第六章 微生物的新陈代谢
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第六章 微生物的新陈代谢. 代谢. 代谢 (metabolism) 是细胞内发生的各种化学反应的总称,它主要由分解代谢 (catabolism) 和合成代谢 (anabolism) 两个过程组成。 分解代谢:将大分子物质降解成小分子物质的过程。 合成代谢是:将简单的小分子物质合成复杂大分子的过程。. 分解代谢的作用. 提供前体化合物 提供细胞代谢活动所需的能量 生长:细胞结构物质合成 产物合成 维持:物质运输、运动、亚细胞结构形成、大分子周转等 提供还原力 NADH NADPH. 合成代谢. 由前体化合物合成大分子单体 由前体化合物合成产物

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第六章 微生物的新陈代谢


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代谢

  • 代谢(metabolism)是细胞内发生的各种化学反应的总称,它主要由分解代谢(catabolism)和合成代谢(anabolism)两个过程组成。

  • 分解代谢:将大分子物质降解成小分子物质的过程。

  • 合成代谢是:将简单的小分子物质合成复杂大分子的过程。


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分解代谢的作用

  • 提供前体化合物

  • 提供细胞代谢活动所需的能量

    • 生长:细胞结构物质合成

    • 产物合成

    • 维持:物质运输、运动、亚细胞结构形成、大分子周转等

  • 提供还原力

    • NADH

    • NADPH


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合成代谢

  • 由前体化合物合成大分子单体

  • 由前体化合物合成产物

  • 由单体形成大分子化合物

    • 蛋白

    • 核酸

    • 多糖

    • 脂肪


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分解代谢的三个阶段


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分解代谢的三个阶段

  • 第一阶段是将蛋白质、多糖及脂类等大分子营养物质降解成为氨基酸、单糖及脂肪酸等小分子物质;

  • 第二阶段是将第一阶段产物进一步降解成更为简单的乙酰辅酶A、丙酮酸以及能进入三羧酸循环的某些中间产物,在这个阶段会产生一些ATP、NADH及FADH2;

  • 第三阶段是通过三羧酸循环将第二阶段产物完全降解生成CO2,并产生ATP、NADH及FADH2。   第二和第三阶段产生的ATP、NADH及FADH2通过电子传递链被氧化,可产生大量的ATP。


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能量与代谢的关系


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还原态无机物

有机物

日光

通用能源ATP

能量代谢的中心任务


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第一节 化能异氧微生物的生物氧化和产能

形式:与氧结合,脱氢,失去电子

过程:脱氢(电子),递氢,受氢

功能:产能(ATP),产还原力([H]),产小

分子中间代谢物

类型:发酵,有氧呼吸,无氧呼吸


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  • 底物脱氢的4条途径

    • EMP途径

    • HMP途径

    • ED途径

    • TCA循环


Embden meyerhof parnas pathway

糖酵解途径Embden-Meyerhof-Parnas pathway


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功能

  • 提供ATP

  • 提供还原力(NADH2)

  • 提供前体化合物

    • 6-磷酸葡萄糖

    • 磷酸三碳糖

    • 磷酸烯醇式丙酮酸

    • 丙酮酸

      总反应:

      Glucose+2Pi+2ADP+2NAD+

      2Pyruvate+2ATP+2NADH+2H++2H2O


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HMP途径

  • 即单磷酸己糖途径(Hexose Monophosphate Pathway),也称戊糖磷酸途径(Pentose Phosphate Pathway)。

  • 分为氧化阶段和非氧化阶段

  • 功能:

    • 提供还原力(NADPH)

    • 提供前体化合物

      • 核糖磷酸(包括5-磷酸核糖-1-焦磷酸, PRPP)

      • 磷酸赤藓糖


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HMP途径

Glucose 6-phosphate + 2 NADP+ + H2O

→ ribulose 5-phosphate + 2 NADPH + 2 H+ + CO2


Nadph

磷酸戊糖途径提供NADPH的方式


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ED途径

Entner-Doudoroff pathway

Glucose + ADP +Pi +NAD + NADP  2Pyruvate + ATP + NADH2 + NADPH2


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TCA循环


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功能

  • 提供还原力:3 NADH2,1 FADH2

  • 提供能量:形成1 GTP

  • 提供前体化合物:

    • a-酮戊二酸

    • 琥珀酸

    • 草酰乙酸

      AcCoA+3NAD+FAD+GDP+Pi+2H2O

      2CO2+3NADH2+FADH2+GTP+CoA


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2. 烃的利用

  • 能分解烃类的微生物

    • 细菌:假单胞菌 分枝杆菌 棒状杆菌

    • 放线菌:链霉菌 诺卡氏菌

    • 酵母菌:假丝酵母

  • 应用

    • 奈被假单胞菌利用生成水杨酸

    • 丙烯腈生成丙烯酰胺

    • 石油脱蜡

    • 长链二元酸

    • 二次采油

    • 石油污染处理


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3. 呼吸

微生物在降解底物的过程中,将释放出的电子交给NAD(P)+、FAD或FMN等电子载体,再经电子传递系统传给外源电子受体,从而生成水或其他还原型产物并释放出能量的过程。

  • 有氧呼吸

  • 无氧呼吸


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1) 有氧呼吸

底物脱下的氢经过完整的呼吸链(电子传递链,Electron Transfer Chain-ETC)传递,最终被外源分子氧接受,产生水并释放出ATP形式的能量


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电子传递系统


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ATP的生成


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2) 无氧呼吸

  • 呼吸链末端的电子受体不是氧

  • 可作为电子受体的物质:

    • NO3-

    • NO2-

    • SO42-

    • CO2

  • 能量生成效率低于氧


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第二节 化能自养微生物的生物氧化

一些微生物可以从氧化无机物获得能量,同化合成细胞物质,这类细菌称为化能自养微生物。它们在无机能源氧化过程中通过氧化磷酸化产生ATP。

能源:

  • H2H2+½O2H2O

    G0’=-237.2kJ/mol

  • NH3

  • S

  • Fe


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氨的氧化

  • NH4++1½O2NO2-+2H++H2O

    G0’=-270.7kJ/mol

  • NO2-+½O2NO3-

    G0’=-77.4kJ/mol

  • NH3和NO2-是可以用作能源的最普通的无机氮化合物,能被硝化细菌所氧化,硝化细菌可分为两个亚群:亚硝化细菌和硝化细菌。

  • 氨氧化为硝酸的过程可分为两个阶段,先由亚硝化细菌将氨氧化为亚硝酸,再由硝化细菌将亚硝酸氧化为硝酸。由氨氧化为硝酸是通过这两类细菌依次进行的。


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  • 硝化细菌都是一些专性好氧的革兰氏阳性细菌,以分子氧为最终电子受体,且大多数是专性无机营养型。它们的细胞都具有复杂的膜内褶结构,这有利于增加细胞的代谢能力。硝化细菌无芽孢,多数为二分裂殖,生长缓慢,平均代时在10h以上,分布非常广泛。


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硫的氧化

  • S2-+2O2SO42-G0’=-794.5kJ/mol

  • S0+1½O2+H2OSO42-+2H+G0’=-584.9kJ/mol

  • 硫杆菌能够利用一种或多种还原态或部分还原态的硫化合物(包括硫化物、元素硫、硫代硫酸盐、多硫酸盐和亚硫酸盐)作能源。

  • H2S首先被氧化成元素硫,随之被硫氧化酶和细胞色素系统氧化成亚硫酸盐,放出的电子在传递过程中可以偶联产生四个ATP。

  • 亚硫酸盐的氧化可分为两条途径,一是直接氧化成SO42-的途径,由亚硫酸盐-细胞色素c还原酶和末端细胞色素系统催化,产生一个ATP;二是经磷酸腺苷硫酸的氧化途径,每氧化一分子SO32-产生2.5个ATP。-


