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弥漫性大 B 细胞淋巴瘤中 PI3K/AKT 信号通路抑制对肿瘤细胞生长及化疗敏感性影响的体内外研究

弥漫性大 B 细胞淋巴瘤中 PI3K/AKT 信号通路抑制对肿瘤细胞生长及化疗敏感性影响的体内外研究. 于宝华，周晓燕，施达仁 复旦大学附属肿瘤医院病理科. 研究背景. 弥漫性大 B 细胞淋巴瘤（ DLBCL ） 最常见的 NHL 异质性的肿瘤. Institutional cases of FUCH (2006~2007, total case number 789). PI3K/AKT/mTOR 信号通路. 乳腺癌、 卵巢癌、 DLBCL?. 研究内容. 体外研究. Western Blot 法.

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弥漫性大 B 细胞淋巴瘤中 PI3K/AKT 信号通路抑制对肿瘤细胞生长及化疗敏感性影响的体内外研究

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  1. 弥漫性大B细胞淋巴瘤中PI3K/AKT信号通路抑制对肿瘤细胞生长及化疗敏感性影响的体内外研究弥漫性大B细胞淋巴瘤中PI3K/AKT信号通路抑制对肿瘤细胞生长及化疗敏感性影响的体内外研究 于宝华，周晓燕，施达仁复旦大学附属肿瘤医院病理科

  2. 研究背景 弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL） • 最常见的NHL • 异质性的肿瘤 Institutional cases of FUCH (2006~2007, total case number 789)

  3. PI3K/AKT/mTOR信号通路 乳腺癌、 卵巢癌、 DLBCL?

  4. 研究内容 体外研究 Western Blot 法 DLBCL细胞株中AKT活化状态 用LY294002分别 作用于3株细胞 观察pAKT水平的改变及 细胞生物学行为的改变 LY294002、DOX、 两者联合及序贯 作用于细胞株 检测干扰后细胞凋亡等的变化

  5. 体内研究 用LY8细胞株建立皮下移植瘤裸鼠模型 腹腔注射LY294002、DOX、 LY294002+DOX 腹腔注射不同剂量LY294002和对照 观察不同浓度LY294002对肿瘤生长的抑制作用； Western blot方法检测pAKT和AKT蛋白表达 同前观察不同用药组肿瘤生长的 抑制情况

  6. 材料与方法 • 细胞及动物 • 人DLBCL来源的LY1、LY8、LY10细胞株 • BALB/c裸鼠 • 统计分析 —— 采用SPSS11.5软件进行统计学分析。 多样本计量资料比较：单因素方差分析。

  7. 10％FBS Serum-Free Ly1 ly8 ly10 ly1 ly8 ly10 pAKT（ser473） AKT GAPDH 结 果-体外 Western blotting显示DLBCL细胞株ly1、ly8和ly10中Akt和pAkt状态 DMSO 10 20 30 50 100 DMSO 10 20 30 50 100 DMSO 10 20 30 50 100μΜ pAKT (ser473) AKT GAPDH a bc 不同浓度LY294002作用1h对DLBCL细胞株中pAkt的抑制作用

  8. 结 果- 体外 三株细胞在LY294002作用48h后细胞周期分布变化及 不同时间点S期抑制作用分析

  9. LY294002 、Doxo 、Doxo+ LY294002及两者序贯使用后 流式细胞分析不同时间三株细胞中凋亡细胞比例变化分析

  10. D34： 肿瘤长至 10×10mm D14左右（D10-20）： 接种部位皮下有肿瘤长出。 细胞株接种 D21左右： 见有肿瘤长出， 约5×6mm， 扁平质软 结 果- 建模 1．皮下移植瘤模型的建立 无 菌 套 管 针 法 鼠 间 种 植 截至传至第9代时共移植裸鼠124只，成瘤率约91.1%。

