LIDSKÝ GENOM

1. LIDSKÝ GENOM

2. Struktura genomu člověka

3. Sekvenování lidského genomu National Human Genome Research Institute (NHGRI), NIH Human Genome Project (HGP) 1990-2003, pětileté plány

4. Lidský genom • Velikost genomu ~ 3 164 700 kb • Počet genů ~ 20-25 000 • Velikost průměrného genu ~ 3000bp • Téměř všechny báze jsou stejné (~99.9%) u všech lidí • Funkce u více než 50% genů není známá • Méně než 2% genomu kóduje proteiny • 50% genomu tvoří repetice • Během posledních 50 mil let silný pokles aktivity TE • Genově bohaté oblasti jsou GC-bohaté, repetice AT-bohaté • Náhodná distribuce genově-bohatých oblastí, oddělené repeticemi • Chrom.1 má nejvíce genů (2968) a chrom. Y nejméně (231) Srovnání lidského genomu s genomy jiných organizmů • Genové ostrovy u člověka versus homogenní distribuce genů u jiných organizmů • 3x více proteinů než D.m. nebo C.e. díky alternativnímu sestřihu (35-60% genů) • Stejné genové rodiny jako u D.m., C.e., rostlin, ale počet členů rodin expandoval • Větší podíl repeticí – C.e. (7%), D.m. (3%), A.t. (11%)

5. Lidský jaderný genom (projekt HUGO Human Genome Organization, založen 1990) Publikace 2001, zpřesnění 2004, 2006. 25,2 % geny (1,2% exony, 24% introny); 22 287 genů kódujících proteiny (odhad z roku 2004, dnes okolo 21 000 genů) 21-22% mezigenová DNA (heterochromatin, regulační sekvence, pseudogeny, genové fragmenty) 50% genomu jsou repetitivní sekvence (tandemové x disperzní; vysoce x středně repetitivní) Tandemové: centromery – satelitní DNA, telomery, mikrosatelity, minisatelity, rDNA klastry…) Disperzní: většina transponovatelných elementů - 45% genomu. Celera Genomics (Venter), 2001 Mezinárodní Konsorcium, 2001

6. Lidský genom Lidský mitochondriální genom 16,6 kbp, 37 genů 22 genů pro rRNA, 2 pro tRNA, 13 pro proteiny dýchacího řetězce (ty jsou syntetizovány na mitochondriálních ribozomech, zbytek je kódován v jádře, syntetizován na ribozomech v cytosolu a pak exportován do mitochondrií) - Původ mitochondrií z α – proteobakterií (Ricketsia) - endosymbióza

7. Lidský genom Dnes podle ENSEMBL: http://www.ensembl.org/Homo_sapiens/Info/StatsTable?db=core • Databáze sekvencí DNA • GenBank (USA)– dnes provozována Národním centrem pro biotechnologické informace (NCBI = National Center for Biotechnology Information), která je součástí Národní lékařské knihovny (NLM = NationalLibraryofMedicine); www.ncbi.nih.gov • EMBL (EuropeanMolecular Biology Laboratory) • DDBJ (DNA DataBankof Japan) • Dnes propojeny dohromady všechny; v databázích se dají hledat sekvence podobné zadaným sekvencím (BLAST = Basic LocalAlignmentSearchTool) • http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genomes/

8. Další typické vlastnosti lidského genomu Expanze genových rodin a rozdíly v negenových oblastech RNA nekódující proteiny: • mnoho transkriptů nekódujících proteiny a s neznámou funkcí • „transfrags“ – transkribované fragmenty genů, role v reorganizaci chromatinu nebo regulace dostupnosti polymeráz či TF, role antisense transkriptů v regulaci genové exprese • přes 1000 miRNAs Ultrakonzervativní elementy: • 481 UCEs delších 200bp, 100% identita mezi člověkem, myší a potkanem • UCE jsou enhancery genů (někdy homologie s TE) Genomová struktura: - nepotvrzena opakovaná polyploidizace v historii, 45% repeticí, duplikace

9. Lidský chromosom Y Sál plný zrcadel PAR1 PAR2 Palindromy: • 3 000 000 bází dlouhé • 99.9% identita Homologní oblasti mezi X a Y Duplikativní přenos z X Palindromy

