生化技术实验
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生化技术实验 --- 实验十一. 《 生化技术实验 》. 实验 十 离子交换柱层析法分离氨基酸 实验室 112 ,指导老师:吴元喜 E-mail:[email protected] Tel: 62253310. 实验 十 离子交换柱层析法分离氨基酸. 一、实验 目的和要求 二、离子交换柱层析的 基本原理 三、实验 器材与试剂 四、离子交换柱层析的 操作技术 五、实验 结果与讨论 六、 思考题. 一、实验 目的和要求. 1 、 了解离子交换层析法分离氨基酸的基本原理 2 、掌握阳离子交换树脂柱层析分离氨基酸的操作方法

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生化技术实验 --- 实验十一

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生化技术实验---实验十一

《生化技术实验》

实验 十

离子交换柱层析法分离氨基酸

实验室112,指导老师:吴元喜

E-mail:[email protected]

Tel: 62253310


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实验 十 离子交换柱层析法分离氨基酸

一、实验目的和要求

二、离子交换柱层析的基本原理

三、实验器材与试剂

四、离子交换柱层析的操作技术

五、实验结果与讨论

六、思考题


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一、实验目的和要求

1、 了解离子交换层析法分离氨基酸的基本原理

2、掌握阳离子交换树脂柱层析分离氨基酸的操作方法

3、本实验采用苯乙烯磺酸钠型树脂分离天冬氨酸、赖氨酸和组氨酸


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二、离子交换层析法的基本原理

1、离子交换剂的组成结构及其的特性

2、柱层析离子交换方式

3、离子交换剂的选择性


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1、离子交换剂的组成结构及其特性

  • 离子交换剂的组成单元

  • 聚苯乙烯磺酸型阳离子交换树脂的制备

  • 离子交换树脂的形状结构示意图


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离子交换剂的组成单元


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聚苯乙烯磺酸型阳离子交换树脂的制备


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聚苯乙烯磺酸型阳离子交换树脂

聚苯乙烯磺酸型阳离子交换树脂产品


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离子交换树脂的形状结构示意图


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2、柱层析离子交换方式

  • 离子交换的基本过程

    离子交换树脂的转型(示意图)

    离子交换树脂分离氨基酸(示意图)

  • 离子动态交换过程(动画)


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离子交换树脂的转型(示意图)


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离子交换树脂分离氨基酸(示意图)


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柱层析离子动态交换过程(动画)

动画按钮


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3、离子交换剂的选择性

(1)平衡常数

(2)选择性与离子的电荷及水合离子半径的关系

(3)离子浓度对选择性的影响

--平衡的移动遵循质量作用定律

(4)两性物质(氨基酸、蛋白质)的选择性


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(1)常数

若KBA值>1,即[RB]>[RA],

离子交换剂对B+的结合力要比对A+的大;

若KBA值=1,即[RB]=[RA],

离子交换剂对B+和A+的结合力相同;

若KBA值<1,即[RB]<[RA],

离子交换剂对B+的结合力要比对A+的小。

KBA值反映离子交换剂对不同离子的结合力或选择性,称KBA值选择系数


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一价离子:Li+<Na+<K+<Rb+<Cs+

二价离子:Mg2+<Ca2+<Sr2+<Ba2+

一价阴离子:F -<Cl-<Br-<I-

不同价阳离子:Na1+<Ca2+<Al3+<Ti4+

(2)选择性与离子的电荷及水合离子半径的关系

离子交换剂与各种水合离子的结合力是与离子的电荷量成正比,而与水合离子半径的平方成反比。


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(3)磺酸基树脂和季胺基树脂对各种离子的相对选择系数


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(4)两性物质(氨基酸 )的选择性

各种氨基酸分子的结构不同,在同一pH时与离子交换树脂的亲和力有差异,因此可依亲和力从小到大的顺序被洗脱液洗脱下来,达到分离的效果。


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4、离子交换树脂的交换容量

交换容量:

离子交换剂与溶液中离子或离子化合物进行交换的能力。

(mg/g或mmol/g、mg/ml或mmol/ml )

732阳离子交换树脂一级品为4.2 mmol/g干树脂

交换容量的测定:

强酸型与强碱型测定其解离盐的能力;

弱酸型与弱碱型测定其中和酸碱的能力。

影响交换容量的因素:

筛孔、离子强度、pH值 。


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(1)强酸型阳离子交换介质交换容量的测定法

取一定量的离子交换介质,去离子水溶胀,漂洗干净用1mol/L的NaOH处理,去离子水洗至中性,1mol/L的HCl处理,去离子水洗至中性。然后用1mol/L的NaCl洗脱,收集洗脱液,再通过已标定的NaOH滴定洗脱液中的氢离子浓度,计算出吸附氢离子的毫摩尔数量,除以离子交换介质的质量,即可得到交换容量。

计算公式如下:


