Download
1 / 14
150 likes | 409 Views
Oxidativní stres organismu. Volné radikály a reaktivní formy kyslíku a dusíku v organismu Vznik - fyziologické procesy - dýchací řetězec - oxidační deaminace aminokyselin - syntéza prostaglandinů - signální transdukce v buňce - patologické procesy
E N D
Oxidativní stres organismu Volné radikály a reaktivní formy kyslíku a dusíku v organismu Vznik - fyziologické procesy - dýchací řetězec - oxidační deaminace aminokyselin - syntéza prostaglandinů - signální transdukce v buňce - patologické procesy - detoxikace xenobiotik - zánětlivé reakce – oxidační vzplanutí fagocytů - stárnutí organismu Tato prezentace je spolufinancována Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky.
Oxidativní stres organismu • Radikály - superoxidový anion (superoxid) •O2- - hydroxylový radikál •OH - peroxidový radikál •ROO - alkoxylový radikál •RO - hydroperoxidový radikál •HO2 - oxid dusnatý •NO - oxid dusičitý •NO2 Tato prezentace je spolufinancována Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky.
Oxidativní stres organismu Reaktivní formy kyslíku a dusíku - peroxid vodíku H2O2 - singletový kyslík 1O2 - kyselina chlorná HClO - ozon O3 - kyselina dusitá HNO2 - oxid dusičný N2O5 - oxid dusitý N2O3 - peroxynitrit ONOO- - nitronium NO2+ - nitrosyl NO + - nitroxid NO- - alkylperoxynitrit ROONO Tato prezentace je spolufinancována Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky.
Oxidativní stres organismu Nadprodukce volných radikálů a reaktivních forem kyslíku a dusíku - oxidační stres oxidační poškození biomolekul - lipidy - peroxidace nenasycených mastných kyselin lipoperoxidace lipidů biologických membrán (změna vlastností/stárnutí buňky/destrukce) vznik toxických produktů (malondialdehyd) malondialdehyd vyvolává crosslinking a polymeraci proteinů a bází DNA - proteiny - oxidace SH skupin aminokyselin se změnou struktury, vznik disulfidových vazeb a scrosslinků - DNA, RNA - oxidace purinových, pyrimidinových bází - kancerogeneze Tato prezentace je spolufinancována Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky.
Oxidativní stres organismu Antioxidační ochrana organismu Antioxidační enzymy superoxiddismutáza glutationperoxidáza glutationtransferáza kataláza Laktoperoxidáza Tato prezentace je spolufinancována Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky.
Oxidativní stres organismu Antioxidační ochrana organismu Antioxidační substráty tokoferol – vitamín E, karotenoid – vitamín A koenzym Q – ubichinon kyselina askorbová – vitamín C glutation cystein kyselina močová bilirubin albumin ceruloplasmin transferin laktoferin metalotionein melatonin kyselina lipoová flavonoidy selen zinek Tato prezentace je spolufinancována Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky.
Oxidativní stres organismu Antioxidační ochrana organismu Syntetické antioxidanty N-acetylcystein penicilamin allopurinol Tato prezentace je spolufinancována Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky.
Oxidativní stres organismu Onemocnění provázená nebo vyvolaná tvorbou volných radikálů - stárnutí - cukrovka - nádorové nemoci - autoimunitní nemoci - intoxikace - nemoc z ozáření - glomerulonefritida - urémie - hepatitida - malárie - svalové dystrofie - ateroskleróza Tato prezentace je spolufinancována Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky.
Oxidativní stres organismu Souprava ke stanovení lipidních hydroperoxidů Kvantifikace lipidní peroxidace slouží k hodnocení podílu oxidativního poškození na patogenezi různých onemocnění a poruch. Lipidní peroxidace vede k tvorbě vysoce reaktivních a nestabilních hydroperoxidů z nasycených i nenasycených tuků. Tradičně je lipidní peroxidace kvantifikována měřením malondialdehydu (MDA) a 4-hydroxynonenalu (4-HNE), což jsou degradační produkty hydroperoxidů polynenasycených mastných kyselin (PUFA). Tyto aldehydy se stanovují s využitím citlivých kolorimetrických metod. Ty však jsou nespecifické a často vedou k nadhodnocení úrovně lipidní peroxidace. Tvorba těchto metabolitů závisí i na koncentraci kovových iontů ve vyšetřovaném vzorku. MDA se tvoří také v důsledku aktivity destičkového enzymu thromboxan syntetáza při srážení plné krve a aktivizaci destiček. V závislosti na použité metodě se odhady koncentrace lipidních hydroperoxidů pohybují v rozmezí 0,3-30 µM. Normální koncentrace lipidních hydroperoxidů v krevní plasmě člověka je 0,5 µM. Tato prezentace je spolufinancována Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky.