10. Chromosom Y člověka a šimpanze Genom člověka a šimpanze • Genové duplikace • Expanze transposonů • Mutace • Posttranskripční a translační modifikace • Odlišné používání genů (alternativní promotory a alternativní sestřih) • speciace ~ 6.3 mil • následné křížení • větší podobnost chromosomu X rozdíly v amplikonových oblastech 1.23% rozdíl

11. Genom má mozaikovitou strukturu Některé oblasti bližší šimpanzovi, jiné gorile - vznik retrogenů v linii primátů - role ve spermatogenezi 38-50 mil let

12. myš člověk Genom člověka a myši • Od evoluční divergence proběhly četné přestavby, které umístily bloky genů do různých kombinací. • Konzervativita chromosomu X.

13. Dystrofinový gen 79 exonů, nejdelší známý gen, 14kb mRNA 2.5 Mb dlouhý (0.1% genomu) Gen „Metuzalém“ Mutace jednoho z genů skupiny daf, a to daf-2, 6x delší život u červa C. elegans. Gen mth (methuselah), kromě dlouhověkosti, dává svému nositeli také zvýšenou odolnost vůči různým formám stresu. Gen kóduje G protein vázající receptor a ten se účastní při řízení metabolických pochodů, příjmu potravy, tělesné hmotnosti, výdeje energie, řízení cyklu spánku a bdění,…

14. FOXP2 – důležitý lidský gen (forkhead box P2) - důležitý pro rozvoj řeči, mutace v rodinách s poruchou řeči - souvislost s chápáním pojmů, gramatika, kreativita, kultura - existuje i u jiných živočichů - nová lidská forma vznikla před 200 000 let - délka 14 063 bp • divergenece od šimpanze 0.87%, orangutana 2.5% • lidská forma přítomná u Neandertálce

15. BUDOUCNOST VÝZKUMU LIDSKÉHO GENOMU

16. Variabilita a mutace • 99.9% identita mezi jedinci • 1.4 milionů polymorfních míst (SNP) – vazba na choroby • 2x více mutací v zárodečné linii muže než ženy Budoucnost • Transkriptomika – exprese genů, za různých podmínek • Proteomika – exprese a funkce proteinů, dopady pro design léčiv • Komparativní genomika – srovnání s jinými organizmy • Polymorfismus mezi jedinci (genetic variation program) • ELSI – (ethical, legal and social implications) – 10 mil $ /rok • Zdraví, společnost, vzdělávání …

17. Rozdíly mezi jedinci Comparative genomic hybridization (CGH)

18. Farmakogenomika Studuje, jak varianty v lidském genomu ovlivňují odpověď na léčbu. Umožní vytvářet léky „na míru“ podle znalosti konkrétního genomu pacienta. Minimalizují se tak nežádoucí vedlejší účinky.

19. Farmakogenomika a personální medicína Nyní Design léků na průměrného pacienta, masová výroba. Ale „jeden klobouk nesedí na každé hlavě“. Pomalá metabolizace (vedlejší účinky) x rychlá metabolizace (žádné účinky). Vedlejší účinky léků (adverse drug reactions, ADR): > 2mil případů, 100 000 úmrtí v USA (rok 1994).

20. Farmakogenomika a personální medicína Potom Farmakogenomika, test v dětství, dědičné varianty v genech určují reakci na léky. Single nucleotide polymorphism (SNP, snips) – genetické varianty, katalogizace, anotace, dbSNP, microarray data. DNA čipy – screening 200 000 SNPů/několik hodin (200$)  výběr léků. Levnější - klinické testy na menších skupinách, pacient se nevrací k lékaři pro další léky na vyzkoušení kvůli žádnému efektu nebo nežádoucím účinkům.

21. Etické otázky Léky na míru (tailor-made drugs) dražší, nezájem farmaceutických firem (menší objemy výroby). Neochota pojišťoven platit za lidi s genetickými testy indikující potřebu drahých léků na míru. Prohloubení propasti mezi rozvinutým a rozvojovým světem. Dostupnost všem?

22. DNA čipy (DNA chips, DNA microarrays) Pomocí DNA čipů lze určit, které varianty genů/sekvencí DNA člověk obsahuje a podle toho zacílit léčbu.