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铁的氧化

  • Fe2++¼O2+H+Fe3++½O2 G0’=-44.4kJ/mol

  • 从亚铁到高铁状态的铁的氧化,对于少数细菌来说也是一种产能反应,但从这种氧化中只有少量的能量可以被利用。

  • 亚铁的氧化仅在嗜酸性的氧化亚铁硫杆菌(Thiobacillus ferrooxidans)中进行了较为详细的研究。在低pH环境中这种菌能利用亚铁氧化时放出的能量生长。

  • 在该菌的呼吸链中发现了一种含铜蛋白质(rusticyanin),它与几种细胞色素c和一种细胞色素a1氧化酶构成电子传递链。在电子传递到氧的过程中细胞质内有质子消耗,从而驱动ATP的合成。


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第四节 生物合成

  • 合成结构物质

    • 核酸

    • 蛋白

    • 多糖

    • 脂肪

  • 合成产物

  • 需要前体化合物、能量、还原力


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1. 光合作用

  • 光反应:叶绿素释放电子,产生ATP和NADPH2

  • 暗反应:通过卡尔文循环(Carvin cycle)将CO2转变为有机化合物

    • 固定CO2

    • 消耗大量ATP

    • 消耗大量还原力(NADPH2)


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  • ATP和NADPH2由光反应产生

  • 首先固定CO2:CO2与核酮糖1,5-二磷酸(RuBP)经核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶(Rubisco)作用形成2个3-磷酸甘油酸

  • 大部分3-磷酸甘油酸用于生成RuBP,少部分用于合成葡萄糖

  • 反应:

    6 CO2 + 12 NADPH + 12 H+ + 18 ATP → C6H12O6 + 6 H2O + 12 NADP+ + 18 ADP

    + 18 Pi


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2. 糖异生

  • 不是简单的酵解途径的逆转


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3. 固氮

  • 生物固氮反应的6个要素

  • ATP 的供应

  • 还原力及其传递载体

  • 固氮酶(nitrogenase)

  • 还原底物N2

  • 镁离子

  • 严格的厌氧环境


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  • 固氮酶

    • 2个固氮铁氧还蛋白(还原酶)

    • 1个钼铁氧还蛋白(固氮酶)

  • 固氮消耗大量能量

    N2+3H22NH3

    H=-91.2kJ


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固氮的生化机制

2H+

H2

铁氧化蛋白其他电子递体

e-

e-

e-

产能代谢

铁蛋白

钼铁蛋白

MgATP

MgADP+Pi

6H++N2

2NH3

N2+8[H]+18~24ATP 2NH3+H2+ 18~24ATP + 18~24Pi


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4. 细胞结构物质合成

  • 氨基酸

  • 核苷酸

  • 多糖

  • 脂肪


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应用


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0.5

20

0.4

16

)

u/L)

gh

(g/

0.3

12

5

(10

-1

D=0.352 h

A

Q

0.2

IFN

8

Q

0.294

0.1

4

0.148

0

0

0

0.2

0.4

0.6

0.8

0

1

2

3

4

5

-1

Acetate in Feed (g/L)

Dilution Rate (h )

1 发酵过程分析应用实例

  • 大肠杆菌高密度培养

    在葡萄糖为碳源的培养基中大肠杆菌会产生副产物乙酸,抑制生长和外源基因表达。发酵过程中维持葡萄糖限制的状态能有效避免乙酸的积累。

  • 控制碳源流加避免溢流代谢物积累


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碳源的流加

  • 恒溶氧

  • 恒pH


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(a) 恒溶氧流加

  • 原理

    随菌体浓度增加,耗氧速率(OUR)增加,在一定供氧条件下溶氧下降。碳源消耗引起耗氧速率降低和溶氧急速上升。限制葡萄糖流加可造成溶氧振荡,发酵液中浓度可维持在不能测出的低浓度,避免乙酸积累。


Pichia pastoris

Pichia pastoris表达血管生长抑制素

  • Pichia pastoris具有很强的醇氧化酶(AOX1)启动子

  • 外源基因插入并保持完整的AOX1显示Mut+表型,外源基因插入破坏AOX1显示MutS表型。

  • 发酵的生长阶段以甘油为碳源,表达阶段以甲醇为碳源。

  • 表达血管生长抑制素的P. pastoris为MutS,甲醇利用能力很差。


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100

80

60

Dissolved oxygen (%)