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(2)强碱型阴离子交换介质交换容量的测定方法

取一定量的离子交换介质,去离子水溶胀,漂洗干净,用1mol/L的HCl处理,去离子水洗至中性,1mol/L的NaOH处理,去离子水洗至中性。然后用1mol/L的NaCl洗脱,收集洗脱液,再通过已标定的HCl滴定洗脱液中的氢氧根离子浓度,计算出吸附氢氧根离子的毫摩尔数量,除以离子交换介质的质量即可得到交换容量。

计算公式如下:


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(3)凝胶或纤维类弱碱性或弱酸性离子交换介质换容量的测定方法

取一定量的离子交换介质,漂洗干净,用1mol/L的NaCl处理,去离子水洗至中性,缓冲液平衡,用已知蛋白的浓度样品过柱吸附,直至柱内的介质吸附的量达到饱和。用一定浓度的NaCl或其他的洗脱剂洗脱,收集洗脱液,测定洗脱液中的蛋白质的浓度,按如下计算公式交换容量。


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三、实验器材与试剂

1、设备

2、玻璃器皿

3、试剂与材料

4、离子交换剂用量的计算


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1、主要设备 

①梯度混合器1台(储液瓶250-500ml)

②层析柱1支(ф13mm×H30-40mm)

③恒流泵1台

④部分收集器1台

⑤分光光度计(共用)

⑥电子天平(共用)

⑦电炉

柱层析设备设备图片


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柱层析设备

柱层析设备

梯度混合器

层析柱

部分收集器

可见光分光光度计

蠕动泵


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2、玻璃器皿

①试管50支及试管架

(ф10mm×H100mm)

②滴管2支

③玻璃棒ф3mm1支

④烧杯100ml×2, 500ml×2

⑤量筒100ml×1

⑥容量瓶250ml-500ml各1个

⑦硅胶管ф4mm×1000mm

⑧输液器夹子等

主要玻璃器皿图片


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3、试剂与材料

① 苯乙烯磺酸钠型树脂(强酸1×8,100-200目)

②2 mol/L盐酸溶液。 ③2 mol/L氢氧化钠溶液。

④标准氨基酸溶液:

Asp、Lys和His各配制成4mg/mL的0.1mol/L盐酸溶液。

⑤混合氨基酸溶液:

将上述Asp、Lys和His各溶液按1:3:10的比例混合。

⑥檬酸-氧氧化钠-盐酸缓冲液(pH5.8,Na+0.45mol/L)。

取柠檬酸14.25g、氢氢化钠9.3g和浓盐酸5.25mL溶于少量蒸馏水后,定容至500mL,冰箱保存。

⑦檬酸-氧氧化钠-盐酸缓冲液(pH5.8,Na+0.8mol/L)。

在pH5.8,钠离子浓度0.45mol/L的檬酸-氧氧化钠-盐酸缓冲液加入氯化钠0.35 mol/L。

⑧显色剂:

2g水合茚三酮溶于75mL乙二醇单甲醚中,加蒸馏水至100mL。

⑨50%乙醇水溶液。


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四、离子交换柱层析的操作技术

1、离子交换树脂的选择

2、离子交换树脂的预处理

3、层析柱的准备(层析系统安装图)

4、离子交换柱的灌装

5、样品上柱与洗脱

6、分析与鉴定


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1、离子交换树脂的选择

实践中阴离子交换剂的选择主要取决于被分离物质所带的电荷。

如果被分离物质带正电荷,则应选择阳离子交换剂;

如果被分离物质带负电荷,则应选择阴离子交换剂;

如果被分离物质为两性离子,则一般应根据其在稳定的pH范围内所带电荷来选择交换剂。


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离子交换剂的选择图


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不同离子型交换剂的选择

选用何种类型离子交换剂?

----取决于离子交换剂对诸反离子的结合力。为了提高交换容量,一般应选择结合力较小的反离子。据此,强阳性和强阴性离于交换剂应分别选择H型和OH型;弱酸性和弱碱性离子交换剂应分别选择Na型和Cl型。


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2、离子交换树脂的预处理和转型

目的:使离子交换剂带上所希望的离子或基团

①预处理:将干的树脂浸过夜或搅拌2小时,使其充分溶胀,强酸型阳离子树脂用4倍体积的2 mol/L的盐酸浸泡1小时或搅拌半小时,倾去清夜,蒸馏水洗至中性。 (强碱型阴离子树脂用氢氧化钠处理)

②转型:欲使阳离子交换剂转成钠型时,则需用NaOH处理;欲使其带铵离子时,则需用NH4OH或NH4C1处理。作法同上,最后用蒸馏水洗至中性待用。


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3、柱层析系统的组装


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4、离子交换柱的灌装

①将层析柱垂直装载支架上,将下端输液管夹紧;

②向柱中加入约1/3体积的0.9%NaCl溶液;

③将一细玻棒伸入柱内,靠近管内壁,顺着玻棒缓慢的向管内加入混匀的凝胶溶液;