23. Genová terapie Genová terapie je rychle se rozvíjející obor medicíny, kdy jsou geny zaváděny do těla (genomu) jedince s cílem vyléčit nemoc. Dědičné nemoci • jeden gen (srpková anémie, barvoslepost) • polygenní (většina nemocí – diabetes, epilepsie, astma, maniodepresivní choroba, schizofrenie) • škodlivý gen recesivní (cystická fibróza), dominantní (Huntingtonova chorea), na chromosomu X (hemofilie)

24. Genová terapie PODMÍNKY ÚSPĚCHU - dobré pochopení problému, identifikace genu • metoda vnesení, typ buněk, vektor (viry), stabilní integrace • opravovány jen geny v somatických buňkách, nahrazen špatný gen nebo vnesen nový gen s funkcí vyléčit nemoc.

25. Možnosti genové terapie U velkého množství geneticky podmíněných chorob známe příčinu (tj. mutaci konkrétního genu - genů), ovšem tuto příčinu nejsme v současné době schopni vyléčit – neexistence kauzální terapie. Současná medicína nabízí mnoho možností symptomatické léčby, kdy se snažíme různými způsoby zlepšit průběh nemoci. Tato léčba však neléčí samotnou podstatu choroby, pacient je na této léčbě často závislý po celý život.

26. Symptomatická léčba zahrnuje Dodání chybějícího enzymu u enzymopatií. Dodání jiných chybějících látek (substrátů, proteinů...). Vyvarování se substrátu, který nelze správně metabolizovat (speciální diety). Chirurgické zákroky. Farmakologické ovlivnění narušených fyziologických procesů. Farmakologické zlepšení kvality života. Jiné ovlivnění fyziologických procesů nebo kvality života (přístroje, pomůcky). Transplantace chorobou poškozeného orgánu.

27. Během posledních let dochází k prudkému rozvoji molekulární biologie. Na přečtení lidského genomu navazují pokroky v proteomice a farmakogenomice. Nové znalosti umožňují nejen zlepšovat stávající léčebné postupy, ale dávají i naději do budoucna, kdy snad budeme schopni léčit přímo příčinu dědičných onemocnění. Genová terapie bude v budoucnosti možná léčit i většinu nádorových onemocnění.

28. Genová terapie vpravení genetické informace do buněk za účelem léčebného účinku. U některých pacientů byla již genová terapie úspěšně použita (jako první určité typy těžkých imunodeficitů), stále jde o experimenty, které s sebou mohou nést řadu vedlejších efektů.

29. Experiment (Cavazzana-Calvo, 2000): léčba imunodeficience způsobené mutací genu na chromosomu X, děti uzdraveny. ALE 2 z 10 dětí onemocněly leukémií, virový vektor aktivoval onkogen!!!

30. Podmínky pro zahájení genové terapie 1/ Musíme znát přesnou příčinu genetické choroby, tj. znát přesný gen/y, umístění, povahu produktu. 2/ Mechanizmus patologického účinku. Patologicky totiž může působit jak deficit normálního genového produktu, tak i pozměněný produkt mutovaného genu. 3/ Znalost přesné sekvence zdravého genu. Pro současnou experimentální genovou terapii jsou vybírány choroby, pro které jiná léčba neexistuje a které mají velmi těžký, často letální průběh.

31. Správná strategie genové terapie 1/ Pokud je patologický nedostatek genového produktu, stačí dodatečné zařazení nemutovaného genu kamkoliv do genomu příslušných buněk. 2/ Pokud patologicky působí pozměněný produkt mutovaného genu, je nutné buď opravit mutovaný gen, tj. pravá kauzální terapie - odstranění příčiny, nebo zablokovat tento gen (odstranění genu, zamezení transkripce...). S tím souvisí i zajištění fyziologické aktivity tohoto genu, tj. posílení nebo utlumení transkripce, je-li potřeba. 3/ Volba vhodného vektoru (nosiče) a vytipování cílových buněk genové terapie.

32. S ohledem na jistou kontroverznost této terapie je třeba provádět genovou terapii pouze pokud je úspěšně otestována a schválena k použití. K podstoupení experimentální terapie je vždy potřeba souhlas pacienta či jeho zákonného zástupce. Pro užití genové terapie budou v budoucnosti pravděpodobně přijaty zákonné i podzákonné normy.