  11. 结 果- 建模 2．移植瘤生长特点 第8代移植瘤生长曲线 第1代至第8代生长曲线均类似 A、B、C分别为第8代裸鼠 接种后第19、26、34天。

  12. 结 果- 建模 3．大体观察 第8代荷瘤鼠接种后28天 肿瘤直径约2cm；切面示灰白灰红，鱼肉状，质地软，可见坏死。

  13. LY294002对皮下移植瘤生长的影响 • 动物分组与干预 30只荷瘤鼠（200-400mm3 ）随机分为3组： 对照组、低剂量LY294002组（0.1mg/kg）、高剂量LY294002组（0.5 mg/kg）每天给药，共连续10天。 • 实验观察 • 移植瘤体积（体积＝1/2ab2）：每周3次 • 质量抑瘤率和体积抑瘤率 • IHC检测Ki67表达； 细胞增殖指数（PI）：运用Motic Images Advanced 3.2 软件对Ki67的阳性范围进行分析 • 蛋白质提取，Western Blot检测pAKT表达

  14. 结 果-抑瘤 1．LY294002对肿瘤生长的影响 移植瘤在用药起始第6天时几乎消失。

  15. 结 果-抑瘤 2.1 生长曲线

  16. 结 果-抑瘤 • 体积抑瘤率和质量抑瘤率 质量抑瘤率：8.67% 45.83% p>0.05p=0.004 体积抑瘤率： 17.40% 50.14% p=0.076p<0.001

  17. 结 果-抑瘤 2.2 LY294002对AKT活化的影响 总AKT表达水平：基本一致; pAKT表达水平：高剂量组和低剂量组与对照组相比均显 著降低，高剂量组尤为显著。

  18. 结 果-抑瘤 2.3 LY294002作用后肿瘤形态学改变 对照组 低剂量组 高剂量组 各处理组给药后HE形态学表现 （×400）

  19. 结 果-抑瘤 2.4 LY294002对细胞增殖活性的影响 移植瘤组织中Ki67阳性范围比较

  20. LY294002与DOX联合对移植瘤生长的影响 • 动物分组与干预 40只荷瘤鼠（200-400mm3），随机分为4组： 单用LY294002（0.5mg/kg）组、单用DOX（5.0 mg/kg）组、 LY294002（0.5mg/kg）与DOX（5.0 mg/kg）联合用药组、对照组 LY294002: 腹腔注射;每日给药,连续10天; DOX: 尾静脉注射; 处理起始第1天和第3天给药。 • 实验观察（同前）。

  21. 结 果-联合 1．不同处理组荷瘤鼠的生长曲线 • LY294002+DOX联合组：D3即显示出对肿瘤生长的明显抑制效果（p=0.046），总体呈时间依赖性。 • 单用LY294002 组（p=0.02）和单用DOX组（p=0.003）:D6开始显示出对肿瘤生长的抑制效果。

  22. 结 果-联合 • 体积抑瘤率和质量抑瘤率

  23. 结 果-联合 2．肿瘤形态学的改变 对照 LY294002 LY+DOX DOX

  24. 结 果-联合 3. 细胞增殖活性的影响 对照 LY294002 LY+DOX DOX 移植瘤组织中Ki67阳性范围比较

  25. 结 果-联合 3．细胞增殖活性的影响 LY294002+DOX组Ki67阳性率显著低于任一药物单用组。

  26. 总 结 • 3株DLBCL细胞株均有pAKT表达，PI3K特异性抑制剂LY294002能快速有效地抑制DLBCL细胞中AKT磷酸化水平，表明AKT的组成性活化可能在DLBCL发生发展中起重要作用。

  27. 体外研究显示，LY294002虽然不能诱导细胞凋亡，但LY294002预处理后使用阿霉素的方案显著提高了肿瘤细胞对阿霉素诱导凋亡的敏感性。 • 体内研究显示，LY294002 联合DOX组荷瘤鼠较早地出现了对肿瘤生长的明显抑制，肿瘤体积抑瘤率和质量抑瘤率均显著优于任一药物单用组。 • 因此，PI3K抑制剂LY294002可能是一潜在具有较好的DLBCL化疗增敏作用的分子靶向药物。

  28. Thanks for your attention!

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