血清脂类测定
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血清脂类测定. 浙江中医药大学 生命科学学院 生物化学教研室. 【 实验目的 】 学习血清甘油三酯的测定原理。 掌握甘油三酯的测定方法和操作技术。. 【 实验原理 】

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血清脂类测定

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Presentation Transcript


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血清脂类测定

浙江中医药大学

生命科学学院

生物化学教研室


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【实验目的】

学习血清甘油三酯的测定原理。

掌握甘油三酯的测定方法和操作技术。


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【实验原理】

血清中甘油三酯经脂蛋白脂酶(LPL)作用,可以水解为甘油和游离脂肪酸(FFA),甘油在ATP和甘油激酶(GK)的作用下,生成3-磷酸甘油,再经磷酸甘油氧化酶(GP0)作用氧化生成磷酸二羟丙酮和过氧化氢(H202), H202与4-氨基安替比林(4-AAP)及4-氯酚在过氧化物酶(POD)作用下,生成红色醌类化合物,其显色程度与TG的浓度成正比。


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【实验原理】

脂蛋白脂酶(LPL)

①甘油三酯 甘油+游离脂肪酸

甘油激酶

②甘油+ATP 3一磷酸甘油

磷酸甘油氧化酶

③3-磷酸甘油 磷酸二羟丙酮+过氧化氢

过氧化物酶

④H202+4-氨基安替比林+4-氯酚 红色醌

(苯醌亚胺非那腙)


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【试剂与器材】

  • 1. 甘油三酯测定试剂盒

  • 2.血清

  • 3.酶标仪,酶标板,板条,微量进样器

  • 4.生化培养箱


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【操作步骤】

1.配制工作试剂:

取R1:R2=9:1 (2.7:0.3) 的比例配制工作试剂,置于玻璃试管或小烧杯中(比需要的总量多配一点,可以几组合作一起配制,减少浪费)。


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【操作步骤】

2.取酶标板1块,板条1条,按下表操作:

空白管 标准管 测定管 测定管

A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7

血清 一 一 — 6μl 6μl 6μl 6μl

标准液 一 6μl 6μl ————

生理盐水 6μl 一 一 ————

工作试剂 300μl 300μl 300μl 300μl 300μl 300μl 300μl

3.置于37℃生化培养箱10min,492nm波长处在酶标仪上读取各管的吸光度A。


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结果与计算

血清甘油三酯=

测定管吸光度平均值

×

标准物浓度

标准管吸光度平均值

(mmol/L)

(mmol/L )

甘油三酯标准物浓度为2.26m mol/L


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【结果与计算】

甘油三酯:

TG正常范围:0.55-1.70mmol/L

边缘增高:1.7-2.25mmol/L

增高:2.26-5.64mmol/L

很高:大于、等于5.65mmol/L。


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【临床意义】

血清TG增高常见于家族性脂类代谢紊乱、肾病综合征、糖尿病、甲状腺功能减退、急性胰腺炎、糖原积累病、胆道梗阻、原发性甘油三酯增高症、动脉粥样硬化等。

血清TG降低比较少见,慢性阻塞性肺疾患、脑梗死、甲状腺功能亢进、营养不良和消化吸收不良综合征等可引起血清TG的降低。


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【注意事项】

1.本方法没有进行抽提和吸附,所以血清中游离的甘油对TG测定结果有一定的影响。

2.方法中所用酶试剂在4℃避光保存,至少可稳定3天至1周,出现红色时不可再用,试剂空白的吸光度应<0.050。


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3.取血注意事项:

要求空腹12h后再进行采血,并要求72h内不饮酒,否则会使检测结果偏高。无论是使用血浆还是使用血清作为检测标本,取血后都应及时分离,以免红细胞膜磷脂在磷脂酶的作用下产生游离甘油(FG),或者抗凝剂存在时红细胞内水溢出而稀释血浆降低TG值。分离血浆前,标本最好放于冰水中,并尽快分离血浆,避免TG自发水解出现误差。

4.本实验方法的线性上限为11.3mmol/L,若所测TG值超过了11.0mmol/L,则可用生理盐水稀释后再测。


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【评价】

本实验介绍的是一步终点法,具有简便、快速、微量且试剂较稳定等优点,适用于手工和自动化测定;其主要缺点是所测TG值包括了血清中游离的甘油。为了除去游离的甘油(FG)的干扰,常用的方法有两种:

1.外空白法 即同时使用不含LPL的酶试剂测定FG作空白值,此法需作双份测定,使成本加倍,但是可同时得到血清中FG数据;


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2.内空白法 又称为两步法或双试剂法,将酶试剂分作两部分,其中LPL和4—AAP组成试剂II,其余部分为试剂I,血清先加试剂I,37℃孵育后,因无LPL存在,TG不被水解,FG在GK和GPO的作用下反应生成H2O2,但因不含4-AAP,不能完成显色反应, H2O2可在过氧化物酶作用下被分解掉,故可除去FG的干扰;再加入试剂II,即可测出TG水解生成的甘油。内空白法虽然增加了操作步骤,但不增加试剂成本,且排除FG干扰效果好,预孵育5min即可排除4mmol/L FG的干扰。本法线性范围在11.4mmol/L以内,精密度为:批内CV≤3%、批间CV≤5%。加入不同浓度TG,平均回收率98.6%,加入甘油的平均回收率103.6%。与乙酰丙酮法比较:y=0.996x—4.2,r=0.9996。

因为LPL除水解TG外,亦能水解甘油一酯和甘油二酯(血清中这二者的浓度约占TG的3%),所以本法测定结果包含了后二者的值。


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【注意事项】

1在实验操作过程中,配制工作试剂时要格外小心,看清标注以免搞错

2.使用微刃进样器前,应先润洗,以免影响实验结果

3.每次加样完成后,迅速将其混匀,使其充分反应

4.测定血清甘油三酯,由于酶进行提取和吸附,血清中难免会由游离甘油(FG),对实验测定结果会有一定的影响


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【思考题】

1、简述酶法测定甘油三酯的基本原理。

2、检测血清甘油三酯时如何除去游离甘油的干扰?


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