33. Provedení genové terapie zahrnuje 1/ Vytvoření genetické informace metodami rekombinantní DNA, která je určená pro transport do buněk. 2/ Vytipování buněk, do kterých bude upravená genetická informace vnesena. Genová terapie se může provádět jak in vivo,kdy jsou cílové buňky po celou dobu součástí organismu, tak in vitro,kdy jsou cílové buňky z těla organismu nejprve odebrány a po provedení genové terapie opět vráceny na své místo v organismu.

34. Provedení genové terapie zahrnuje 3/ Výběr vhodného vektoru (nosiče), který bude použit pro vpravení genetické informace do cílových buněk. Řada možností - mechanické metody (mikrojehly), chemické či fyzikální metody (specifickým způsobem umožní průnik gen. informace cytoplazmatickou membránou), samotná DNA či DNA v komplexech s různými molekulami. V současnosti se však nejvíce využívá virových vektorů,zejména adenovirů a retrovirů, které mají schopnost inzerce své gen. informace do genomu hostitelské buňky. Do virových kapsid je zabudována terapeutická gen. informace, virová gen. inf. je odstraněna a virové vektory jsou aplikovány. Po provedení genové terapie je třeba pacientův stav pečlivě monitorovat a všímat si jak zlepšování zdravotního stavu, tak i nástupu případných komplikací.

35. Schéma provedení genové terapie s adenovirovým vektorem

36. Problémy (nevýhody) genové terapie Výhody genové terapie jsou nesporné. Existují však i stinné stránky této metody (současný stav, je snaha tyto negativa zmírnit či eliminovat). 1/ Velmi vysoká finanční náročnost takovéto terapie. 2/ Technická a technologická náročnost. 3/ Nízká úspěšnost terapie, pokud jsou problémy s "uchycením" vnášené genetické informace. 4/ Při použití virových vektorů je genetická informace do genomu vložena víceméně náhodně. Vnesený gen tak může narušit sekvenci jiného genu. Narušení protoonkogenu nebo tumor-supresorového genu může spustit maligní transformaci buňky! 5/ Genová terapie je eticky problematická.

37. Budoucnost Genová terapie by mohla nejen zachraňovat životy pacientům s těžkými genetickými chorobami či rakovinou. Mohla by zpříjemnit život mnoha dalším lidem, jejichž choroba sice není natolik závažná, ale stejně jsou odkázáni na podpůrnou terapii.

38. Budoucnost Bude však potřeba přesně vymezit hranici mezi tím, na co je ještě etické genovou terapii použít a na co již ne. Budou v budoucnosti "děti na objednávku"? Budeme si moc určit barvu očí, vlasů či výšku našich dětí? Pokud budeme umět vytvářet děti bez genetických chorob - nemohly by tyto děti být také fyzicky zdatnější? Dočkáme se éry superlidí?

39. Odpověď nám dá až budoucnost. Nesmíme dopustit, aby se z genové terapie stal takový obchod, jakým je dnes třeba plastická chirurgie. Vylepšení genomu na objednávku a jen pro majetné by bylo vyložené pošlapání současných nadějí.

40. DNA vakcinace DNA vakcinace je ochrana proti nemocem (viry, bakterie, paraziti) pomocí geneticky upravených molekul DNA s cílem vyvolat imunitní odpověď. Vakcíny První generace – oslabené formy celých organizmů. Druhá generace – definované proteinové antigeny (i rekombinantní). Třetí generace – upravené plasmidové DNA, které produkují specifické proteiny.

41. Metody vnášení DNA do organizmu Injekce do svalů nebo do kůže - trvalá nebo dlouhodobá exprese, rychlé rozšíření po těle, nevýhodou velké množství potřebné DNA (10μg-1mg) Genové dělo – bombardování buněk částicemi zlata nebo wolframu, stačí malé množství DNA (0.2-20μg), avšak potřeba inertní částice Tlaková injekce - několik mm pod kůži, větší množství DNA (300μg), bez částic, DNA se rozbíjí, nižší exprese a imunitní odpověď. Další metoda - nanesení aerosolu na sliznice. Množství vnášené DNA je 10x menší u myši než u primátů. Metoda má vliv na to, jaký typ buněk se aktivuje – T-buňky (TH1, TH2), T-killer, T-helper, protilátky.

