 mL: solução de pectina + 2mL DNS Total = 4mL Após 5 min dosa-se produto: 0,476 µmol/mL 0,476 µmol/mL em 5 min  0,0952 µmol/min A = 0,0952 х 4mL х 1000 = 380,8 µmol mL-1min-1 A = 380,8 U/mL

32. A velocidade das reações enzimáticas varia com diversos fatores: • pH • substrato • concentração de enzima • temperatura.

33. Influência do pH • Valor de pH ótimo = atividade máxima; • Velocidade da reação : pH afasta do ótimo; • Influência do pH: dos grupos dissociáveis;

34. Um equilíbrio químico de um ácido fraco pode ser escrito como: HA  A- + H+ As concentrações de HA e de A- dependem do pH pH   HA   A- pH ótimo concentração hidrogeniônica (H+) que leva a molécula de enzima à conformação ideal para exercer seu papel catalítico

35. pH ótimo: determinado a partir de uma curva do efeito do pH na atividade enzimática muitas enzimas apresentam uma curva indicando que não existe um único valor de pH ótimo, mas uma faixa de pH ótimo (6,0 a 8,5). 6 > pH > 8,5 = inativação irreversível.

36. Influência da temperatura •  T  velocidade de reação =  energia cinética; K é função crescente da T  Lei de Arrhenius

37. T muito elevadas = desnaturação da enzima Rompidas as pontes de hidrogênio  alterações estruturas = nova conformação; T desnaturação  pouco acima da T ótima. Note que quanto maior a temperatura de, mais rápido é o processo de desnaturação térmica.

38. Efeito da concentração do substrato na velocidade da reação Cinética Enzimática