④凝胶加至层析柱顶端约3cm时,打开柱下端输液开关,使流速控制在0.25-0.5ml/cm2·nim。

④连续而缓慢的加凝胶直到稳定在离管口约5cm处。

本实验柱床高16~20厘米的层析柱。 (防止空气进入凝胶床)

动画加样过程


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5、样品上柱及洗脱

①加样量的控制

   分析:1-2ml/100ml床体积,

   制备:10-30ml/100ml床体积

②洗脱液的选择与梯度洗脱

③柱层析加样操作示意图

④离子交换柱层析实物连接


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②洗脱液的选择与梯度洗脱

  • 缓冲液pH的选择

  • 缓冲液离子组成的选择

  • 缓冲液离子强度的选择

    本实验采用檬酸缓冲液

    (pH5.8,Na+0.45---0.9mol/L)


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缓冲液pH的选择

起始缓冲液能使样品中有效成分与离子交换剂结合,洗脱液能使有效成分从离子交换剂上解离下来。

选用阴离子交换剂时,PH值一般比有效成分的pI高一个单位,选用阳离子交换剂时,PH值一般比有效成分的pI低一个单位,

选择缓冲液的离子强度和PH值,也可使有效成分与离子交换剂结合得不牢固,而杂质与离子交换剂结合得牢固。


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缓冲液离子组成的选择

  • 缓冲液离子的pK值要接近所用的pH,

  • 采用阳离子交换剂应选用阴离子缓冲液,

  •   如:磷酸盐、醋酸盐、柠檬酸盐

  • 采用阴离子交换剂应选用阳离子缓冲液,

  •   如:Tris

  • 缓冲液离子不影响被分离物的活性、溶解度、测定过程。


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缓冲液离子强度的选择

起始缓冲液能使样品中有效成分与离子交换剂结合,一般小于0.1mol/L。

洗脱液能使有效成分从离子交换剂上解离下来,一般0.15mol/L(或采用pH洗脱)。

梯度溶液制备装置及形成的梯度变化(图)

线性和阶梯式梯度溶液分离牛血清白蛋白的图谱


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产生梯度溶液的三种装置及形成的梯度变化

C = CB -(CB - CA)(1 - V2/V1)B1/A1

CA 、CB =梯度混合器A瓶、 B瓶的浓度;

A1 、B1 =A瓶、B瓶的横切面积;

V2=流经层析柱的体积,V1=梯度洗脱液的总体积。


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线性和阶梯式梯度溶液分离牛血清白蛋白的图谱


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离子交换装置连接示意图


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③平衡

①用低离子强度的初始缓冲液平衡离子交换柱,本实验用PH5.8的柠檬酸缓冲液平衡交换柱。

②节流速为0.5mL/min,流出液达床体积的四倍时即可上样。


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④柱层析加样操作示意图

1、平衡好的层析柱。

2、沿管壁将样品溶液小心加到床面上,应避免将床面冲起(本实验加入AA混合液0.25~0.5mL)。

3-4、打开下口夹子,使样品溶液流入柱内,同时收集流出液,

5-7、当样品溶液流至与胶面相切时,夹紧下口夹子。按加样操作,用1mL洗脱液冲洗管壁2次。

8-9、最后加入3—4mL洗脱液于凝胶上。

10、连接柱层析系统,自动收集记录。


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⑤氨基酸的洗脱

在梯度混合器的A/B池中分别加入低离子强度缓冲液(0.45M)和高离子强度缓冲液(0.9M);

将层析柱与梯度混合器、部分收集器相连,开始用试管收集洗脱液,每管收集1mL,共收集80管左右。


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6、分析与鉴定

①向收集管(单号)中加1mL水合茚三酮显色剂并混匀,在沸水浴中准确加热15min后冷却至室温,再加1.5mL的50%乙醇溶液。放置10min。以收集液第二管为空白。

②测定570nm波长的光吸收值。以光吸收值为纵坐标,以洗脱体积为横坐标绘制洗脱曲线。

③根据绘制洗脱曲线,取紧靠洗脱峰尖未显色的收集液,进行纸层析,根据标准氨基酸的层析位置判断洗脱曲线中各种氨基酸的洗脱顺序,确定三个峰为何种氨基酸。


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五、实验结果与讨论

1、绘制氨基酸的洗脱曲线

2、判断各洗脱峰为何种氨基酸

3、离子交换技术的实际意义


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六、思考题

1、离子交换剂有那几部分组成?何为阳离子和阴离子交换剂?转型及再生的含义?

2、梯度缓冲液液如何配制?直线形、凹形和凸形的梯度曲线是怎么形成的?

3、在离子交换层析中,若以0.1~0.5mol/ml NaCl为梯度的Tris-HCl缓冲液作洗脱液(总体积200ml),求此液通过层析柱75ml时,NaCl浓度是多少?

4、试设计利用离子交换剂分离一种含等电点分别为4.0、6.0、7.5和9.0的蛋白质混合液的方案,并简述理由。


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