CNS: Crystallography and NMR System.

1. CNS: Crystallography and NMR System. CNS es un paquete de software de determinación de estructuras a partir de datos de cristalografía de rayos X o restricciones de RMN. La determinación de estructuras de RMN se basa en simulated annealing restringido por restricciones basadas en NOEs, constantes de acoplamiento, puentes de hidrógeno, desplazamientos químicos, etc. El software es de distribución libre y se puede descargar de: http://cns.csb.yale.edu Funciona en Linux, Silicon Graphics, Unix y Windows NT. Nosotros disponemos de la versión Windows NT. Es un software interprete que utiliza ficheros de comandos (scripts) de entrada (inputs) y genera ficheros de texto como salida. -El paquete de software incluye scripts de entrada de muestra para realizar cualquier tarea que se pueden adaptar fácilmente a nuestro problema. -Además, dentro de la página web se puede editar y generar cualquier script de entrada para las diferentes tareas.

2. Instalación de CNS La versión 1.1 precompilada de Windows NT viene en un fichero comprimido (Zip) autoextraible: • Pasos de instalación: • Extraer en el directorio raiz del disco duro: C:\ • Entrar en la carpeta: C:\cns_solve_1.1\windows-nt • Editar el fichero de comandos: cns_solve_env.bat . La línea de texto siguiente debe especificar el directorio donde se encuentra el programa.

3. Ejecutando CNS • El programa CNS se ejecuta desde una ventana de comandos de DOS. • Pasos para ejecución: • Abrir una ventana de comandos del sistema. • Programas -> Accesorios -> Símbolo del sistema • 2. Cambiar al directorio o carpeta C:\cns_solve_1.1\windows-nt • cd c:\cns_solve_1.1\windows-nt [Entrar] • 3. Ejecutar cns_solve_env.bat • cns_solve_env [Entrar] • Esto establece unas variables de entorno para la correcta ejecución del programa. El programa cns_solve.exe es el interprete de los scripts de comandos. • 4. Para ejecutar cualquier tarea la sintaxis es: • cns_solve < input.inp > output.out [Entrar] • Input.inp es el script de entrada para cada tarea específica. • Output.out es u fichero de texto de salida donde aparece toda la información sobre la ejecución de la tarea. Si se omite, toda la información aparecerá en la pantalla.

4. Documentación y scripts de muestra de CNS El programa contiene documentación en formato html, que está también accesible en la página web. Contenido de la carpeta c:\cns_solve_1.1 • - Doc contiene la documentación del programa. • Inputs contiene una serie de scripts de entrada de muestra. Son ficheros de texto que se pueden editar con un editor como WORDPAD. Los scripts de RMN están dentro de la carpeta inputs\nmr_calc

5. Página web de CNS CNS tiene una página web con documentación, tutoriales y ayuda para redactar los scripts de entrada. http://cns.csb.yale.edu

6. Preparando scripts de CNS Dentro del menú Inputs es posible editar scripts para cualquier tarea La sección Structure Calc incluye una serie de scripts específicos de RMN. Con estos botones se puede editar el script. Proporciona ayuda (poca)

7. Preparando scripts de CNS Se introducen los diferentes ficheros de entrada. Se pueden modificar los parámetros del simulated annealing y la minimización de energía Finalmente de descarga el script a nuestro ordenador

8. Primer paso: Generar el fichero de topología de la molécula • CNS tiene scripts para generar la información sobre la topología y una estructura de partida de la molécula cuya estructura vamos a determinar. El fichero con la topología incluye los átomos que componen la molécula, las conectividades (enlaces covalentes), los ángulos de enlace y otra información. Todo esto se almacena en un fichero con extensión MTF. • Pasos para generar la topología de nuestro péptido problema “twenty”: • Crear una carpeta de trabajo: c:\cns_solve_1.1\twenty • Copiar el fichero twenty_seq.txt en la carpeta de trabajo (contiene la secuencia del péptido) • Copiar el fichero generate_seq.inp (script). Editarlo para cambiar los ficheros de entrada y de salida. Activar la opción de retener hidrógenos (necesario para RMN). Poner como fichero de salida twenty.mtf. Salvar el script. • 4.Ejecutar cns_solve < generate_seq.inp> generate_seq.out [Entrar] • Esta acción genera el fichero twenty.mtf que contiene la información de la topología del péptido.

9. 2º paso: Generar una estructura extendida de la molécula • A partir de la información sobre la topología CNS genera una estructura extendida de partida de la molécula. CNS utiliza una geometría modelo para los ángulos y distancias de enlace. • Pasos para generar la estructura extendida de nuestro péptido problema “twenty”: • Copiar el fichero generate_extended.inp en la carpeta de trabajo y editarlo para cambiar el fichero de entrada y salida. • Ejecutar cns_solve < generate_extended.inp > generate_extended.out [Entrar] • Esta acción genera el fichero twenty_extended.pdb que contiene una conformación extendida al azar de la que partirá CNS para determinar la estructura. • Visualizar la estructura con el programa SwissPDBviewer.