40

20

0

46

56

66

76

86

96

Time (h)

Dissolved oxygen profile during the induction phase with automatic feeding of methanol


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Dissolved oxygen, pH, temperature and agitation profilesin the fed-batch culture. Fermentation control software (Tophawks) was kindly provided by the National Center of Biochemical Engineering (Shanghai)


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(b) 恒pH流加

  • 复合培养基中碳源消耗后,氨基酸异化代谢引起pH上升,加入碳源pH下降。

  • 大肠杆菌表达hEGF由phoA启动子控制。


Do ph

DO变化与pH变化的关联


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2 菌株特性研究

  • 大肠杆菌DH5a在基本培养基中生长差,产生乙酸多,不利外源基因表达

  • DA19是DH5a的突变株,在同样培养基中产生乙酸少,菌体生长多,外源基因表达高


Growth of dh5 a and da19 on different carbon sources preculture was carried out in a complex medium

Growth of DH5a and DA19 on different carbon sourcesPreculture was carried out in a complex medium


Distribution of utilized glucose when cuoltured in the m medium

Distribution of utilized glucose when cuoltured in the M medium

Flux limitation in TCA cycle or electron transfer chain in DH5a.


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3 代谢流分布研究

  • 建立代谢网络

  • 根据化学计量关系,建立物料平衡方程

  • 稳态下

    Ar =b


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Phe

Ala

Glycogen

Phospholipids

Acetate

Try

Val

1.6 (1.3)

Fatty Acids

Tyr

Leu

1.2 (1.0)

21 (25)

0.4 (0.3)

8.9 (7.4)

2.2 (1.8)

Leu

86 (92)

83 (92)

71 (79)

41 (48)

5.0 (4.2)

82 (88)

66 (90)

100 (100)

PEP

Pyr

AcCoA

3PG

Glucose

Met

F6P

T3P

G6P

21 (24)

9 (7)

4.5 (3.7)

15 (19)

Arg

CO

Cys

CO

2

2

Cys

3 (2)

10 (2)

Ser

28 (36)

E4P

Gly

5 (1)

6 (0)

UTP

ATP

CO

28 (8)

IsoCit

2

CTP

OAA

GTP

7.6 (6.3)

Asp

36 (46)

Xyl5P

Asn

25 (34)

14 (2)

7 (9)

Lys

CO

Ribu5P

2

CO

a

KG

5 (7)

16 (4)

2

Thr

13 (6)

Ile

5.3 (4.4)

S7P

R5P

Met

Glu

5.2 (4.3)

His

Gln

ATP

Pro

CTP

Arg

UTP

GTP

大肠杆菌代谢流分布

Carbon flux distributions in E. coli JM101 (in parentheses) and the mutant, JL3, at the same specific growth rate of 0.625h-1.


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4 代谢流控制

(a) 1,3丙二醇合成

  • 生产菌株:Klebsiella pneumoniae, Citrobacter freundii, Clostridium butyricum等

  • 厌氧发酵,或微好氧发酵

  • 原料:甘油

  • 副产物:乙酸,乙醇,乳酸,琥珀酸,甲酸,丁酸等

  • 代谢工程:以葡萄糖为碳源


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合成途径

1mol甘油形成二羟丙酮时产生的NADH可提供1mol甘油形成1,3丙二醇,得率1:2

1mol甘油形成丙酮酸产生的NADH可提供2mol甘油形成1,3丙二醇,得率2:3

1mol甘油形成乙酸产生的NADH可提供3mol甘油形成1,3丙二醇,得率3:4


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(b) 核糖


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(c) 头霉素


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Growth (A) and antibiotic production (B) of LHM100 () and the wt (). Five hundred-milliliter cultures were grown in 2-liter baffled shake flasks with seed medium at 30°C and 250 rpm. The antibiotic concentration was determined by HPLC and expressed as the sum of O-carbamoyl deacetylcephalosporin C and cephamycin C.


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(d) 琥珀酸

  • 厌氧发酵


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  • 好氧发酵

  • 使用棒杆菌

  • 生产速率高


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