42. Projekt „osobního genomu“ (personal genome project, PGP) Projekt osobního genomu • Sekvenace 100 000 dobrovolníků (1% genomu bohatou na geny) • Hledání korelace mezi genetickými a tělesnými vlastnostmi • Cílem cena do 1000 USD během několika let (faktory: čas, technologie, cena) • Axiomy: automatizace práce + otevřenost dat • Předpokladem je vývoj novějších technologií sekvenování: 454 Life Sciences, Solexa (Illumina), SOLiD (Applied Biosystems), aj. Aspekty osobní genomiky • Zdravotní hlediska • Rodokmen • Obavy ze zneužití (pojišťovny, zaměstnavatel, soudy, školy, agentury pro adopci, vláda, konkurence, zločinci)

43. ETICKÉ A PRÁVNÍ ASPEKTY SEKVENACE LIDSKÉHO GENOMU

44. Patentování genů Patentovatelný objev nebo nápad musí být umělý, ne zcela zřejmý, nový a užitečný. Nelze patentovat zákony přírody. 1790: „first patent act“ 1889: rostliny, i uměle pěstované jsou produktem přírody a nelze je tudíž patentovat (pokus patentovat vlákninu izolovanou z rostlin) 1930: lze patentovat nové odrůdy rostlin (kongres USA) 1948: spojování bakterií není objev, nelze patentovat (Nejvyšší soud USA) 1981: spor Diamond vs. Chakrabarty – umělá bakterie likvidující ropné skvrny - geneticky modifikovaná (fúze), nepřítomná v přírodě 1996: Bermudská pravidla – sekvence genomů musí být volně dostupné 2005: zamítnut návrh na patent na lidskou chiméru, aby zabránili tvorbě hybridů Patentovány geny, izolované úseky DNA samostatně neexistující v přírodě. 2005: přes 4 000 genů z ~24 000 je spojeno s patentem, např. firma Incyte vlastní 10% genů

45. Čtyři priority 1. Poctivost (fairness) – svoboda od diskriminace na bázi genotypu 2. Soukromí (privacy) – kontrola jedince nad svým genotypem, volba odhalení 3. Poskytování zdravotní péče 4. Vzdělání (education) Pojišťovny Nutnost rovné hry, stejné informace, spravedlivá smlouva. Proč by pojišťovny nemohly znát / měly znát ??? kromě fenotypových i genotypové parametry? Obava pojištěnce že bude pojišťovna chtít jeho testy a zdraží pojistné. Obava pojišťovny že se pojištěnec dozví o budoucí nemoci a vysoce se pojistí. Např. Huntingtonova chorea, znát počet CAG repetic, pojišťovací hra možná, změna s časem. Zaměstnavatelé Např. povolání s vysokými náklady na vyškolení, letový dispečer, pilot: - argument zaměstnavatele – chci znát riziko jeho infarktu, platím pojištění, bezpečnost - argument žadatele – nyní jsem zcela zdráv, nenesu vinu na predispozici.

46. Etické otázky související s PGP Neudržitelnost rasismu – větší diverzitra uvnitř skupin, než mezi skupinami - jedinečnost individua a universalita lidstva

47. Genový doping a „designed baby“ Dříve: Výběr vhodného partnera Nyní: Znalost lidského genomu + asistovaná reprodukce/PGD vliv na vlastnosti dětí

48. Co je možné Můžeme vybrat zdravá embrya? Můžeme vybrat pohlaví. Můžeme zlepšit vlastnosti dítěte (výšku, paměť)? Čím se liší plastická chirurgie od genové změny? Když investujeme do environmetálních faktorů (knihy, vzdělání, výchova), proč neinvestovat do genetických faktorů? Vznikne novodobá genetická aristokracie a třída genetických proletářů? Klasický doping u sportovců je zakázaný, a co genový doping? Jak prokázat? Budou rodiče odsuzování za narození postiženého dítěte? Genový doping jen pro nejbohatší? Vznik nového darwinismu?

49. DNA databáze FBI (Combined DNA Indexing System = CODIS) CODIS (1994 Kongres USA) - FBI databáze, obsahuje ~6 milionů vzorků DNA, přibývá až 40 000 každý měsíc, dříve jen u usvědčených zločinců, nyní širší záběr. Forenzní laboratoře v USA - genetický fingerprint usvědčených zločinců Ministerstvo obrany USA – vzorky tkání vojáků pro pozdější identifikaci pomocí DNA