Oxidativní stres organismu Souprava ke stanovení lipidních hydroperoxidů Princip přímého měření hydroperoxidů Využívá redoxních reakcí s ionty železnatými. Hydroperoxidy jsou vysoce nestabilní a ochotně reagují s železnatými ionty. Vzniklé železité ionty jsou pak detekovány s použitím thiokyanátu jako chromogenu. ROOH+Fe2+ → RO• + Fe3+ RO• + Fe2+ + H+ → ROH + Fe3+ Fe3+ + 5SCN- → Fe(SCN)52- Tato prezentace je spolufinancována Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky.
Oxidativní stres organismu Souprava ke stanovení lipidních hydroperoxidů Reagencie a jejich příprava 1) FTS reagens 1 (obsahuje 4,5mM sulfát železnatý v 0,2 M kyselině chlorovodíkové). 2) FTS reagens 2 (obsahuje 3% methanolický roztok thiokyanátu amonného). 3) Standard lipidních hydroperoxidů (50 µM etanolického roztoku 13-HpODE (13-hydroperoxy octadecadienoic acid). Skladováno při -80°C. 4) Extrakt R v krystalické formě. Připraví se nasycený roztok extraktu R. Odváží se 100mg do zkumavky, přidá se 15ml metanolu a na cca 2min se vloží na třepačku. V metanolu vznikne zákal. Takto připravený nasycený roztok je třeba spotřebovat do 2 hodin. 5) Rozpouštědlo vzniklé smísením dvou objemových dílů chloroformu a jednoho dílu metanolu. Před tím je třeba obě složky deoxygenovat (30 minut probublávání dusíkem). Rozpouštědlo se drží na ledu. Tato prezentace je spolufinancována Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky.
Oxidativní stres organismu Souprava ke stanovení lipidních hydroperoxidů Vzorek a jeho příprava Pro měření je vhodný jakýkoliv vzorek obsahující lipidní hydroperoxidy (tkáně, buněčné kultury, rostlinný materiál, potraviny, biologické tekutiny, plasma). 1) Homogenizace vzorku ve vodě HPLC čistoty. 2) Extrakce lipidních hydroperoxidů (extrahované vzorky lze skladovat při -80°C po dobu 1 měsíce. 500 µl vzorku (plasmy) se přenese do skleněné zkumavky Přidá se stejný objem extraktu R v metanolu a vloží se na třepačku. Přidá se 1ml chlazeného rozpouštědla (chloroform a metanol) a znovu se vloží na třepačku. Na pět minut se vloží do odstředivky (1500x g). Odsaje se spodní chloroformová vrstva. Ta se přenese do další zkumavky a uchovává na ledě. Tato prezentace je spolufinancována Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky.
Oxidativní stres organismu Souprava ke stanovení lipidních hydroperoxidů Měření vzorku 500 µl chloroformového extraktu se vloží do zkumavky Doplní se 450 µl rozpouštědla chloroform-metanol Připraví se chromogen (smísí se stejné objemy FTS regentu 1 a 2 a vloží na třepačku). 50 µl čerstvě připraveného chromogenu se přidá k měřenému vzorku a protřepe na třepačce. Pět minut se vzorek inkubuje při pokojové teplotě. Změří se absorbance při 500 nm. Rozpouštědlo chloroform-metanol se použije jako blank. Tato prezentace je spolufinancována Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky.
Oxidativní stres organismu Souprava ke stanovení lipidních hydroperoxidů Měření vzorku Stejné měření se provede s dodanými standardy a sestrojí se křivka závislosti absorbance na koncentraci lipidních hydroperoxidů. Lineární regrese této závislosti se použije k výpočtu hodnot lipidních hydroperoxidů v měřeném vzorku. Tato prezentace je spolufinancována Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky.