10. Conformación extendida de “twenty”

11. 3er paso: Las restricciones de RMN (NOEs) El conjunto de las restricciones de distancias que se determinan de los NOEs deben tabularse en un fichero, con un formato que CNS acepte. Las restricciones de distancias tienen la sintaxis siguiente: assign (resid 4 and name HN) (resid 4 and name HA) 2.5 0.7 0.4 assign (resid 4 and name HA) (resid 4 and name HG2#) 3.0 1.2 1.2 assign (resid 4 and name HG2#) (resid 5 and name HN) 4.0 2.2 1.5 El símbolo # indica la definición de un pseudoátomo, en este caso entre los tres hidrógenos metílicos del residuo treonina 4 (HG21, HG22 y HG23). Los números al final indican la distancia media de la restricción y la desviación máxima inferior y superior admitida, según sea un NOE fuerte, medio o débil Todas las restricciones se salvan en el fichero twenty_noe_all.tbl CNS admite también ficheros de restricciones de: puentes de hidrógeno, constantes de acoplamiento, desplazamientos químicos, etc.

12. 4º paso: Simulated annealing • CNS realiza el proceso de simulated annealing restringido por las restricciones para la determinación de un conjunto (ensemble) de estructuras. • El script que lleva a cabo el proceso es anneal.inp. Hay que copiarlo en la carpeta de trabajo y editarlo para incluir los nombres de los ficheros de entrada y de salida. • Este script utiliza como entradas: • El fichero de topología: twenty.mtf • El fichero de la conformación extendida: twenty_extended.pdb • El fichero de restricciones: twenty_noe_all.tbl • Un fichero de parámetros que vienen con el programa. Estos ficheros tienen información sobre geometría de enlaces, angulos, etc. Para RMN de proteínas este fichero es protein-allhdg.param • Como salida el script genera una serie de ficheros PDB anneal_twenty_#.pdb (12 en nuestro caso) con estructuras. En la cabecera de cada PDB hay información sobre cada estructura: RMSDs, violaciones de restricciones y geometrías, energía, etc. • La sintaxis es: cns_solve < anneal.inp > anneal.out [Entrar]

13. 5º paso: Validación de estructuras. • CNS tiene scripts de validación que permiten determinar del conjunto de estructuras calculadas cuáles satisfacen unos criterios mínimos de validez. • Los criterios son seleccionables y suelen incluir: • Energía total. • Número de violaciones de la geometría de los enlaces. • Número de violaciones de las restricciones. • Número de ángulos diedros o impropios que no cumplen con los estándares. • En nuestro caso el script es accept.inp. Copiarlo en el directorio de trabajo y ejecutar: cns_solve < accept.inp > accept.out • Como entrada utiliza los ficheros de topología y geometría molecular y los 12 PDBs del conjunto de estructuras. • Como salida produce los ficheros PDB con las estructuras “aceptadas”: anneal_twenty_a_#.pdb y un PDB con la estructura promedio minimizada en energía: anneal_twenty_a_accepted_min_ave.pdb. En la cabecera del PDB da un resumen con los parámetros de calidad de la estructura.

14. El “ensemble” de conformaciones de twenty Ensemble de 24 estructuras calculadas tal y como las genera CNS. Se adivina cierta estructura en hélice, pero hay bastante variación entre la conformación de cada estructura del conjunto. Con cadenas laterales Sólo el esqueleto

15. El “ensemble” de conformaciones de twenty La gran variabilidad de estructuras puede ser solo aparente. Al alinear en el espacio las estructuras utilizando sólo las regiones que presentan conformación en hélice , se aprecia la similitud. La variabilidad de conformaciones en los extremos refleja muy posiblemente el desorden en esas zonas

16. La estructura promedio minimizada Cluster de residuos hidrofóbicos Zona de hélice 

17. La tabla de estadísticas de estructura Estadísticas de las 24 estructuras de twenty Restricciones: Nº NOEs 236 intraresiduo 135 Secuencial (i-j  4) 101 Larga distancia (i-j > 4) 0 Violaciones Nº de violaciones RMSD Distancias enlace : 0 0.0022 +/- 0.00053 Angulos de enlace : 0.08 +/- 0.282 0.5142 +/- 0.0603 Angulos impropios : 0 0.2853 +/- 0.1010 Van der Waals : 1.00 +/- 0.659 Angulos dihedros : 17.08 +/- 2.603 31.513 +/- 1.8129 NOEs: 0 0.0229 +/- 0.0069 RMSD esqueleto: 3.660 +/- 1.2650 RMSD átomos pesados 5.050 +/- 1.3888