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RECREANDO LA DIVERSIDAD EN EL TUBO DE ENSAYO

RECREANDO LA DIVERSIDAD EN EL TUBO DE ENSAYO. ESTRATEGIAS in vivo E in vitro PARA LA GENERACION DE DIVERSIDAD MOLECULAR. Problemática: 1. Necesidad de nuevas actividades 2. Métodos basados en la estructura: gran requerimiento.

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RECREANDO LA DIVERSIDAD EN EL TUBO DE ENSAYO

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Presentation Transcript

  1. RECREANDO LA DIVERSIDAD EN EL TUBO DE ENSAYO

  2. ESTRATEGIAS in vivo E in vitro PARA LA GENERACION DE DIVERSIDAD MOLECULAR Problemática: 1. Necesidad de nuevas actividades 2. Métodos basados en la estructura: gran requerimiento Mediante la evolución dirigida pretendemos mimetizar los procesos naturales de selección

  3. GENERACIÓN DE DIVERSIDAD Ventajas: 1. Empleo de elevado número de variantes 2. Posibilidad de resumir siglos de evolución en días 3. Amplio uso en biología molecular Inconvenientes: 1. Necesidad de un buen sistema de selección

  4. Materia origen Generación de diversidad Librería (población de individuos) Selección Individuos Análisis Identificación

  5. EL PROBLEMA DE LA DIVERSIDAD Repertorio natural de Ab 1012 Oligonucleótidos degenerados (8 aa´s) 208=2x1010 Electroporación E. coli 109/µg ADN Librería de phage display 108 Librería de ribosome display 1012 Librería combinatoriales >1012

  6. GENERACIÓN DE DIVERSIDAD 1. Mutagénesis química 2. Mutagénesis con cepas hipermutadoras 3. PCR 4. “DNA shuffling” 5. Phage display 6. Ribosomal display

  7. MUTAGÉNESIS QUÍMICA * Mutágeno: EMS, HA, ... * Supervivencia: 0,1-10% CEPAS HIPERMUTADORAS * E. coli XLI-red (mutD mutS mutT) PCR * Taq pol: error 1/10000 por ciclo * sales de manganeso * nucleótidos desbalanceados

  8. “DNA SHUFFLING”

  9. The structure of Fabs

  10. Antigen binding by CDRs in scFvs

  11. N H N H 2 2 V V L H Fab C C H 1 L S S - - C O O C O O V C Anchor-protein H H1 V C L L OM Fab P IM Expression of antibody fragments in E. coli

  12. N H 2 scFv V V L H - C O O V Anchor-protein V linker H L OM scFv P IM Expression of antibody fragments in E. coli

  13. Spleen B-cells Blood mRNA Hybridoma cDNA PCR Combinatorial synthesis Massive cloning of V-genes by PCR

  14. Assembly of V genes as scFvs VH fragments Linker VL fragments Homology driven amplification Not I Sfi I

  15. Assembly of V genes as scFvs

  16. Assembly of V genes as scFvs

  17. The filamentous phages: M13 life cycle

  18. The protein gp3 of M13phage

  19. scFv pIII VH VL Sfi I Not I gene 3 plac M13 ori ColE1 ori pCANTAB-5E Phagemid DNA bla pVIII coat (Apr) M13 phage Cloning of scFv genes into phagemids

  20. Phab library Binding Antigen ** ** Amplification Expression of scFv ** ** ** ** ** ** ** ** ** scFv-SELECTION MIMICS THE IMMUNE SYSTEM Elution Infect E. coli

  21. ARM (RIBOSOME) DISPLAY

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